余科科(綜述)，汪思應(yīng)(審校)

(1.上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院生物樣本庫，上海 200030； 2.安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，合肥 230032)

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轉(zhuǎn)基因小鼠在生命科學(xué)中的研究進展

余科科1,2(綜述)，汪思應(yīng)2※(審校)

(1.上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院生物樣本庫，上海 200030； 2.安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，合肥 230032)

摘要：基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展，使得利用轉(zhuǎn)基因小鼠動物模型從生物整體上研究基因組的功能得以實現(xiàn)，并且其應(yīng)用領(lǐng)域越來越廣泛。將與疾病相關(guān)目的基因插入到與人類基因組高度同源的小鼠基因序列中構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠模型為研究人類疾病的分子機制提供了強有力的工具。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)由于技術(shù)受限影響其應(yīng)用。近年來，新的轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)，如靶向轉(zhuǎn)基因、快速定點轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用為生命科學(xué)研究提供了更好的平臺，將促進其進一步發(fā)展。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因小鼠；動物實驗?zāi)Ｐ?；生命科學(xué)

利用動物模型開展生命科學(xué)研究是傳統(tǒng)有效的研究方法，轉(zhuǎn)基因動物模型的建立為生命科學(xué)研究帶來了巨大變化，已成為新興的、最有效的動物實驗?zāi)Ｐ椭弧＾D(zhuǎn)基因動物就是通過生物學(xué)方法將外源基因整合進受體動物基因組，外源基因隨著細胞分裂而增殖，并能穩(wěn)定地遺傳給后代，使動物表達特殊功能或表現(xiàn)特定的形態(tài)。基因組分析數(shù)據(jù)表明，小鼠與人類基因組高度同源，基因相似率達95%，發(fā)育過程及生理生化反應(yīng)基本相同，對環(huán)境和藥物的代謝改變也非常類似，因此，人類疾病相關(guān)動物模型多選擇小鼠來開展科學(xué)研究[1]。目前國內(nèi)外基因工程小鼠的制備已經(jīng)形成了技術(shù)平臺，在探討動物遺傳改良、器官移植、動物疾病模型、基因功能等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。本文就轉(zhuǎn)基因小鼠在生命科學(xué)中的研究進展進行綜述。

1轉(zhuǎn)基因小鼠動物模型的構(gòu)建方法

以往對基因的研究多是將特定外源基因?qū)朐嘶蛘婧思毎?，但單個細胞中的功能研究并不能代表活體中的作用，轉(zhuǎn)基因小鼠實驗動物模型就很好地克服了這個問題。整合入動物基因組的外源基因被稱為轉(zhuǎn)基因，通過分析該基因和轉(zhuǎn)基因動物的表型，揭示基因的功能。另外，由于小鼠的成本相對較低、孕期較短、繁育方便且擁有大量的近交系品系，使研究結(jié)果有較好的可比性，再加上成熟的基因工程改造技術(shù)手段，使得轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建比其他哺乳動物更省時省力[1]。這些都是研究人員多選擇小鼠制備實驗動物模型的原因。目前最常用的構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠的核心技術(shù)是顯微注射法，即將目的基因注入受精卵的雄原核，再將受精卵植入假孕小鼠體內(nèi)，使外源基因與受精卵DNA發(fā)生整合，隨著小鼠胚胎的生長發(fā)育，再以分子生物學(xué)方法從新小鼠中篩選出整合有導(dǎo)入基因的小鼠，進一步穩(wěn)定小鼠品系[2]。這一方法的優(yōu)勢在于：導(dǎo)入外源基因時不需載體、方法簡便、基因整合效率較高、轉(zhuǎn)基因容量可達100 kb且實驗周期短。缺點是技術(shù)操作難度較大且外源基因是以隨機插入的方式進入受體基因組即缺乏精確定位；其整合位點及拷貝數(shù)量無法人為控制，可出現(xiàn)多拷貝插入形成連環(huán)體；或因為插入位點受限，出現(xiàn)位置效應(yīng)如基因沉默、基因表達水平更改導(dǎo)致小鼠死亡。近年來隨著制備技術(shù)的發(fā)展，逐漸出現(xiàn)了其他方法，如精子載體法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法、受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、受精卵原核顯微注射法、電脈沖法、體細胞核移植法、胚胎干細胞介導(dǎo)、反轉(zhuǎn)錄病毒感染法等。并且從單一的顯微注射發(fā)展成為多種方法融合的技術(shù)體系。

自1987年Thomas等[3]根據(jù)同源重組的原理以干細胞介導(dǎo)進行的外源基因定點導(dǎo)入整合，稱為基因打靶技術(shù)；利用基因打靶技術(shù)定點滅活一個內(nèi)源基因，稱為基因剔除技術(shù)?；虼虬屑夹g(shù)是建立在基因同源重組技術(shù)和胚胎干細胞技術(shù)基礎(chǔ)上的一種分子生物學(xué)技術(shù)，能定向改變細胞或生物個體的遺傳信息。目前利用條件性基因打靶載體Cre/loxP重組酶系統(tǒng)，實現(xiàn)了動物模型形式多樣化，包括目的基因過表達、基因沉默、功能性互補DNA(cDNA)或報告基因插入，以及外源基因的時間特異性表達[4-5]。迄今已成功制作出多種人類疾病模式小鼠，如帕金森病、糖尿病等，成為研究人類相關(guān)疾病的重要模型。利用轉(zhuǎn)基因小鼠這一活體動物，研究特定基因的功能及轉(zhuǎn)錄調(diào)控，得出的結(jié)論也具有很高的“真實性”。

除顯微注射法和基因打靶技術(shù)外，轉(zhuǎn)基因小鼠的常用制備技術(shù)還有病毒轉(zhuǎn)染法、轉(zhuǎn)座子制作法和RNA干擾制作法等。其中病毒載體轉(zhuǎn)染的效率高且不受動物種屬限制，根據(jù)病毒載體不同還可以分為反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和以人類免疫缺陷病毒1為基礎(chǔ)構(gòu)件的新型病毒-慢病毒。

2生命科學(xué)研究中的應(yīng)用

如今，分子生物學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展和完善，越來越多的轉(zhuǎn)基因小鼠應(yīng)用于生命科學(xué)研究中。這其中多為建立實驗動物模型，即采用遺傳學(xué)方法在短期內(nèi)獲得與人類某種疾病相似的并能穩(wěn)定遺傳的特殊動物品系。應(yīng)用最多的為腫瘤疾病模型，即模擬人體環(huán)境而建立腫瘤疾病模型。第一只攜帶顯性致癌基因的轉(zhuǎn)基因小鼠模型被稱為“oncomice”[6]；另外，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)的x蛋白編碼基因(HBx)的轉(zhuǎn)基因小鼠由于表達HBx蛋白，能誘導(dǎo)小鼠發(fā)生肝癌[7]。與此同時，轉(zhuǎn)基因小鼠模型還可以作為臨床應(yīng)用前靶向治療的實驗平臺，即找出促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展為致死性病變的特定的基因或分子。現(xiàn)有研究證實，腫瘤是遺傳畸變積累的結(jié)果，包括基因融合、基因擴增、基因突變、表觀遺傳改變(甲基化)及大片段缺失等[8-10]。根據(jù)病理形態(tài)和臨床表現(xiàn)診斷的同一類腫瘤，從分子水平還可以分成許多分子亞型，根據(jù)不同的基因改變在臨床使用不同的靶向藥物治療[11-12]，真正實現(xiàn)腫瘤的個體化治療。轉(zhuǎn)基因小鼠模型對研究腫瘤基因特征、腫瘤抑制基因的表達與功能有重要作用。傳統(tǒng)的腫瘤模型多是通過化學(xué)致癌劑誘導(dǎo)、腫瘤組織移植等方法建立，近年來，已有多種轉(zhuǎn)基因小鼠模型用于腫瘤形成的研究。建立轉(zhuǎn)基因腫瘤小鼠模型的方法主要是：直接將含有癌基因的DNA注入胚胎干細胞，或?qū)⒁职┗驈呐咛ジ杉毎星贸笤僮⑷肱吲?。這些轉(zhuǎn)基因腫瘤小鼠模型能很好地模擬體內(nèi)的病理生理環(huán)境及腫瘤發(fā)展動態(tài)過程，因此對一些癌前病變也可以開展深入的研究。如發(fā)現(xiàn)癌前病變的相關(guān)致癌基因及抑癌基因并闡明相互之間作用的分子機制，以及評價細胞凋亡、分化、基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控等生理生化改變是研究各種腫瘤發(fā)生機制的有力手段。

近年來，腫瘤血管生成及腫瘤免疫調(diào)控理論成為當(dāng)今腫瘤研究領(lǐng)域的熱點，與此相關(guān)的調(diào)控基因的研究也越來越多。如過表達血管內(nèi)皮生長因子小鼠致皮膚癌[13]，直接或間接作用于血管生成相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵因子，如凝血酶敏感素2缺陷小鼠通過促進血管內(nèi)皮生長因子過表達致皮膚癌[14]。轉(zhuǎn)基因小鼠模型與人類疾病的相近性，為研究者準(zhǔn)確揭示人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機制，開展基因治療等提供了很好的依據(jù)。

隨著技術(shù)水平的發(fā)展和逐步成熟，轉(zhuǎn)基因小鼠動物模型的應(yīng)用范圍越來越廣，逐漸向著多領(lǐng)域、交叉學(xué)科方向發(fā)展，除腫瘤模型外，一些常見的多發(fā)病，如心血管疾病、代謝性疾病、自身免疫性疾病、遺傳性疾病、神經(jīng)精神性疾病也有轉(zhuǎn)基因動物模型[15-19]。如不同長度的HBV基因片段導(dǎo)入小鼠受精卵，建立多種HBV轉(zhuǎn)基因小鼠，已經(jīng)廣泛用于HBV復(fù)制、致病、致癌機制研究，深入探討免疫耐受發(fā)生、誘導(dǎo)和打破免疫耐受，為篩選細胞因子和抗HBV藥物、抗病毒生物制劑開發(fā)等多個領(lǐng)域。轉(zhuǎn)基因小鼠的應(yīng)用還體現(xiàn)在藥物毒理模型，如短期致癌實驗，藥物篩選及有效性和有害性評價，藥物蛋白的目標(biāo)性生產(chǎn)，評價具有遺傳毒性、非遺傳毒性、致癌性和非致癌性化學(xué)物質(zhì)[20]。利用轉(zhuǎn)基因小鼠模型，研究人員可以發(fā)現(xiàn)在致癌過程中特定基因的作用并分析化學(xué)物-基因的相互作用。采用轉(zhuǎn)基因動物進行短期致癌實驗，不僅增加實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性、降低假陽性和假陰性率和自發(fā)性腫瘤發(fā)病率等還可以對化合物致癌作用進行初步測試，也可為致癌性實驗提供補充信息[21-23]。

3展望

轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)雖然已經(jīng)應(yīng)用于腫瘤研究中，但其成功率還不是很高，常出現(xiàn)胚胎不能著床、流產(chǎn)及新生小鼠死亡等，這可能是因為外源基因的隨機插入影響其他重要基因的表達、插入的基因異常表達擾亂小鼠生長發(fā)育等[24]，給轉(zhuǎn)基因小鼠的應(yīng)用帶來了阻礙。但是，隨著可調(diào)控表達系統(tǒng)、基因定位剔除、熒光素酶標(biāo)記及活體檢測技術(shù)等的深入發(fā)展，進一步促進了轉(zhuǎn)基因小鼠在生命科學(xué)等多領(lǐng)域的研究。因此，轉(zhuǎn)基因小鼠作為生命科學(xué)研究的一個新體系將會得到越來越廣泛的應(yīng)用，減少不必要的動物浪費、節(jié)約時間和資金?；铙w研究基因表達及調(diào)控作用，克服了原來此領(lǐng)域研究的局限性和片面性。

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Research Progress of Transgenic Mice in Life Science

YUKe-ke1,2,WANGSi-ying2.

(1.Biobank,ShanghaiChestHospital,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200030,China; 2.DepartmentofPathophysiology,BasicMedicalCollege,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

Abstract:Life sciences,especially cancer research has brought great changes because of transgenic mice.The technical platform for preparation of genetically engineered mice has scaled up both at home and abroad.The technique of transgenic mice provides a powerful tool to study the molecular mechanisms of human disease because there is much genome homology between human and mouse. The application was limited due to some defects in traditional transgenic technology.In recent years, the new technologies such as gene targeting and rapid point of transgenic technology will provide a better platform for life science research and promote its further development.

Key words:Transgenic mice; Experimental animal model; Life science

收稿日期：2013-10-16修回日期：2014-06-09編輯：相丹峰

基金項目：安徽省級高校優(yōu)秀青年人才基金(2011SQRL059)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.01.009

中圖分類號：R33

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)01-0023-02