黃捷，馮艷，韓凌，李艷，張晶晶，宋昆鵬，石海莉

基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)研究

核糖核酸干擾基質(zhì)金屬蛋白酶-3 基因?qū)Υ笫笱芷交〖?xì)胞增殖的影響*

黃捷，馮艷，韓凌，李艷，張晶晶，宋昆鵬，石海莉

目的：研究靶向大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-3基因的小干擾核糖核酸（siRNA）對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響。

方法：構(gòu)建靶向自發(fā)性高血壓大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）的三對(duì)核糖核酸（RNA）干擾序列。將體外培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、Lipofectamine 2000（轉(zhuǎn)染試劑）組、MMP-3-siRNA-1組、MMP-3-siRNA-2組、MMP-3-siRNA-3組，以Lipofectamine 2000 分別轉(zhuǎn)染血管平滑肌細(xì)胞，48 h 后，以實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)血管平滑肌細(xì)胞MMP-3 信使核糖核酸（mRNA）的表達(dá)水平，篩選干擾效率最高的siRNA作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。血管平滑肌細(xì)胞隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、血小板源生長(zhǎng)因子（PDGF） 組、Lipofectamine 2000+PDGF組及MMP-3-siRNA-1+PDGF組；用siRNA 轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞，以四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法檢測(cè)血管平滑肌細(xì)胞增殖。

結(jié)果：實(shí)時(shí)定量PCR顯示，三對(duì)互補(bǔ)干擾片段均有不同程度的干擾效果，與對(duì)照組比較，MMP-3-siRNA-1組、MMP-3-siRNA-2組和 MMP-3-siRNA-3組的mRNA水平明顯降低，分別降低了81%、64%和22%。以MMP-3-siRNA-1組的干擾效率最高。蛋白免疫印跡法分析結(jié)果亦顯示MMP-3-siRNA-1組的干擾效率最高。四甲基偶氮唑鹽比色法檢測(cè)吸光度值結(jié)果顯示，與PDGF組相比，MMP-3-siRNA-1+ PDGF組轉(zhuǎn)染能顯著降低PDGF 誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖的吸光度值，抑制率為36.1%（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)論：靶向MMP-3基因siRNA 序列，能顯著降低平滑肌細(xì)胞MMP-3 mRNA和蛋白水平，抑制細(xì)胞增殖。靶向MMP-3基因干擾RNA可能成為血管增殖性疾病治療的新靶點(diǎn)。

基質(zhì)金屬蛋白酶-3；血管平滑肌細(xì)胞； RNA干擾；增殖

Methods: There were 3 complementary targeting sequences of MMP-3 gene were established according to MMP-3 gene sequence in Genbank as MMP-3-siRNA-1, MMP-3-siRNA-2 and MMP-3-siRNA-3. The VSMCs were cultured in 5 groups: ①Control group, ②Lipofectamine2000 group, ③MMP-3-siRNA-1 group, ④MMP-3-siRNA-2 group and⑤MMP-3-siRNA-3 group. The cells were transfected with Lipofectamine2000 for 48 hours and the mRNA expression of MMP-3 was examined by quantitative RT-PCR (qRT-PCR). The siRNA sequence with the highest interfering effciency was selected for further experiment, and VSMCs were divided in 4 groups: ①Control group, ②PDGF group,③Lipofectamine2000 + PDGF group and ④MMP-3-siRNA-1 + PDGF group. The cells were transfected with siRNA, and the proliferation of VSMC was detected by MTT method.

Results: qRT-PCR presented that 3 complementary sequences had different degrees of interfering effciency. Compared with Control group, the mRNA expressions of MMP-3 decreased in MMP-3-siRNA-1 group, MMP-3-siRNA-2 group and MMP-3-siRNA-3 group at 81%, 64% and 22% respectively. The MMP-3-siRNA-1 sequence had the highest interfering effciency and the same result was obtained by western blot analysis. Compared with PDGF group, MMP-3-siRNA-1 + PDGF group showed signifcantly decreased VSMC proliferation by 36.1%, P＜0.05.

Conclusion: The siRNA targeting sequence may decrease the mRNA and protein expression of MMP-3 and inhibit VSMC proliferation in experimental rats; it may become a new targeting point for treating the relevant vascular diseases.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:159.)

細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）異常積聚和降解引起血管損傷重構(gòu)是動(dòng)脈粥樣硬化（AS）、冠心病及血管損傷再狹窄等血管增殖性疾病發(fā)生、發(fā)展的重要原因?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs） 通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)降解、促進(jìn)中層血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）遷移和增殖，從而在血管增殖性疾病的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中起重要的作用。本研究以血管平滑肌細(xì)胞為研究對(duì)象，利用核糖核酸（RNA）干擾技術(shù)，特異性地沉默MMP-3基因，觀察其被沉默后對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響，以期為血管增殖性疾病的分子靶向治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)的起止時(shí)間為2011-09 至2014-03。Lipofectamine 2000 （轉(zhuǎn)染試劑）購(gòu)自 Invitrogen（美國(guó)）； DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自 Gibco（美國(guó)）；所用干擾序列由百奧邁科生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。四甲基偶氮唑鹽（ MTT ）比色法細(xì)胞增殖試劑盒購(gòu)自碧云天公司 ， 血小板源生長(zhǎng)因子（PDGF） 購(gòu)自美國(guó) Peprotech 公司。兔抗大鼠抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，山羊抗兔抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

傳統(tǒng)的教學(xué)模式，老師根據(jù)考試大綱劃出重點(diǎn)內(nèi)容，學(xué)生只需要背誦老師要求的重點(diǎn)即可。在課堂上，教師將花費(fèi)大量的時(shí)間和精力來(lái)監(jiān)督學(xué)生的學(xué)習(xí)，并督促學(xué)生按時(shí)完成指定的學(xué)習(xí)任務(wù)。課后還會(huì)安排很多功課，以鞏固所學(xué)的知識(shí)。在這種模式中，老師成為了主體，學(xué)生一味地聽從老師的安排與指導(dǎo)，這種模式雖然在應(yīng)對(duì)考試時(shí)會(huì)有一定的成效，但是會(huì)導(dǎo)致學(xué)生缺乏判斷能力以及自主學(xué)習(xí)的能力。然而，這些能力在未來(lái)的學(xué)習(xí)和生活過(guò)程中至關(guān)重要。

1.2 方法

采用組織貼塊法[1]培養(yǎng)自發(fā)性高血壓大鼠（8周齡）血管平滑肌細(xì)胞，鑒定血管平滑肌細(xì)胞純度達(dá)95%以上方可用于實(shí)驗(yàn)。

靶向大鼠MMP-3 基因的設(shè)計(jì)與合成：針對(duì)大鼠MMP-3 基因序列構(gòu)建三對(duì)小干擾核糖核酸（siRNA）序列，在GenBank中查找大鼠的MMP-3的信使核糖核酸（mRNA）全序列，通過(guò)Blast軟件確定與其它非相關(guān)基因無(wú)同源性，交由百奧邁科生物技術(shù)有限公司根據(jù)序列設(shè)計(jì)合成。具體序列如下：MMP-3-siRNA-1：正義鏈5'-GUGGUACCCACCAAAUCUAdTdT-3、反義鏈5'-UAGAUUUGGUGGGUACCACdTdT-3；M M P-3-s i R N A-2：正義鏈5'-CCUUACUCUAGCAUGUGCUdTdT-3、反義鏈5'-AGCACAUGCUAGAGUAAGGdTdT-3；MMP-3-siRNA-3：正義鏈5'-CUUUACUUCUUCAGCGGAUdTdT-3、反義鏈5'-AUCCGCUGAAGAAGUAAAGdTdT-3。

siRNA轉(zhuǎn)染、檢測(cè)MMP-3的干擾效果： 對(duì)照組：不加任何處理；Lipofectamine 2000組：加入Lipofectamine 2000（轉(zhuǎn)染試劑）；MMP-3-siRNA-1組：加入干擾載體MMP-3-siRNA-1；MMP-3-siRNA-2組：加入干擾載體MMP-3-siRNA-2；MMP-3-siRNA-3組：加入干擾載體MMP-3-siRNA-3。6孔板接種血管平滑肌細(xì)胞，2.5×105個(gè)/孔，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)；第2天更換新鮮培養(yǎng)基，將無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液200 μl、1.5 μl siRNA（20 μmol/L）和12 μl Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑混合均勻，靜置15 min；將上述混合物逐滴加入到含600 μl新鮮培養(yǎng)液細(xì)胞中、搖勻，6 h后更換2 ml含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液；轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞提取總細(xì)胞RNA，測(cè)定濃度。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照TaKaRa（大連寶生物）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，體系如下：5×primeScript buffer: 2 μl， PrimeScript RT enzyme MixⅠ: 0.5 μl；Oligodt primer（50 μmol）: 0.5 μl， Random 6 mers: 0.5 μl，Total RNA: 500 ng； RNase free dH2O:加至10 μl。反應(yīng)條件為: 37℃ 15 min、85℃ 5 s。實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）方法為MMP-3上游引

物: 5'-TTCCTTGGGCTGAAGATGAC-3'，下游引物: 5'-TCCTGGAGAATGTGAGTGGG-3'，以β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）基因?yàn)閮?nèi)參照。反應(yīng)條件：95℃10 s、95℃5 s、60℃31 s， 40個(gè)循環(huán)，熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)。基因的定量通過(guò)樣本和對(duì)照細(xì)胞的閾值循環(huán)數(shù)（Ct）值進(jìn)行計(jì)算比較。定量的方法以2-ΔΔCt表示基因的表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

蛋白免疫印跡法（Western blot）：細(xì)胞用4℃ PBS沖洗后加入裂解液及蛋白酶抑制劑，提取蛋白質(zhì)， 測(cè)定濃度， 并分裝。取適量蛋白質(zhì)， 與2 ×SDS上樣緩沖液1 ：1混合，沸水煮5～10 min， 置冰上2 min， 行15% SDS-PAGE電泳。然后轉(zhuǎn)膜， 聚偏二氟乙烯膜（PVDF）用20 ml封閉液（1×TBS-0.05% Tween20 ，TBST pH 7.6）室溫孵育1 h， 倒去封閉液， 加入兔抗大鼠MMP-3抗體（1:1000稀釋） 4℃ 孵育過(guò)夜，TBST 洗膜3次， 每次5 min。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔二抗（ 1：5000稀釋）室溫孵育1 h， TBST洗膜3 次。膜稍滴干后加入化學(xué)發(fā)光試劑孵育1 min， 壓片， 曝光時(shí)間1 min。X-膠片經(jīng)顯影、定影后掃描記錄。以β-actin為內(nèi)參照。

MMP-3-siRNA-1 對(duì)血小板源生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖測(cè)定：將大鼠血管平滑肌細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，隨機(jī)分為對(duì)照組: 只加DMEM 高糖培養(yǎng)液；PDGF組: 加入PDGF 10 ng/ L；Lipofectamine 2000+PDGF組：加入Lipofectamine 2000+PDGF 10 ng/ L； MMP-3-siRNA-1+PDGF組:加入MMP-3-siRNA-1+PDGF 10 ng/ L。計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度， 以1 000個(gè)/孔接種于96 孔板中，加DMEM 培養(yǎng)液至0.1 ml，5%CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后換成0.1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，加入PDGF 誘導(dǎo)24 h 后每孔加入100 μl甲臜（Formanzan ）溶解液， 再繼續(xù)孵育直至紫色結(jié)晶全部溶解， 酶標(biāo)儀上選擇560 nm 濾片測(cè)定吸光度值（A） 值，增殖抑制率=[1-實(shí)驗(yàn)組（A） 值/空白對(duì)照組（A） 值]×100%。每組6 個(gè)平行孔， 重復(fù)3 次。無(wú)細(xì)胞的孔為空白對(duì)照，取均值。

采用SPSS 10.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 靶向MMP-3的siRNA對(duì)血管平滑肌細(xì)胞MMP-3基因表達(dá)的影響

靶向MMP-3的siRNA能夠抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞MMP-3基因的表達(dá)，與對(duì)照組比較，MMP-3-siRNA-1組、 MMP-3-siRNA-2組和 MMP-3-siRNA-3組的mRNA表達(dá)水平明顯降低，分別降低了81%、64%和22%。圖1

圖1 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)分析siRNA對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞MMP-3 mRNA水平的影響

2.2 靶向MMP-3的siRNA對(duì)血管平滑肌細(xì)胞MMP-3蛋白表達(dá)的影響

蛋白免疫印跡法分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組和Lipofectamine 2000組比較MMP-3蛋白水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而MMP-3-siRNA-1組、MMP-3-siRNA-2組、MMP-3-siRNA-3組與對(duì)照組和Lipofectamine 2000組比較MMP-3蛋白水平均有不同程度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），以MMP-3-siRNA-1組降低最為明顯（P＜0.01）。圖2

2.3 MMP-3-siRNA-1對(duì)PDGF誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響

四甲基偶氮唑鹽比色法檢測(cè)吸光度值結(jié)果顯示：與對(duì)照組血管平滑肌細(xì)胞的吸光度值（0. 40±0.04）比較，PDGF組（ 0.72±0. 04）、Lipofectamine 2000+PDGF組（0.71±0.06）均明顯增加（P＜0. 01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PDGF組較Lipofectamine 2000+ PDGF組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意

義（P＞0.05）；與PDGF組相比， MMP-3-siRNA-1+ PDGF組轉(zhuǎn)染能顯著降低PDGF 誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖的吸光度值（P＜0.05）。圖3

圖2 蛋白免疫印跡法分析siRNA對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞 MMP-3蛋白水平的影響

圖3 MMP-3-siRNA-1對(duì)PDGF誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響

3 討論

MMP是一類由Zn2+依賴性的內(nèi)肽酶組成的酶家族，MMP的過(guò)度表達(dá)與多種病理過(guò)程如癌癥、關(guān)節(jié)炎、卒中、心血管疾病等密切相關(guān)[2，3]。研究證實(shí)細(xì)胞—基質(zhì)以及細(xì)胞—細(xì)胞之間的相互作用對(duì)調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡起著非常重要的作用。而MMP通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的降解而在細(xì)胞—基質(zhì)以及細(xì)胞—細(xì)胞之間的相互作用上起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)， MMP-l、MMP-2、MMP-3、MMP-9的表達(dá)在兔動(dòng)脈血管粥樣斑塊中明顯升高。球囊損傷后，MMP在損傷后的內(nèi)皮細(xì)胞中明顯增加，它們能分解細(xì)胞外基質(zhì)，重塑基質(zhì)構(gòu)成，將血管平滑肌細(xì)胞從基底膜禁錮中解放出來(lái)，從中膜遷移到內(nèi)膜，使平滑肌細(xì)胞可以移行、增殖，使內(nèi)膜增厚，引起狹窄[4，5]。在腺病毒介導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶的組織抑制劑-1（TIMP-l）和基質(zhì)金屬蛋白酶的組織抑制劑-2（TIMP-2）基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，頸動(dòng)脈球囊損傷后的內(nèi)膜形成較對(duì)照組明顯減少[6，7]。MMP-1 和TIMP-1/ MMP-1 與斑塊不穩(wěn)定密切相關(guān)， 可作為冠狀動(dòng)脈斑塊不穩(wěn)定性預(yù)測(cè)的參考指標(biāo)[8]。Johnson等[9]發(fā)現(xiàn)，在體實(shí)驗(yàn)中，敲除小鼠MMP-2基因后，頸動(dòng)脈損傷模型小鼠的血管平滑肌細(xì)胞的遷移能力和內(nèi)膜形成都明顯減少。細(xì)胞外基質(zhì)在血管平滑肌細(xì)胞生物學(xué)行為中發(fā)揮明顯的作用。

作為MMP家族主要成員，MMP-3不僅能夠強(qiáng)力降解細(xì)胞外基質(zhì)，同時(shí)又可以激活MMP-l、MMP-8、MMP-9的活性，共同參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解過(guò)程。在體內(nèi)許多內(nèi)源性生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子可調(diào)節(jié)MMP-3活性，白細(xì)胞介素-1（IL-1）和PDGF是最常見的共同存在于動(dòng)脈粥樣硬化病變處的生物因子。Hoshino等[10]在研究與Ⅱ型肺泡細(xì)胞同源的A549細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，IL-1β可增加MMP-3的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，MMP-3在粥樣硬化病變的基質(zhì)蛋白降解中起重要作用，冠狀動(dòng)脈斑塊破裂常與細(xì)胞外基質(zhì)在某些部位的缺失有關(guān)，在斑塊破裂區(qū)域，基質(zhì)金屬蛋白酶家族MMP表達(dá)增強(qiáng)，這通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)導(dǎo)致斑塊纖維帽的削弱。通過(guò)原位mRNA雜交發(fā)現(xiàn)，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中存在MMP-3，且高度局限于斑塊易破裂的纖維帽肩部而導(dǎo)致斑塊破裂[11]。 MMP-3在不穩(wěn)定性心絞痛及急性心肌梗死患者中增高，可能是粥樣硬化斑塊存在的冠心病初篩指標(biāo)及不穩(wěn)定斑塊的潛在指標(biāo)[12]。

Zhang等[13]研究則發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)MMP-3特異抑制物TIMP-3可抑制前列腺腫瘤細(xì)胞的增殖及入侵，提示MMP-3在細(xì)胞增殖方面發(fā)揮重要作用。

我們構(gòu)建了靶向MMP-3的siRNA，并成功的篩選出能夠有效沉默MMP-3基因的干擾序列。我們用10 ng/ml的PDGF刺激大鼠的血管平滑肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)PDGF能夠誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞的增殖，靶向MMP-3基因的siRNA能夠顯著抑制MMP-3基因的表達(dá)，同時(shí)siRNA能夠顯著抑制PDGF誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，與之前Southgate等[14]研究相似。由于自發(fā)性高血壓大鼠自身特點(diǎn)及高血壓性心血管病變，其與正常大鼠血管平滑肌細(xì)胞生物學(xué)行為可能存在不同，具體差異有待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果提示MMP-3參與了PDGF誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，MMP-3可作為血管增殖性疾病治療的新靶點(diǎn)，這為我們進(jìn)一步研究血管增殖性疾病治療提供理論依據(jù)。但血管增殖性疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程極其復(fù)雜、可能涉及巨噬細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解、細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂、遷移等，其作用的復(fù)雜機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

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Effect of RNA Small Interfering Sequence of MMP-3 on Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation in Experimental Rats

HUANG Jie, FENG Yan, HAN Ling, LI Yan, ZHANG Jing-jing, SONG Kun-peng, SHI Hai-li.
Department of Cardiology, The Affliated Central Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou (450007), Henan, China

Objective: To study the effect of RNA small interfering (siRNA) sequence of matrix metalloproteinase-3 (MMP-3) on vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation in experimental rats.

Matrix metalloproteinase-3; Vascular smooth muscle cells; RNA interference; Proliferation

2014-07-16）

（編輯：漆利萍）

鄭州市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（No：112PPTSF312-3）

450007 河南省鄭州市，鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院 心血管內(nèi)科

黃捷 副主任醫(yī)師 博士 主要從事冠心病的診治臨床研究 Email: huangjie-md@163.com 通訊作者：黃捷

R541

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1000-3614（2015）02-0159-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.02.016