郭芳，田娟，趙越超

（遼寧醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001）

·論著·

小鼠腎發(fā)育中膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族受體α1和受體酪氨酸激酶的表達(dá)*

郭芳，田娟，趙越超

（遼寧醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001）

目的研究小鼠腎發(fā)育過(guò)程中膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族受體α1（GFRα1）和受體酪氨酸激酶（RET）的表達(dá)及意義。方法應(yīng)用免疫熒光和蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)各胚齡小鼠腎組織中GFRα1和RET的時(shí)空定位表達(dá)及蛋白含量變化。結(jié)果在腎發(fā)育早期，GFRα1和RET在輸尿管芽上皮細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)，生后腎組織內(nèi)僅見(jiàn)GFRα1表達(dá)。隨著腎小體的發(fā)育，GFRα1在腎小體發(fā)育早期即小泡體、逗號(hào)小體和S小體均有表達(dá)，而在腎小體發(fā)育后期即毛細(xì)血管袢期腎小體和未成熟期腎小體表達(dá)減弱，在成熟腎小體未見(jiàn)表達(dá)。RET在各期腎小體均未見(jiàn)表達(dá)。隨著早期髓質(zhì)的出現(xiàn)，GFRα1在近端小管、遠(yuǎn)端小管和集合管有明顯表達(dá)；RET在集合管表達(dá)。在成熟腎臟，GFRα1定位表達(dá)于近端小管、遠(yuǎn)端小管和集合管；RET定位表達(dá)于集合管。GFRα1和RET在腎臟的蛋白表達(dá)量隨胚齡的增加而增加，生后1 d達(dá)峰值，隨后兩者的蛋白表達(dá)量隨日齡的增加而逐漸減少。結(jié)論在腎發(fā)育中，GFRα1參與腎小體發(fā)生、早期發(fā)育過(guò)程及腎小管和集合管的發(fā)生、發(fā)育過(guò)程，并維持其正常生理功能。RET參與集合管的發(fā)生、發(fā)育過(guò)程，并維持其正常生理功能。

膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族受體α1；受體酪氨酸激酶；腎；發(fā)育；

膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（glial cell linederived neurotrophic factor，GDNF）受體包括GDNF家族受體α1（GDNF family receptor α1，GFRα1）和受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RET）兩種。其中，GFRα1為糖基化磷脂酰肌醇錨定受體，缺乏跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)；RET則有膜外、跨膜和膜內(nèi)成分，起信號(hào)傳導(dǎo)作用[1-2]。GFRα1和RET通過(guò)與GDNF結(jié)合，調(diào)控體內(nèi)多個(gè)器官系統(tǒng)的發(fā)育及維持其生理功能[3-4]。國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，GFRα1和RET參與腎臟輸尿管芽發(fā)生及形態(tài)學(xué)分支[5]，并提出兩者通過(guò)與GDNF結(jié)合調(diào)控腎臟的發(fā)生、發(fā)育過(guò)程，但具體的調(diào)控機(jī)制國(guó)內(nèi)尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。另有研究表明，GFRα1和RET的異常表達(dá)與某些腎發(fā)育畸變疾病如腎母細(xì)胞瘤有關(guān)[6]。因此在前期研究的基礎(chǔ)上[7]，本實(shí)驗(yàn)觀察GFRα1和RET在小鼠腎臟發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)變化，為進(jìn)一步闡明其在腎臟發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制奠定形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年健康昆明小鼠（體重25～30 g），購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證：SCXK（遼）2008-0005。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

GFRα1兔多克隆抗體（sc-10716）、RET兔多克隆抗體（sc-167）購(gòu)自美國(guó)Santa公司，異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白IgG購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogease，GAPDH）鼠單克隆抗體購(gòu)自上?？党缮锕荆燮蚁╬olyvinylidene fluoride，PVDF）膜、蛋白Marker購(gòu)自NEB公司，ECL（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本制備小鼠按雌雄比例1∶1同窩飼養(yǎng)，以觀察到陰道栓脫落的最早時(shí)間計(jì)為胚齡（embryonic days，E）0 d[7]。孕鼠分籠飼養(yǎng)，每天上午8∶00、下午5∶00觀察生產(chǎn)，以觀察到仔鼠出生的最早時(shí)間計(jì)為生后（neonatal days，N）0 d。分別取胚齡12、14、16、18 d胎鼠和生后1、7、14、21和40 d仔鼠腎臟，每組8只，每只孕鼠最多取2只胎鼠或仔鼠。孕鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉后剖腹取出胎鼠，胚齡12 d全胚固定，胚齡14、16、18 d取其左腎固定。仔鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉后，于腹后壁取出左腎，用排刀法沿橫軸將腎臟切開(kāi)，置于4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟定向包埋，5μm連續(xù)切片。各組小鼠取右腎，入液氮迅速冷凍，置入-80℃冰箱冷凍保存待用。

1.3.2 免疫熒光技術(shù)切片常規(guī)脫蠟、水化，滴加5%驢血清（normal donkey serum，NDS）室溫孵育1 h，甩去多余液體，不洗；滴加GFRα1或RET兔多克隆抗體（工作液濃度1∶100）置入4℃孵化箱過(guò)夜，滴加FITC標(biāo)記的熒光二抗室溫孵育2 h，用防淬滅封片劑封片，共聚焦激光掃描顯微鏡（激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm）觀察并采集圖像[7]。以磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）代替一抗作陰性對(duì)照組。上述各步驟用0.01 mol/L PBS沖洗。

1.3.3 蛋白印跡檢測(cè)取冷凍待用右腎分別稱質(zhì)量，用小剪刀將組織塊盡量剪碎（冰上操作），加入4倍體積的蛋白裂解液，超聲粉碎，4℃過(guò)夜，冷凍離心機(jī)4℃、12 000 r/min離心30 min，去除細(xì)胞碎片，取上清液，考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量[7]。樣品取50μg與6×十二烷基硫酸鈉上樣緩沖液混合，100℃煮沸5 min，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗（GFRα1和RET工作液濃度為1∶700）置入4℃孵育過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的二抗（工作液濃度1∶5 000）室溫孵育2 h，HRP-ECL蛋白檢測(cè)發(fā)光鑒定，凝膠電泳圖像分析儀進(jìn)行采圖。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用單因素方差分析，P＜0.05有差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光檢測(cè)

胚齡12 d，GFRα1在輸尿管芽上皮細(xì)胞及生后腎組織微弱表達(dá)；而RET在輸尿管芽上皮細(xì)胞微弱表達(dá)，生后腎組織未見(jiàn)表達(dá)。隨著腎小體發(fā)育，GFR α1在小泡體、逗號(hào)小體和S小體均有表達(dá)，表達(dá)逐漸增強(qiáng)；在毛細(xì)血管袢期腎小體及未成熟期腎小體表達(dá)減弱，在成熟腎小體未見(jiàn)表達(dá)。RET在各期發(fā)育階段的腎小體未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)。隨著早期髓質(zhì)的出現(xiàn)，GFRα1在近端小管、遠(yuǎn)端小管和集合管有明顯表達(dá)；RET在集合管有明顯表達(dá)。在成熟腎臟中，GFR α1主要定位表達(dá)于近端小管、遠(yuǎn)端小管和集合管；RET主要定位表達(dá)于集合管。見(jiàn)圖1、2。

圖1 GFRα1在小鼠腎臟表達(dá)的免疫熒光染色

圖2 RET在腎臟表達(dá)的免疫熒光染色

2.2 蛋白印跡檢測(cè)

隨著胚齡的增加，GFRα1和RET在腎臟表達(dá)量逐漸增加，生后1 d表達(dá)量最高，隨后GFRα1和RET在腎臟表達(dá)量逐漸減少。見(jiàn)圖3。

圖3 小鼠腎臟發(fā)育各階段GFRα1和RET蛋白表達(dá)變化

3 討論

哺乳動(dòng)物腎臟發(fā)育是輸尿管芽和生后腎組織相互誘導(dǎo)的結(jié)果。以小鼠為例，胚齡12 d輸尿管芽及其分支出現(xiàn)，生后腎組織呈帽狀圍繞在輸尿管芽及分支周圍；胚齡14 d，輸尿管芽分支周圍出現(xiàn)小泡體、逗號(hào)小體、S小體，這部分皮質(zhì)稱為生腎區(qū)；胚齡16 d，大多數(shù)腎小體仍停留在逗號(hào)小體、S小體階段，可見(jiàn)到少量Ⅲ和Ⅳ期的髓旁腎小體，即第1代成熟腎小體出現(xiàn)；胚齡18 d，早期髓質(zhì)出現(xiàn)，髓質(zhì)由少量近直小管、遠(yuǎn)直小管、細(xì)段和集合管構(gòu)成，其間散在大量間質(zhì)，相當(dāng)于成年后的髓質(zhì)外帶外區(qū)；生后1 d，被膜下仍有生腎區(qū)，但相對(duì)面積減少，髓質(zhì)外帶內(nèi)區(qū)出現(xiàn)；生后7 d，皮質(zhì)生腎區(qū)消失，只有Ⅳ期腎小體存在，腎小體發(fā)育基本成熟，集合管不再分支，髓放線出現(xiàn)，可見(jiàn)近直小管，遠(yuǎn)直小管和集合管，腎乳頭可見(jiàn)由遠(yuǎn)端小管直部、細(xì)段以及集合管構(gòu)成的髓質(zhì)外帶內(nèi)區(qū)；隨后，皮質(zhì)增厚，髓質(zhì)可區(qū)分為髓質(zhì)外帶內(nèi)外區(qū)；生后40 d，腎發(fā)育達(dá)到成年水平[8]。

有研究表明，GFRα1和RET參與腎臟發(fā)生、發(fā)育過(guò)程。1998年TOWERS等[9]發(fā)現(xiàn)，GFRα1和RET在腎臟表達(dá)，參與腎發(fā)生、發(fā)育過(guò)程。2003年CAMASSEI等[6]通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)腎胚細(xì)胞瘤中GFRα1和RET的陽(yáng)性表達(dá)，證實(shí)GFRα1和RET參與誘導(dǎo)腎胚細(xì)胞瘤的細(xì)胞分化。2004年CHARLETBERGUERAND等[10]報(bào)道GDNF家族復(fù)合受體GFRα1是RET信號(hào)轉(zhuǎn)換的重要成分，與神經(jīng)細(xì)胞和腎發(fā)育有關(guān)，其活性可被GDNF激活。2006年COSTANTINI等[11]證實(shí)，GDNF/RET信號(hào)系統(tǒng)是腎臟發(fā)育中輸尿管芽正常生長(zhǎng)的必要條件，但GDNE/RET信號(hào)在腎分支形態(tài)學(xué)的作用機(jī)制仍不清楚。2008年SKINNER等[12]提出人類RET和GDNF突變可能導(dǎo)致腎發(fā)育異常。2009年LU等[13]發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育中，缺乏Etv4和Etv5等位基因會(huì)導(dǎo)致腎發(fā)育不良，并推測(cè)Etv4和Etv5是RET的下游信號(hào)。JAIN[14]報(bào)道GFRα1或RET缺失將導(dǎo)致腎發(fā)育不全，引起圍產(chǎn)期死亡，在人類先天性腎畸形中可檢測(cè)出RET基因突變。

本研究顯示，胚齡12 d時(shí)，GFRα1和RET分別在小鼠腎臟輸尿管芽和生后腎組織開(kāi)始表達(dá)，表明兩者對(duì)腎臟的發(fā)生起關(guān)鍵作用。在腎小體的發(fā)育過(guò)程中，GFRα1在腎小體早期發(fā)育階段有表達(dá)；在發(fā)育后期減弱，成熟腎小體未見(jiàn)表達(dá)，說(shuō)明GFRα1參與腎小體的發(fā)生及早期分化、增殖，而對(duì)腎小體的后期發(fā)育及功能可能不起關(guān)鍵作用。隨著早期髓質(zhì)的出現(xiàn)，GFRα1在近端小管、遠(yuǎn)端小管和集合管有明顯的表達(dá)，RET在集合管有表達(dá)。說(shuō)明兩者分別參與腎小管和集合管的形態(tài)發(fā)生、發(fā)育過(guò)程。在成熟腎臟中，GFRα1定位表達(dá)于近端小管、遠(yuǎn)端小管和集合管；RET定位表達(dá)于集合管，與其他研究結(jié)果相似[9，11]。表明兩者在維持腎臟正常生理功能方面同樣發(fā)揮重要作用。蛋白印跡結(jié)果顯示，隨著胚齡的增加，GFRα1和RET在腎臟表達(dá)量表現(xiàn)為先遞增，達(dá)到峰值之后逐漸遞減，其峰值出現(xiàn)在生后1 d。本研究首次發(fā)現(xiàn)，GFRα1和RET在腎臟發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)變化特點(diǎn)，該特點(diǎn)具有的生理意義還有待于進(jìn)一步研究。因此，GFRα1和RET可參與腎臟不同結(jié)構(gòu)的發(fā)生、發(fā)育過(guò)程，并維持其正常生理功能。然而，兩者是如何通過(guò)其信號(hào)通路調(diào)控腎發(fā)育過(guò)程，還有待下一步研究。

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（張蕾 編輯）

Expression of glial cell line-derived neurotrophic factor family receptor α1 and receptor tyrosine kinase in kidney development of mouse*

Fang GUO,Juan TIAN,Yue-chao ZHAO
(Department of Histology and Embryology,Liaoning Medical College, Jinzhou,Liaoning 121001,P.R.China)

【Objective】To investigate the expressions of glial cell line-derived neurotrophic factor family receptor α1(GFR α1)and receptor tyrosine kinase(RET)during renal development of mice and the significance.【Methods】The expressions of GFR α1 and RET were examined by immunofluorescence.The protein content of GFR α1 and RET in the kidneys of embryonic and neonatal mice was measured by Western blot.【Results】In the early development of kidney,GFR α1 and RET began to express in epithelium of ureteric bud,and only GFR α1 appeared in metanephrogenic tissue.Along with the development of renal corpuscles, GFR α1 was expressed in the early-development renal corpuscles such as vesicle bodies,comma-shaped bodies and S-shaped bodies；but the expression was reduced in the later-stage renal corpuscles and disappeared in mature renal corpuscles.RET was not expressed in renal corpuscles of any stage.Along with the emerging of early medulla,GFR α1 was also expressed in proximal tubules,distal tubules and collecting ducts of developmental and mature kidney.RET was expressed in collecting ducts of developmental and mature kidney.Western blot results showed the expressions of GFRα1 and RET in kidney increased along with embryonic age andreached to the peak on N1 d.Then,the expressions of GFR α1 and RET in kidney decreased along with neonatal age.【Conclusions】GFR α1 may participate in the generation and early development of renal corpuscles and in the development and function of proximal tubules,distal tubules and collecting ducts.RET may participate in the development and function of collecting ducts.

glial cell line-derived neurotrophic factor family receptor α l；receptor tyrosine kinase；kidney；development

R329.461；R-332

A

1005-8982（2015）30-0013-05

2015-04-23

國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（No：201410160037）；遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（No：201410160037）；遼寧省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（No：L2012307）；遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目（No：2013022067）

田娟，E-mail：tian555juan555@sina.com