李　鑫，胡世弟(綜述)，戴如春(審校)

(1.中南大學湘雅二醫(yī)院代謝內分泌研究所，長沙 410011； 2.湘潭市第二人民醫(yī)院內分泌科，湖南 湘潭 411100)

外周血間充質干細胞在骨代謝中的應用研究進展

李鑫1,2△，胡世弟1△(綜述)，戴如春1※(審校)

(1.中南大學湘雅二醫(yī)院代謝內分泌研究所，長沙 410011； 2.湘潭市第二人民醫(yī)院內分泌科，湖南 湘潭 411100)

正常成熟骨的代謝主要以骨重建形式進行，在調節(jié)激素和局部細胞因子等的協(xié)調作用下，骨組織舊骨被吸收，新骨生成，此過程主要由破骨細胞和成骨細胞完成，兩者是骨代謝過程中的重要核心細胞。成骨細胞由間充質干細胞分化產生。間充質干細胞是來源于中胚層具有多向分化潛能的干細胞，主要存在于全身結締組織和器官間質中，可以在體外擴增。一定條件下，可以誘導分化為骨、軟骨、韌帶、肌腱、肌肉、脂肪等組織細胞[1]。間充質干細胞大部分定居于骨髓，但也可出現(xiàn)于外周血中[2]。外周血是一個很容易獲取成體干細胞作為基礎研究和臨床應用的資源。抽取骨代謝疾病患者外周血標本進行實驗室檢查，對人體創(chuàng)傷小，通過檢測其中間充質干細胞生物學特征，有利于疾病的早期診斷、治療及預防。現(xiàn)就其在骨代謝中的應用研究進展予以綜述。

1外周血間充質干細胞的存在

1.1外周血間充質干細胞存在的依據(jù)現(xiàn)在越來越多的證據(jù)證明，有成骨分化潛能的干細胞不僅存在于骨髓，也可出現(xiàn)于外周血中。Zvaifler等[2]研究發(fā)現(xiàn)，在人類外周血單個核細胞中，存在一部分細胞經培養(yǎng)后，有可塑性，附壁生長，表達間充質干細胞的特性，能分化為成纖維細胞、成骨細胞、脂肪細胞等不同組織。Kuznetsov等[3]將外周血單個核細胞擴增后移植至免疫功能不全的小鼠皮下組織中，通過特殊的探針技術，發(fā)現(xiàn)該部位分化出大量的骨細胞，證實哺乳動物的外周血中確實存在有成骨分化潛能的干細胞。Otsuru等[4]將綠色熒光蛋白標記的骨祖細胞植入自身骨髓系統(tǒng)已遭放射線破壞的大鼠體內后，在最新的骨生成部位發(fā)現(xiàn)有帶綠色熒光蛋白標記的成骨細胞，從而證實骨祖細胞是經外周血液循環(huán)達到其他部位。近期，Zhang和Huang[5]總結提出外周血單個核細胞中包含大量能分化成不同種類的祖細胞，在合適條件下，能分化成血細胞、內皮細胞、肝細胞、心肌細胞、平滑肌細胞、成骨細胞、破骨細胞、上皮細胞等。

1.2外周血間充質干細胞的量或濃度Kuznetsov等[3]分別從小鼠、兔子、豚鼠、人類的外周血中獲得有成骨分化潛能的貼壁生長細胞，這些細胞的量十分稀少，小鼠和豚鼠中包含1×10-6,兔子中為1×10-7，人類為1×10-8,甚至更少。Zvaifler 等[2]使用細胞洗滌法在人類外周血中分離出小的、圓形的單個核細胞，經體外培養(yǎng)后形成成纖維樣細胞，該類細胞有分化為成骨細胞和脂肪細胞的潛能，在外周血單個核細胞中的濃度為0.3%～0.7%。Eghbali-Fatourechi等[6]用骨鈣素抗體標記外周血單個核細胞，利用流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)其中表達骨鈣素陽性細胞的比例為0.5%～0.8%，這與Zvaifler等[2]的研究數(shù)據(jù)是一致的。

1.3外周血間充質干細胞體外分離外周血間充質干細胞體外分離常見的方法有以下兩種。①密度梯度離心結合貼壁生長法：根據(jù)血液中細胞成分的比重不同，采用淋巴細胞分離液將肝素化的外周血單個核細胞分離出來，再在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，通過更換培養(yǎng)液方式除去懸浮細胞，可獲得純度達95%的間充質干細胞，此方法目前常應用于實驗室研究中。②利用間充質干細胞表面標記分離細胞：主要有流式細胞儀分離法和免疫磁珠分選法。前者利用相應的熒光素標記抗體進行篩選，后者是通過間充質干細胞表面帶有的抗原成分或缺失的抗原成分進行正選或負選，從而分離細胞。由于間充質干細胞特殊的生物學特性以及其含量很低，而且抗原表面不特異，當前用此方法分離純化可行性不高[7]。

1.4外周血間充質干細胞鑒定間充質干細胞的分化可能是隨機非方向性的。已經分化的間充質干細胞依舊具有轉化生成其他類型間充質細胞的潛能。個體不同發(fā)育階段的間充質干細胞的表型存在差異[8]。迄今為止對于間充質干細胞鑒定沒有特異的分子標記，這方面有待進一步深入研究。目前普遍認為，間充質干細胞表達CD29、CD73、CD90、CD105、CD44和 CD166[9-11]。主要結合其形態(tài)特征、表面標記及其具有向骨、脂肪、軟骨等多種方向的分化潛能而進行鑒定[12]。

2外周血間充質干細胞的性質及功能

人類外周血間充質干細胞的濃度在一定年齡段內，隨著年齡增加而增長。Eghbali-Fatourechi等[6,13]通過流式細胞學檢查、反轉錄聚合酶鏈反應等技術手段檢測證實了該觀點，其在2005年通過對比青春發(fā)育期男性及正常成年男性兩組人群，就已提到青春發(fā)育期男性在生長高峰期，外周血中表達骨鈣素陽性細胞的濃度是持續(xù)增加的。Dalle等[14]發(fā)現(xiàn)，骨質疏松患者外周血間充質干細胞數(shù)量也是增加的，只是它們經歷了異常的骨分化。最近，F(xiàn)u等[15]通過染色體組型分析、抵抗H2O2誘導的細胞凋亡等實驗比較外周血間充質干細胞與骨髓間充質干細胞，發(fā)現(xiàn)它們的生物學特征是一致的。Undale 等[16]通過比較絕經后女性外周血中和骨髓中的間充質干細胞也得出了該結論。然而，間充質干細胞是怎樣到達外周血液參與骨重建的？早在2001年Hauge等[17]建立的血管骨重建單元學說有助于解釋此疑問。該學說提到，骨重建單元中含有毛細血管，有分化為成骨潛能的細胞(包括骨髓間充質干細胞、骨髓非附壁成骨前體細胞、血管壁中表達CD34陽性的祖細胞分化成的外膜細胞、普通的內皮祖細胞)不是直接在骨髓腔中分化成形到達皮質骨，而是進入毛細血管輸入端，部分在血管中分化形成成骨細胞黏附于皮質骨參入骨重建，部分從毛細血管輸出端離開。在骨質疏松患者中[14]，由于骨轉換增加，動員至外周血的成骨祖細胞也是增加的，但是這些細胞由于基因表達異常，不能分化為正常有功能的成熟骨細胞。間充質干細胞分化為成骨細胞的數(shù)量減少，但分化為脂肪細胞的數(shù)量增加，提示脂肪細胞分化增加可能是以減少成骨分化為代價的。所以，外周血間充質干細胞異常分化導致骨重建異常是引起骨量丟失的一個重要發(fā)病機制。

3外周血間充質干細胞可能存在的臨床應用

3.1輔助早期診斷骨代謝疾病Dalle等[14]選取正常和骨質疏松兩類人群作為研究對象，從外周血中分離培養(yǎng)間充質干細胞，將形成的成纖維細胞集落形成單位作為評價指標，同時分別完善兩組人群的腰椎骨密度，發(fā)現(xiàn)骨質疏松患者成纖維細胞集落形成單位較正常人多，提示骨質疏松患者外周血間充質干細胞的量與骨密度呈反比。因此，檢測外周血間充質干細胞量可能作為一種非侵襲性方法輔助早期診斷骨代謝病。

3.2治療骨代謝疾病從外周血中獲取間充質干細胞簡便易行、創(chuàng)傷小、易于分離培養(yǎng)，增殖能力強，可體外克隆擴增，回輸入體內治療骨代謝疾病。Tadokoro等[18]采用同種異體間充質干細胞靜脈輸注治療低磷酸酶癥患者取得了成功。骨髓來源于患兒的父親，取出新鮮骨髓體外培養(yǎng)，并用不同的培養(yǎng)方法促進間充質干細胞增殖，再將其靜脈輸注入患兒體內，獲得了較好的療效。Toupadakis等[19]在兩組小鼠股骨骨折模型中，一組經皮下注射一種趨化因子4受體抗體——AMD3100，動員骨髓干細胞移至外周血液，另一組注射生理鹽水作為對照。3個月后，分別檢測兩組小鼠中外周血間充質干細胞的含量，同時使用計算機斷層掃描骨折部位，結果發(fā)現(xiàn)注射AMD3100的小鼠外周血液中間充質干細胞含量較多，且骨折部位骨密度明顯增加。最近一項5年的隨訪研究發(fā)現(xiàn)，在股骨頭壞死患者的早期階段，經股動脈注入自體間充質干細胞，有助于緩解疼痛，提高髖關節(jié)功能，延遲股骨頭壞死的進展[20]。

3.3結合傳統(tǒng)骨代謝指標監(jiān)測藥物療效Suriyachand等[21]選取43例年齡為25～90歲的人群，分為<60歲、60～79歲、≥80歲三個不同年齡組，分別用骨鈣素抗體標記外周血單個核細胞，利用流式細胞儀分析，同時選?、裥湍z原交聯(lián)C端肽、Ⅰ型前膠原N端肽及骨鈣素三個骨代謝評價指標，結果發(fā)現(xiàn)年齡≥80歲組外周血成骨祖細胞百分比與成骨代謝指標呈正比。Rubin等[22]在甲狀旁腺功能減退的患者中，通過調節(jié)甲狀旁腺激素的劑量，促進外周血成骨祖細胞增加，發(fā)現(xiàn)成骨祖細胞數(shù)量增加與髖骨中成骨功能指標變化一致?；诖讼嚓P性，可利用外周血間充質干細胞來預測成骨細胞的活性，用于臨床骨代謝疾病藥物跟蹤治療的療效評價。

3.4通過判斷成骨分化潛能預防骨代謝疾病Valenti等[23]通過分析外周血間充質干細胞分化過程中的基因表達，證實該類細胞能分化為成骨細胞。鑒于此特點，未來可以檢測間充質干細胞向成骨細胞分化過程中某特征基因的表達而了解成骨分化潛能。根據(jù)Smiler等[24]研究，可通過流式細胞儀檢測干細胞表面分別代表破骨和成骨分化的分子標記，比骨代謝生化指標更早地了解骨轉換傾向，早期判斷骨質量改變程度，盡早選擇藥物干預，預防骨質疏松等骨代謝疾病。

4小結

應用外周血間充質干細胞，不僅可能建立臨床可用的骨代謝疾病的最新檢測手段和方法，而且能早期診斷、治療、預防代謝性骨病。但在判斷骨分化過程中，由于代表破骨和成骨分化潛能的分子標志物特異性不高，可能需要多分子標志聯(lián)合檢測，提高其精確性，有待進一步深入研究。此外，外周血間充質干細胞在正常的骨重建、骨折愈合等過程中所扮演的精確角色仍不能完全肯定，需要進一步探索。同時，間充質干細胞的許多生物學特征和多分化潛能的分子機制尚不完全明確，還需不斷探究，進一步掌握它們的分化能力、可移植性和生物安全性。

參考文獻

[1]Wang X,Wang Y,Gou W,etal.Role of mesenchymal stem cells in bone regeneration and fracture repair:a review[J].Int Orthop,2013,37(12):2491-2498.

[2]Zvaifler NJ,Marinova-Mutafchieva L,Adams G,etal.Mesenchymal precursor cells in the blood of normal individuals[J].Arthritis Res,2000,2(6):477-488.

[3]Kuznetsov SA,Mankani MH,Gronthos S,etal.Circulating skeletal stem cells[J].J Cell Biol,2001,153(5):1133-1140.

[4]Otsuru S,Tamai K,Yamazaki T,etal.Bone marrow-derived osteoblast progenitor cells in circulating blood contribute to ectopic bone formation in mice[J].Biochem Biophys Res Commun,2007,354(2):453-458.

[5]Zhang M,Huang B.The multi-differentiation potential of peripheral blood mononuclear cells[J].Stem Cell Res Ther,2012,3(6):48.

[6]Eghbali-Fatourechi GZ,Lamsam J,Fraser D,etal.Circulating osteoblast-lineage cells in humans[J].N Engl J Med,2005,352Z(19):1959-1966.

[7]Xu S,De Becker A,Van Camp B,etal.An improved harvest and in vitro expansion protocol for murine bone marrow-derived mesenchymal stem cells[J].J Biomed Biotechnol,2010,2010:105940.

[8]Foster LJ,Zeemann PA,Li C,etal.Differential expression profiling of membrane proteins by quantitative proteomics in a human mesenchymal stem cell line undergoing osteoblast differentiation[J].Stem Cells,2005,23(9):1367-1377.

[9]Lyahyai J,Mediano DR,Ranera B,etal.Isolation and characterization of ovine mesenchymal stem cells derived from peripheral blood[J].BMC Vet Res,2012,8:169.

[10]Chong PP,Selvaratnam L,Abbas AA,etal.Human peripheral blood derived mesenchymal stem cells demonstrate similar characteristics and chondrogenic differentiation potential to bone marrow derived mesenchymal stem cells[J].J Orthop Res,2012,30(4):634-642.

[11]Spaas JH,De Schauwer C,Cornillie P,etal.Culture and characterisation of equine peripheral blood mesenchymal stromal cells[J].Vet J,2013,195(1):107-113.

[12]Sensebe L,Krampera M,Schrezenmeier H,etal.Mesenchymal stem cells for clinical application[J].Vox Sang,2010,98(2):93-107.

[13]Eghbali-Fatourechi GZ,Modder UI,Charatcharoenwitthaya N,etal.Characterization of circulating osteoblast lineage cells in humans[J].Bone,2007,40(5):1370-1377.

[14]Dalle CL,Valenti MT,Zanatta M,etal.Circulating mesenchymal stem cells with abnormal osteogenic differentiation in patients with osteoporosis[J].Arthritis Rheum,2009,60(11):3356-3365.

[15]Fu WL,Zhang JY,Fu X,etal.Comparative study of the biological characteristics of mesenchymal stem cells from bone marrow and peripheral blood of rats[J].Tissue Eng Part A,2012,18(17/18):1793-1803.

[16]Undale A,Srinivasan B,Drake M,etal.Circulating osteogenic cells:characterization and relationship to rates of bone loss in postmenopausal women[J].Bone,2010,47(1):83-92.

[17]Hauge EM,Qvesel D,Eriksen EF,etal.Cancellous bone remodeling occurs in specialized compartments lined by cells expressing osteoblastic markers[J].J Bone Miner Res,2001,16(9):1575-1582.

[18]Tadokoro M,Machida H,Ohgushi H.Genetic basis for skeletal disease.Stem cell therapy for genetic bone disorders[J].Clin Calcium,2010,20(8):1228-1235.

[19]Toupadakis CA,Granick JL,Sagy M,etal.Mobilization of endogenous stem cell populations enhances fracture healing in a murine femoral fracture model[J].Cytotherapy,2013,15(9):1136-1147.

[20]Mao Q,Jin H,Liao F,etal.The efficacy of targeted intraarterial delivery of concentrated autologous bone marrow containing mononuclear cells in the treatment of osteonecrosis of the femoral head:a five year follow-up study[J].Bone,2013,57(2):509-516.

[21]Suriyachand K,Eamwijit T,Paisooksantivatana K,etal.A study of correlation of osteoblasts from peripheral blood with related bone turnover markers[J].J Med Assoc Thai,2011,94 Suppl 5:S71-75.

[22]Rubin MR,Manavalan JS,Dempster DW,etal.Parathyroid hormone stimulates circulating osteogenic cells in hypoparathyroi-dism[J].J Clin Endocrinol Metab,2011,96(1):176-186.

[23]Valenti MT,Dalle CL,Donatelli L,etal.Gene expression analysis in osteoblastic differentiation from peripheral blood mesenchymal stem cells[J].Bone,2008,43(6):1084-1092.

[24]Smiler D,Soltan M,Albitar M.Toward the identification of mesenchymal stem cells in bone marrow and peripheral blood for bone regeneration[J].Implant Dent,2008,17(3):236-247.

摘要：外周血間充質干細胞是從外周血液中分離得到的一種成體干細胞，性質與骨髓間充質干細胞性質一致，異常分化引起骨代謝平衡改變導致骨量丟失。外周血間充質干細胞能即時動態(tài)地反映正在進行的骨重建狀況，對代謝性骨病的早期診斷、預測骨丟失和監(jiān)測藥物療效等均具有重要的臨床意義，在骨代謝疾病的應用中前景廣泛。但是，目前仍有許多關于間充質干細胞的疑問，包括其在骨重建、骨折愈合中的具體作用機制等還需進一步探究。

關鍵詞：間充質干細胞；外周血；骨代謝；臨床應用

Research Progress of Application of Peripheral Blood Derived Mesenchymal Stem Cells in Bone MetabolismLIXin1,2,HUShi-di1,DAIRu-chun1.(1.DepartmentofEndocrinologyandMetabolism,theSecondXiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha410011,China; 2.DepartmentofEndocrinologyandMetabolism,XiangtanCitySecondPeople′sHospital,Xiangtan411100,China)

Abstract：Peripheral blood mesenchymal stem cells(PBMSCs) is a kind of adult stem cells.Its character is similar to bone marrow mesenchymal stem cells,and the change of bone metabolism caused by PBMSCs abnormal differentiation leads to bone loss.PBMSCs can reflect the status of bone remodeling timely,dynamically,which has important clinical significance for early diagnosis of metabolic bone diseases,prediction of bone loss,monitoring drug efficacy,and has a wide prospect in the clinical application of bone metabolism diseases.But there are still many questions about mesenchymal stem cells,which include the mechanisms in bone remodeling and fracture healing,therefore further research is still needed.

Key words：Mesenchymal stem cells; Peripheral blood; Bone metabolism; Clinical application

收稿日期：2014-09-22修回日期：2014-12-01編輯：伊姍

基金項目：國家自然科學基金(81270960，81070695)；教育部“新世紀優(yōu)秀人才支持計劃”(NCET-11-0507)；中南大學中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金(2014zzts359)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.15.003

中圖分類號：R318；R589.5

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)15-2694-03