許 俏，羅 俊，潘年松，劉英波，丁 斗，張學(xué)愈，張 玨

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院，上海 202150;2.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550004;3.遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，貴州遵義 563000)

據(jù)報(bào)道，90%的皮膚癌與紫外線照射損傷有關(guān)。近年來(lái)，由于臭氧層的破壞及人們的室外活動(dòng)增加，皮膚癌特別是鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病率明顯上升;但目前臨床治療皮膚癌的方法有限，尋找一種新的有效的防治皮膚癌的天然藥物就成為當(dāng)前亟待解決的課題之一。

1 材料

1.1 藥物 皮鱗癌1號(hào)方(SSP)由白頭翁、莪術(shù)等中藥組成(工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)見專利申請(qǐng)?zhí)?2013104223796.7)，試驗(yàn)品由遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校提供，每毫升相當(dāng)于生藥2 g，以白頭翁皂苷B4含量及浸膏收率作為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑 高糖的Dulbecco modified eagle medium(DMEM)、胎牛血清購(gòu)自 Hyclone公司，3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide(MTT)購(gòu)自Amresco公司。

1.3 細(xì)胞系 A431細(xì)胞購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A431細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、青霉素(100 U·L-1)和鏈霉素(100 U·L-1)的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中。

2.2 MTT法測(cè)皮鱗癌1號(hào)方對(duì)A431細(xì)胞的增殖抑制作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升1.25×105，每孔160 μL 接種于96 孔板。培養(yǎng)24 h后，每孔加40 μL不同濃度的藥物，藥物濃度設(shè)5個(gè)梯度，分別為原藥的1/400、1/200、1/100、1/50、1/25，因每毫升皮鱗癌1號(hào)方相當(dāng)于2 g生藥，經(jīng)換算后得到藥物劑量相當(dāng)于5(A2組)、10(A3組)、20(A4組)、40(A5 組)、80(A6組)mg·L-1，每個(gè)組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，每組加40 μL。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組(A0組，加200 μL無(wú)血清培養(yǎng)基)、陰性對(duì)照組(A1組，不加藥物)、陽(yáng)性對(duì)照組(A7組，5-Fu 10 mg·L-1)。分別培養(yǎng) 24、48、72 h 后，棄去上清，加 200 μL 無(wú)血清培養(yǎng)基及 20 μL MTT(5 g·L-1)，置于二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后，棄上清，加150 μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min后，于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm處測(cè)定吸光度值(OD值)。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD-空白對(duì)照組OD)/(陰性對(duì)照組OD-空白對(duì)照組OD)×100%。

2.3 Hochest33258染色法觀察細(xì)胞凋亡 藥物干預(yù)48 h后，棄去上清，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3遍，每次5 min。加入500 μL染色液，混勻，室溫放置30 min。棄去染色液，用PBS清洗3遍后，置于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的形態(tài)變化，激發(fā)波長(zhǎng)為346 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為460 nm。

2.4 ELISA測(cè)定細(xì)胞色素C(Cytc)含量 藥物干預(yù)48 h后，收集細(xì)胞，用裂解儀裂解。低溫離心20 min，3 000 r·min-1，取上清。細(xì)胞色素C檢測(cè)試劑盒(安迪生物科技有限公司)說(shuō)明操作。

2.5 比色法測(cè)定 Caspase-3、Caspase-9活性 藥物干預(yù)48 h后，吸取細(xì)胞培養(yǎng)液備用。用胰酶消化細(xì)胞，并收集至備用的細(xì)胞培養(yǎng)中。600 g 4℃離心5 min收集細(xì)胞后，小心清除上清。PBS洗滌一次，吸盡上清后，按每200萬(wàn)細(xì)胞加入100 μL裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15 min。4℃ 20 000 g離心15 min，把上清轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的離心管中。按Caspase-3、Caspase-9活性檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)說(shuō)明操作。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。觀測(cè)資料主要為定量數(shù)據(jù)，均通過(guò)正態(tài)性檢驗(yàn)，文中以(±s)描述之。多組多時(shí)點(diǎn)觀測(cè)資料則采用兩因素重復(fù)測(cè)量方差分析。所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，并以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

3 結(jié)果

3.1 形態(tài)學(xué)觀察 顯微鏡下觀察可見:陰性對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，呈多邊形或不規(guī)則形，折光性強(qiáng)。皮鱗癌1號(hào)方處理后，A431細(xì)胞增殖變緩，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，與周圍細(xì)胞黏附力減弱。隨著該藥物濃度增加，上述現(xiàn)象更加明顯。可見細(xì)胞大片脫落，細(xì)胞數(shù)明顯減少，胞質(zhì)內(nèi)黑色顆粒增多，可見死亡細(xì)胞。見圖1。

3.2 皮鱗癌1號(hào)方對(duì)A431細(xì)胞的存活影響(增殖抑制作用) 本實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測(cè)皮鱗癌1號(hào)方在不同劑量濃度和不同作用時(shí)間條件下對(duì)A431細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)(數(shù)據(jù)以存活率方式體現(xiàn))，見表1。對(duì)該表資料分別做兩因素重復(fù)測(cè)量方差分析:6個(gè)劑量組間(空白對(duì)照A0組為實(shí)驗(yàn)備份觀查組，未列入MTT法測(cè)試及其它觀測(cè)項(xiàng)目，故表1及其它各表中均無(wú)該組資料)，3個(gè)時(shí)點(diǎn)間，整體上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且劑量和時(shí)間的交互作用也有顯著性意義(P＜0.05)。遂進(jìn)行精細(xì)比較并結(jié)合數(shù)據(jù)來(lái)看:皮鱗癌1號(hào)方在不同濃度、不同作用時(shí)間對(duì)A431細(xì)胞增生存活率的影響(反映抑制作用)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且隨著藥物作用濃度增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，皮鱗癌1號(hào)方對(duì)A431細(xì)胞的增殖抑制率也逐漸增強(qiáng)，表現(xiàn)為存活率下降(P＜0.05)。說(shuō)明皮鱗癌1號(hào)方對(duì)A431細(xì)胞增殖具有顯著的抑制作用，且呈時(shí)間—?jiǎng)┝恳蕾囆浴?/p>

表1 對(duì)A431細(xì)胞的存活率影響分析(±s，n=5)

表1 對(duì)A431細(xì)胞的存活率影響分析(±s，n=5)

注:(1)此表資料為兩因素重復(fù)測(cè)量資料，數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)通過(guò);經(jīng)球型性檢驗(yàn)后，以H-F法進(jìn)行涉時(shí)間自由度調(diào)整;(2)整體分析方法為兩因素重復(fù)測(cè)量方差分析;整體分析的顯著性水準(zhǔn)α=0.05;(3)精細(xì)比較為t檢驗(yàn)(組間為成組檢驗(yàn)，時(shí)點(diǎn)間為差值檢驗(yàn));精細(xì)比較的顯著性水準(zhǔn)調(diào)整為α’=0.01。

A1組:陰性對(duì)照組A2組:5 mg·L-1 A3組:10 mg·L-1 A4組:20 mg·L-1 A5組:40 mg·L-1 A6組:80 mg·L-1 A7組:5-Fu T1:24 h 87.91 ±1.58 82.13 ±6.11 71.05 ±5.40 56.48 ±5.98 38.17 ±7.80 20.06 ±4.09 83.25 ±5.90 T2:48 h 96.46 ±1.83 73.69 ±3.42 62.22 ±4.34 47.20 ±9.76 26.34 ±3.48 8.46 ±1.97 74.57 ±5.44 T3:72 h 99.40 ±0.71 56.28 ±8.00 41.36 ±1.84 33.60 ±6.54 15.36 ±3.56 4.41 ±1.05 50.31 ±3.36整體分析F，P (HF系數(shù):0.6875)組間比較 272.812，0.000時(shí)點(diǎn)間比較 188.773，0.000組 × 時(shí)點(diǎn) 23.738，0.000組間比較t，P A1 vs A2 A1 vs A3 A1 vs A4 A1 vs A5 A1 vs A6—T1 2.128，0.066 6.741，0.000 11.40，0.000 13.94，0.000 34.81，0.000 —T2 13.203，0.000 16.470，0.000 11.16，0.000 40.21，0.000 73.58，0.000 —T3 11.923，0.000 66.005，0.000 22.20，0.000 51.40，0.000 167.87，0.000 —時(shí)點(diǎn)比較t，P A1 A2 A3 A4 A5 A6—T2 vs T1 11.073，0.000 3.760，0.020 3.085，0.037 1.948，0.123 4.028，0.016 8.508，0.001 —T3 vs T1 17.191，0.000 5.892，0.004 15.007，0.000 6.024，0.004 8.522，0.001 10.720，0.000—

3.3 Hochest33258染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài) 藥物作用48 h后，用Hochest33258染色。在熒光倒置顯微鏡下觀察，陰性對(duì)照組細(xì)胞均勻呈現(xiàn)微弱熒光，熒光完整，細(xì)胞核較大，染色質(zhì)分布均勻;用藥組細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)特征，細(xì)胞核呈較強(qiáng)藍(lán)色熒光，提示胞核固縮，大小不一，染色質(zhì)凝聚。見圖2。

3.4 細(xì)胞色素C含量測(cè)定 結(jié)果提示，藥物作用A431細(xì)胞48 h后，細(xì)胞色素C表達(dá)隨著藥物作用劑量的增加而增加，與陰性對(duì)照組比較，差別非常明顯，見表2。

3.5 比色法檢測(cè) Caspase-3、Caspase-9活力 結(jié)果提示，皮鱗癌1號(hào)方高、中、低劑量組與陰性對(duì)照組比較，Caspase-3、Caspase-9活力增加，且隨著藥物作用濃度增高，Caspase-3、Caspase-9活力增強(qiáng)，差別非常明顯，見表3。

表2 ELISA法測(cè)皮鱗癌1號(hào)方作用A431細(xì)胞48 h后細(xì)胞色素C表達(dá)(±s，n=3)

表2 ELISA法測(cè)皮鱗癌1號(hào)方作用A431細(xì)胞48 h后細(xì)胞色素C表達(dá)(±s，n=3)

組別 劑量/mg·L-1 細(xì)胞色素C/nmol·L -1陰性對(duì)照組 —12.36 ±2.58 SSP低劑量組 5 49.62±26.41 SSP 中劑量組 10 58.76±5.28 SSP 高劑量組 20 135.18±26.19 5-Fu組10 27.04 ±5.80

表3 比色法測(cè)Caspase-3、Caspase-9活性(±s，n=3)

表3 比色法測(cè)Caspase-3、Caspase-9活性(±s，n=3)

組別 劑量/mg·L-1 Caspase-3/mmol·L-1 Caspase-9/mmol·L -1陰性對(duì)照組 —17.13 ±0.80 7.30 ±0.67 SSP 低劑量組 5 19.47 ±1.72 9.18 ±1.22 SSP 中劑量組 10 22.10 ±1.05 12.90 ±1.08 SSP 高劑量組 20 20.67 ±0.72 10.66 ±0.88 5-Fu組10 17.47 ±0.86 8.61 ±0.50

4 討論

腫瘤是一種細(xì)胞周期性疾病，與細(xì)胞的無(wú)限增殖及增殖周期失控有關(guān)。手術(shù)、化療和放療是腫瘤治療的三大主要手段。然而，各種治療方法在一定程度上都有其局限性，而中藥具有毒性低、不良反應(yīng)小等優(yōu)勢(shì)。大量的臨床實(shí)踐研究表明，中藥的多層次、多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)的作用機(jī)制特點(diǎn)［1-2］，在提高惡性腫瘤的臨床療效，逆轉(zhuǎn)腫瘤的多藥耐藥性以及改善病人生活質(zhì)量方面，發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用［3］。

白頭翁又名白頭草，為毛茛科多年生草本植物?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)白頭翁具有抗腫瘤、抗炎、調(diào)節(jié)免疫功能的作用［4］。莪術(shù)的主要有效部位為根，揮發(fā)油是其主要活性成分。莪術(shù)油具有抗癌、抗氧化等作用［5］。

細(xì)胞凋亡是指在凋亡基因調(diào)控下細(xì)胞自主有序死亡的一種方式。細(xì)胞凋亡時(shí)發(fā)生的最顯著的變化就是染色體固縮，DNA裂解使細(xì)胞核形態(tài)發(fā)生變化。Hochest33258熒光染料是一種無(wú)毒、水溶性的可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料，在聚AT序列富集區(qū)域的小溝處與DNA結(jié)合。在凋亡細(xì)胞中，細(xì)胞膜對(duì)33258的攝取量增多，并且由于染色體高度濃縮，Hochest33258與之結(jié)合增強(qiáng)，染色呈強(qiáng)藍(lán)色熒光，而正常細(xì)胞只呈微弱熒光，死細(xì)胞則不被染色，由此可檢測(cè)出凋亡。細(xì)胞凋亡的機(jī)制非常復(fù)雜，機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要有線粒體凋亡通路和死亡受體凋亡通路［6］，而線粒體通路是最常見的凋亡信號(hào)通路。Cytc是線粒體呼吸鏈中的一個(gè)基本成分，正常情況下，Cytc位于線粒體膜間隙，呈電穩(wěn)定性結(jié)合于線粒體內(nèi)膜，不能通過(guò)線粒體外膜。當(dāng)在外界NO等因子的刺激下，線粒體發(fā)生聚集，Cytc便釋放到胞漿中［7］。Cytc從線粒體釋放到細(xì)胞漿是多種細(xì)胞凋亡的共同表現(xiàn)［8］，是線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑中不可或缺的重要因子，在凋亡過(guò)程中起著重要作用［9］。在細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制中，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)的激活是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵元件，目前已知的幾條凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路均要依賴Caspase家族的級(jí)聯(lián)反應(yīng)［10］。它的激活與超常表達(dá)均引起細(xì)胞凋亡，因此又稱死亡蛋白酶。Caspase分為三大類:凋亡啟動(dòng)因子、凋亡執(zhí)行因子和炎癥介導(dǎo)因子，組成了級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)。位于級(jí)聯(lián)反應(yīng)上游區(qū)域的細(xì)胞凋亡起始因子包括 Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9等，可識(shí)別和活化下游區(qū)域細(xì)胞凋亡執(zhí)行因子Caspase-3等，誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生［11］。Cytc從線粒體釋放后，在dATP和或(ATP)的作用下，與胞漿中的凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)形成多聚復(fù)合物，通過(guò)Apaf-1氨基末端的Caspase募集域募集胞質(zhì)中的Caspase-9前體，Caspase-9剪切活化，進(jìn)一步激活效應(yīng)Caspase-7和Caspase-3，從而啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)［12］。Caspase-3作為Caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行者之一，在凋亡過(guò)程中扮演著重要的效應(yīng)分子的角色［13］，Caspase-3的激活標(biāo)志著細(xì)胞凋亡進(jìn)入了不可逆轉(zhuǎn)的階段［14］。

綜上所述，筆者認(rèn)為，皮鱗癌1號(hào)方能抑制A431細(xì)胞的生長(zhǎng)，與其能促進(jìn)Cytc的釋放，活化Caspase-3和 Caspase-9，誘導(dǎo) A431細(xì)胞發(fā)生凋亡有關(guān)。

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