胡 文，尹艷艷，王玉嬋，吳陽(yáng)洋，何 燦，李維祖

(安徽醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，安徽合肥 230032)

隨著社會(huì)老齡化的加速，心腦血管疾病已經(jīng)成為危害人群健康的主要原因，發(fā)病率呈逐年增高的趨勢(shì)，尤以缺血性腦血管病最為常見(jiàn)［1］。目前，缺血性腦血管疾病具有患病率高、致殘率高、病死率高、治療費(fèi)用高等特點(diǎn)［2］，嚴(yán)重影響病人的健康和生活質(zhì)量，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。因此尋找治療缺血性腦血管病的有效藥物已經(jīng)成為藥理學(xué)科的重要課題。麝香醒腦滴丸(Shexiang Xingnao dropping pills，SXD)由傳統(tǒng)中藥精制而成，主要成分有麝香、川芎、冰片、水蛭、丹參等。研究表明，麝香、川芎、冰片具有醒腦開(kāi)竅的功效，水蛭、丹參等具有活血化瘀抑制血栓形成的功能，因此它們對(duì)缺血性腦損傷具有保護(hù)作用［3-4］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠局灶性腦缺血(MCAO)再灌注模型，研究麝香醒腦滴丸對(duì)局腦缺血的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠，雄性，268～310 g，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(皖)2011-002。大鼠自由進(jìn)食、飲水，飼養(yǎng)3 d適應(yīng)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥品與試劑 麝香醒腦滴丸(SXD)，安徽省華方醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào):20120601。麝香心腦通膠囊(SXJ)，吉林省輝南輝發(fā)制藥股份有限公司，批號(hào):20110901;紅四氮唑(2，3，5-三苯基氯化四氮唑，TTC)，中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品;水合三氯乙醛，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所產(chǎn)品;乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)定試劑盒、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒和考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒，全部由南京建成生物工程研究所提供;直徑0.235 mm魚(yú)線(xiàn)，日本PATU公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 FA1004型電子天平，上海天平儀器廠(chǎng)產(chǎn)品;GKC型可控硅恒溫水浴鍋，上海錦屏儀器儀表有限公司;SpectraMax 190型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)MD公司;WG-2003臺(tái)式干燥箱，惠陽(yáng)南方電氣實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠(chǎng);LG10-2.4A型超速離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠(chǎng)產(chǎn)品;LBY-NJ4血小板聚集儀，北京普利生儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 分組及給藥 取雄性SD大鼠，體重268～310 g，隨機(jī)分成 6組:模型組、假手術(shù)組，SXD(0.21、0.42、0.84 g·kg-1)3 個(gè)劑量組和 SXJ(0.42 g·kg-1)組。用藥組灌胃(ig)給藥，模型組和假手術(shù)組ig給等容量蒸餾水7 d。第7天給藥后1 h，采用線(xiàn)栓法阻塞大鼠大腦中動(dòng)脈2 h建立MCAO再灌注模型，再灌注8 h時(shí)重復(fù)給藥1次。

1.4.2 大鼠MCAO再灌注模型的建立 參照改進(jìn)的Longa等［5］方法建立大鼠MCAO再灌注模型。術(shù)后出現(xiàn)Horner氏征視為造模成功。假手術(shù)組只暴露頸內(nèi)外動(dòng)脈分叉，無(wú)需閉塞大腦中動(dòng)脈(MCA)。造模前后適宜溫度常規(guī)飼養(yǎng)。

1.4.3 考察SXD對(duì)MCAO再灌注大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分的影響 大鼠MCAO后2 h即再灌注0 h，以及再灌注4、8、22 h時(shí)，按照Bederson的方法對(duì)大鼠的神經(jīng)功能損傷進(jìn)行評(píng)分［6］。

1.4.4 考察SXD對(duì)MCAO再灌注大鼠腦梗死百分比的影響 大鼠MCAO再灌注22 h，將大鼠麻醉后固定，腹主動(dòng)脈取血后處死大鼠，快速斷頭取腦。將腦置于冰生理鹽水中，除去小腦、嗅球和低位腦干，稱(chēng)取腦濕重。將腦組織在-20℃條件下冷凍10 min，取出后用手術(shù)刀片將腦組織切成5片。然后將腦片放入含有1%的TTC的磷酸緩沖溶液中，37℃避光30 min，達(dá)15 min時(shí)翻到另外一面。經(jīng)染色后，腦組織梗死區(qū)顯白色，正常區(qū)域顯玫瑰紅色，界限分明。分離梗死區(qū)和非梗死區(qū)腦組織，稱(chēng)重，計(jì)算梗死百分比。

1.4.5 考察SXD對(duì)MCAO再灌注大鼠血小板聚集率的影響 大鼠MCAO再灌注22 h后，麻醉后固定大鼠，腹主動(dòng)脈取血，用3.8%枸椽酸鈉溶液(1∶9)抗凝，低速離心機(jī)1 000 r·min-1離心10 min，所取上清液為富血小板血漿(PRP)，余下部分3 000 r·min-1離心10 min，所取上清液為貧血小板血漿(PPP)，用PPP調(diào)整PRP吸光度值在300～400之間。取PRP 290 μL，37℃孵育5 min，加入誘導(dǎo)劑二磷酸腺苷(ADP)溶液10 μL，利用比濁法測(cè)定5 min血小板最大聚集率。

1.4.6 考察SXD對(duì)MCAO再灌注大鼠腦含水量和腦指數(shù)的影響 大鼠斷頭后快速取腦，用電子天平稱(chēng)取腦組織標(biāo)本濕重。按照公式:腦指數(shù)=腦濕重×100/體重計(jì)算腦指數(shù)。將腦組織放入恒溫干燥箱(105℃)烤24 h以上，稱(chēng)取腦組織干重，按公式:腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%計(jì)算腦含水量。

1.4.7 考察SXD對(duì)MCAO再灌注大鼠腦組織生化指標(biāo)的影響 取一批大鼠，MCAO 2 h再灌注22 h后斷頭處死大鼠，快速取腦后將其置于冰臺(tái)上切為兩部分，一部分固定后做病理組織學(xué)檢測(cè)。分離另外一部分腦皮質(zhì)，加入冰NS后在冰浴條件下制成10%的腦組織勻漿，將勻漿在4℃下離心(3 500 r·min-1)15 min，分離上清液后用試劑盒測(cè)定SOD和LDH活性，MDA含量，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量。

1.4.8 考察SXD對(duì)MCAO再灌注大鼠腦組織形態(tài)學(xué)的影響 將腦組織放入10%甲醛溶液中固定。石蠟包埋、切片后作HE染色，主要對(duì)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元部位進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，觀(guān)察資料均為計(jì)量資料，以(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。大鼠神經(jīng)功能評(píng)分為多時(shí)點(diǎn)重復(fù)測(cè)量資料，采用兩因素重復(fù)測(cè)量方差分析，以P＜0.05代表有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SXD對(duì)MCAO再灌注大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分的影響 各組結(jié)果如表1所示，該資料為5組4個(gè)時(shí)點(diǎn)重復(fù)測(cè)量資料，經(jīng)球形檢驗(yàn)后，進(jìn)行兩因素重復(fù)測(cè)量方差分析。發(fā)現(xiàn)組間和時(shí)間點(diǎn)之間交互作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。再行精細(xì)比較，再灌(0，4 h)結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。再灌8 h后SXJ和SXD(0.42，0.84 g·kg-1)組對(duì)大鼠神經(jīng)功能損傷有所減輕。再灌24 h后SXD(0.84 g·kg-1)組對(duì)神經(jīng)功能損傷評(píng)分有所降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 SXD對(duì)MCAO再灌注大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分的影響(±s，n=8)

表1 SXD對(duì)MCAO再灌注大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分的影響(±s，n=8)

注:與模型組比較:*P ＜0.05。

組別 劑量/g·kg-1再灌注0 h 再灌注4 h 再灌注8 h再灌注22 h模型組 —3.13 ±0.83 2.63 ±0.52 2.50 ±0.53 1.88 ±0.83 SXJ組 0.42 2.88 ±0.64 2.38 ±0.74 1.63 ±0.92*1.38 ±0.92 SXD 組 0.21 3.00 ±0.76 2.63 ±0.52 2.38 ±0.74 1.63 ±0.52 0.42 2.88 ±0.83 2.50 ±0.53 1.63 ±0.92*1.38 ±1.06 0.84 2.75 ±0.71 2.25 ±0.71 1.63 ±0.74*1.00 ±0.76*

2.2 SXD對(duì)MCAO再灌注大鼠腦梗死百分比的影響 與模型組比較，SXD(0.42，0.84 g·kg-1)和陽(yáng)性藥SXJ能夠減小MCAO再灌注22 h大鼠的腦梗死百分比。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 SXD對(duì)MCAO再灌注大鼠腦梗死百分比的影響(±s，n=8)

表2 SXD對(duì)MCAO再灌注大鼠腦梗死百分比的影響(±s，n=8)

注:與模型對(duì)照組比較:*P＜0.05。

組別 劑量/g·kg-1 腦梗死百分比/%模型組 —26.07 ±10.08 SXJ組 0.42 14.98 ±10.03*SXD 組 0.21 20.11 ±15.08 0.42 15.02 ±10.27*0.84 14.67 ±9.88*

2.3 SXD對(duì)MCAO再灌注大鼠血小板聚集率的影響 結(jié)果表明，模型組大鼠血小板聚集率相對(duì)于假手術(shù)組明顯增加，SXD(0.42，0.84 g·kg-1)組大鼠血小板聚集率相對(duì)于模型組比較有一定的降低。陽(yáng)性藥SXJ組大鼠血小板聚集率有降低趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 SXD對(duì)MCAO再灌注大鼠血小板聚集率的影響(±s，n=8)

表3 SXD對(duì)MCAO再灌注大鼠血小板聚集率的影響(±s，n=8)

注:與假手術(shù)組比較:△P ＜0.05;與模型組比較:*P ＜0.05。

組別 劑量/g·kg-1 血小板聚集率/%假手術(shù)組 —33.19 ±9.18模型組 — 46.13±10.78△SXJ組 0.42 36.42 ±9.37 SXD 組 0.21 38.11 ±10.03 0.42 36.33 ±9.06*0.84 35.14 ±9.24*

2.4 SXD對(duì)MCAO再灌注大鼠腦含水量和腦指數(shù)的影響 結(jié)果顯示，模型組腦含水量和腦指數(shù)明顯高于假手術(shù)組;SXD(0.42、0.84 g·kg-1)和陽(yáng)性藥SXJ對(duì)腦缺血再灌注22 h大鼠腦指數(shù)都低于模型組。SXD(0.84 g·kg-1)和陽(yáng)性藥SXJ組腦含水量低于模型組且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 SXD對(duì)MCAO再灌注大鼠腦含水量和腦指數(shù)的影響(±s，n=8)

表4 SXD對(duì)MCAO再灌注大鼠腦含水量和腦指數(shù)的影響(±s，n=8)

注:與假手術(shù)組比較:△△P＜0.01;與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組別 劑量/g·kg-1 腦含水量/%腦指數(shù)假手術(shù)組 —78.70 ±1.80 0.485 ±0.032模型組 — 81.84±0.96△△ 0.522±0.023△△SXJ組 0.42 80.53 ±1.28* 0.488 ±0.024＊＊SXD 組 0.21 80.88 ±1.36 0.507 ±0.021 0.42 80.61 ±0.90 0.494 ±0.026*0.84 79.93 ±0.75＊＊ 0.488 ±0.019＊＊

2.5 SXD對(duì)MCAO再灌注大鼠腦組織生化指標(biāo)的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織中SOD及LDH活性顯著降低，MDA含量顯著增加;與模型組比較，SXD(0.42、0.84 g·kg-1)和陽(yáng)性藥SXJ能夠提高M(jìn)CAO再灌注大鼠腦組織SOD活性，降低 MDA 含量;SXD(0.42、0.84 g·kg-1)和陽(yáng)性藥SXJ對(duì)LDH活性明顯提高，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 SXD對(duì)MCAO再灌注大鼠腦組織SOD、LDH、MDA的影響(±s，n=8)

表5 SXD對(duì)MCAO再灌注大鼠腦組織SOD、LDH、MDA的影響(±s，n=8)

注:與假手術(shù)組比較:△△P＜0.01;與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組別 劑量/g·kg-1 SOD(KU/gprot)LDH(KU/gprot)MDA(μmol/gprot)假手術(shù)組 —145.38 ±37.07 7.55 ±1.18 2.43 ±1.07模型組 — 96.56 ±22.25△△ 4.74 ±1.02△△ 4.83 ±1.44△△SXJ組 0.42 128.26 ±23.22* 5.89 ±0.90* 3.29 ±0.92*SXD 組 0.21 119.27 ±27.38 5.02 ±0.99 4.16 ±0.86 0.42 124.41 ±27.82＊＊ 5.67 ±1.15* 3.20 ±1.28＊＊0.84 134.58 ±24.15＊＊ 5.91 ±0.96＊＊ 3.03 ±1.05＊＊

2.6 SXD對(duì)MCAO再灌注大鼠腦組織形態(tài)學(xué)的影響 假手術(shù)組腦組織神經(jīng)元及細(xì)胞形態(tài)正常，核仁清晰，未觀(guān)察到神經(jīng)細(xì)胞變性壞死等明顯的病理變化。模型組腦組織細(xì)胞排列不規(guī)則，有一定程度的核固縮、核染色較深，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)模糊、較多胞體腫脹。SXD(0.42、0.84 g·kg-1)和 SXJ組腦組織軟化灶都有一定程度的減少，神經(jīng)元細(xì)胞核固縮程度明顯降低，僅有少量細(xì)胞出現(xiàn)腫脹，表明SXD和SXJ對(duì)MCAO再灌注大鼠腦組織損傷均具有一定的作用保護(hù)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

3 討論

缺血性腦血管病是一類(lèi)由腦血流供應(yīng)障礙導(dǎo)致的腦組織缺血、缺氧，是引發(fā)局灶性腦組織缺血性損傷或壞死的多發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變［7］。缺血性腦血管疾病的病理生理機(jī)制主要是由腦缺血再灌注損傷引起，首先需要建立穩(wěn)定、可靠的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。目前常用的造模方法為大腦中動(dòng)脈阻斷再灌注損傷模型，該模型具有操作簡(jiǎn)單、損害較小、死亡率較低等特點(diǎn)，基本模擬了缺血性腦血管疾病的病理生理狀態(tài)。

腦缺血后模型成功和MCAO再灌注損傷程度的評(píng)價(jià)主要是依據(jù)腦梗死百分比的測(cè)定和神經(jīng)功能學(xué)的評(píng)分［8］。本實(shí)驗(yàn)采用TTC染色法檢測(cè)腦缺血再灌注損傷后腦組織梗死狀況，采用Bederson的評(píng)分方法對(duì)MCAO再灌注0、4、8、22 h大鼠的神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SXD對(duì)MCAO再灌注后8 h和22 h神經(jīng)功能損傷評(píng)分有一定的降低作用，對(duì)MCAO再灌注22 h大鼠腦組織梗死百分比具有一定的減小作用;病理組織學(xué)結(jié)果也顯示SXD能明顯改善MCAO再灌注大鼠腦組織神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的形態(tài)變化。腦水腫是腦缺血再灌注損傷進(jìn)程中的一個(gè)顯著的變化，也是作為評(píng)價(jià)抗缺血性腦損傷藥物的重要指標(biāo)之一［9］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SXD可以減輕腦缺血再灌注22 h大鼠腦水腫程度，降低其腦含水量和腦指數(shù)。

目前認(rèn)為腦缺血再灌注損傷是由多種復(fù)雜因素相互作用而導(dǎo)致的結(jié)果，其中氧自由基脂質(zhì)過(guò)氧化損傷是腦缺血再灌注損傷的主要機(jī)制［10］。腦缺血再灌注后腦中氧自由基顯著增加，自由基連鎖反應(yīng)的激化可造成腦缺血損傷和遲發(fā)性神經(jīng)功能損害的加重［11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MCAO再灌注后腦組織中MDA含量顯著升高，SOD和LDH活性下降，表明MCAO再灌注后出現(xiàn)脂質(zhì)和氧自由基過(guò)氧化損傷。而SXD能降低缺血腦組織中MDA的含量，并提高SOD、LDH的活性，表明SXD能夠減輕氧自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，清除過(guò)氧自由基，減輕大鼠缺血性腦組織病變程度。另外，腦缺血時(shí)由于無(wú)氧糖酵解增加，導(dǎo)致生成大量自由基以及酸中毒，使血小板發(fā)生大量聚集繼而加速血栓的形成［12］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SXD能夠一定程度降低局灶性腦缺血大鼠血小板聚集率，表明其具有抑制血栓形成的作用。

綜上所述，SXD對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抗脂質(zhì)過(guò)氧化損傷、清除氧自由基，減少血小板聚集等因素有關(guān)。

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