關如花，房輝，徐剛，楊瑩，楊梅柳，張翠林，周莉，李玉凱，周蕾，張雅中，田金莉，楊岳

（1.華北理工大學，河北 唐山 063000；2.河北省唐山市工人醫(yī)院內分泌科，河北 唐山 063000；3.河北醫(yī)科大學，河北 石家莊 050000）

·臨床論著·

線粒體絲氨酸蛋白酶在甲狀腺乳頭狀癌中的表達水平及其臨床意義

關如花1，房輝2，徐剛2，楊瑩2，楊梅柳2，張翠林1，周莉1，李玉凱3，周蕾2，張雅中2，田金莉2，楊岳2

（1.華北理工大學，河北 唐山 063000；2.河北省唐山市工人醫(yī)院內分泌科，河北 唐山 063000；3.河北醫(yī)科大學，河北 石家莊 050000）

目的探討線粒體絲氨酸蛋白酶（Omi/HtrA2）在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及其與臨床病理的關系。方法采用免疫組織化學方法和蛋白印跡法檢測120例甲狀腺乳頭狀癌、40例結節(jié)性甲狀腺腫及40例正常甲狀腺組織中Omi/HtrA2的表達水平，并分析其與甲狀腺乳頭狀癌的臨床病理特征的關系。結果免疫組織化學結果表明，甲狀腺乳頭狀癌組織中Omi/HtrA2蛋白陽性率（71.67%）較結節(jié)性甲狀腺腫（30.00%）、正常甲狀腺組織（32.50%）明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。蛋白印跡法檢測結果表明，Omi/HtrA2蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達量為（1.184±0.060），明顯高于結節(jié)性甲狀腺腫組織（0.599±0.096）和正常甲狀腺組織（0.606±0.097），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Omi/HtrA2蛋白的表達與甲狀腺乳頭狀癌的包膜浸潤、淋巴結轉移、腫瘤臨床分期及腫瘤分化有關（P＜0.05）。結論Omi/HtrA2蛋白的表達可能成為判斷甲狀腺乳頭狀癌惡化程度及預后的指標。

甲狀腺乳頭狀癌；線粒體絲氨酸蛋白酶（Omi/HtrA2）；免疫組織化學法；蛋白印跡法

甲狀腺癌是最常見的內分泌腫瘤，約占內分泌腫瘤的90%[1]。而甲狀腺乳頭狀癌又是甲狀腺癌中最常見的類型，因此，盡早對其進行診治具有重要意義。腫瘤細胞的生長受到許多因素的影響，細胞凋亡因子失衡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤及轉移密切相關。Omi/HtrA2是線粒體膜間隙釋放的促凋亡因子，在多種組織和細胞中均有表達[2]。近期研究顯示，O-mi/HtrA2在胃癌[3]、結腸癌[4]、食管癌[5]中都呈現高表達，但在甲狀腺乳頭狀癌中的作用報道較少。本研究應用免疫組織化學方法和蛋白印跡法（Western-blot）檢測Omi/HtrA2在甲狀腺乳頭狀癌中的表達情況，為甲狀腺乳頭狀癌的臨床診斷及治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

收集唐山市工人醫(yī)院2013年2月-2014年10月確診的120例甲狀腺癌患者的新鮮甲狀腺乳頭狀癌組織標本以及40例結節(jié)性甲狀腺腫和40例正常甲狀腺組織標本，分為3組。120例甲狀腺乳頭狀癌組中，男52例，女68例；＜45歲56例，≥45歲64例。其中，有包膜浸潤的35例，無包膜浸潤的85例；分化程度：低分化78例，高、中分化42例；按照2002年UICC（國際抗癌聯盟）的TNM（T是原發(fā)腫瘤的大小、N是區(qū)域淋巴結是否有轉移、M是是否有遠處轉移）進行分期：Ⅰ、Ⅱ期65例，Ⅲ、Ⅳ期55例；根據是否淋巴結轉移分為：有轉移者70例，無轉移者50例。所有標本均在手術室現場收集，并征得患者及家屬的同意，一部分組織置于液氮中保存，用于Western blot檢測，其余組織置于10%甲醛溶液中固定，用于免疫組織化學法檢測。全部標本均由2位病理科醫(yī)生通過HE染色的切片明確病理診斷，病歷資料均具有可比性。所有患者術前均無放療或者化療史。

1.2 主要實驗試劑

免疫組織化學及Western blot試劑，兔抗人Omi/ HtrA2多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.3 實驗方法及步驟

1.3.1 免疫組織化學組織標本經常規(guī)石蠟包埋，每份病理標本切成4μm厚的切片。石蠟切片進行常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水處理后，進行0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH=6.0）及微波抗原修復。室溫下將玻片放到盛有10%山羊血清的濕盒中封閉20 min，之后在玻片上滴加Omi/HtrA2兔抗人多克隆抗體（1∶100），蓋上濕盒置于4℃冰箱中過夜。第2天室溫下在玻片上滴加二抗，然后于濕盒內孵育10 min，孵育完畢后對玻片沖洗并進行二氨基聯苯胺（DAB）顯色，再進行蘇木精復染，常規(guī)脫水，最后進行封片。結果判定：由2位病理科專家在不知臨床病例資料的前提下，對陽性細胞所占的比例進行計數。以細胞漿呈現淡黃色或棕黃色染色顆粒作為陽性標準，計算10個高倍視野中陽性細胞所占的比例，結果判定以染色強度和陽性細胞百分率相乘得出的飽和指數（SI指數）進行評估。染色強度如下：沒有染色（0分），弱度染色（1分），中度染色（2分）,強度染色（3分）。染色區(qū)域如下：腫瘤細胞少于25%（1分），25%～50%（2分），51%～75%（3分），＞75%（4分）。各因子的表達水平由SI指數決定，SI指數≥4為因子陽性表達，SI指數≤3為因子陰性表達。以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對照組。

1.3.2 Western blot方法將100 mg組織提取的總蛋白用考馬斯亮藍試劑盒定量。取50μg蛋白上樣到配置好的SDS-PAGE凝膠，電泳，將凝膠上的蛋白電轉移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，以50 g/L脫脂奶粉4℃封閉過夜，加一抗Omi/HtrA2兔抗人多克隆抗體（1∶100），37℃孵育2 h，0.1%TBST緩沖液漂洗PVDF膜3×10 min，取出PVDF膜加入二抗，37℃孵育2 h，TBST洗膜后加入ECL試劑，曝光、顯影、定影，對X光底片拍照保存。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，計數資料的比較用χ2檢驗，多組計量資料的比較用方差分析，進行兩兩比較用q檢驗（Studnet-Newman Keuls檢驗法），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Omi/HtrA2在甲狀腺乳頭狀癌、結節(jié)性甲狀腺腫及正常甲狀腺組織中的表達情況

對甲狀腺乳頭狀癌、結節(jié)性甲狀腺腫和正常甲狀腺組織進行HE染色，如圖所示（見圖1）。免疫組織化學結果顯示，Omi/HtrA2陽性表達的甲狀腺組織呈淺黃色、棕黃色或黃褐色（見圖2）。甲狀腺乳頭狀癌、結節(jié)性甲狀腺腫及正常甲狀腺組織中Omi/HtrA2的陽性表達率分別為71.67%（86/120）、30.00%（12/ 40）和32.50%（13/40）。甲狀腺乳頭狀癌組Omi/HtrA2的陽性率明顯高于結節(jié)性甲狀腺腫組和正常甲狀腺組，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=21.944和19.509，P＜0.05）；結節(jié)性甲狀腺腫組與正常甲狀腺組Omi/HtrA2的陽性率差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.058，P＞0.05）（見表1）。Western blot結果顯示，Omi/HtrA2蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達量為（1.184±0.060），明顯高于結節(jié)性甲狀腺腫組織（0.599±0.096）和正常甲狀腺組織（0.606±0.097），差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而其在結節(jié)性甲狀腺腫組與正常甲狀腺組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（見圖3）。

圖1 甲狀腺組織的HE染色圖像（×100）

圖2 免疫組織化學檢測Omi/HtrA2在甲狀腺組織中的表達（×100）

表1 Omi/HtrA2在甲狀腺乳頭狀癌、結節(jié)性甲狀腺腫及正常甲狀腺組織中的表達情況

圖3 Western blot檢測Omi/HtrA2蛋白的表達

2.2 Omi/HtrA2在甲狀腺乳頭狀癌的表達與臨床病理參數的關系

無包膜浸潤患者Omi/HtrA2的陽性率明顯高于有包膜浸潤患者，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=34.003，P＜0.01）；無淋巴結轉移患者的Omi/HtrA2陽性率明顯高于淋巴結轉移患者，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.421，P＜0.05）；Ⅰ、Ⅱ期臨床分期Omi/HtrA2的陽性率明顯高于Ⅲ、Ⅳ期臨床分期患者，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=11.710，P＜0.01）；高、中分化患者Omi/HtrA2的陽性率明顯高于低分化，差異有統(tǒng)計學意義（χ2= 6.280，P＜0.05）。Omi/HtrA2的陽性率與患者的性別、年齡、是否合并橋本甲狀腺炎和發(fā)生部位無關，組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（見表2）。

表2 Omi/HtrA2在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達與臨床病理特征的關系

3 討論

近年來，甲狀腺癌患病率呈現逐年上升的趨勢[6]，其發(fā)病機制非常復雜。細胞凋亡是通過體內外因素觸發(fā)細胞內的死亡程序從而導致細胞主動死亡，在機體的胚胎發(fā)育、內環(huán)境穩(wěn)態(tài)以及免疫防御等方面起著至關重要的作用，同時其調節(jié)紊亂與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關。Omi/HtrA2是一種高效的促凋亡因子，對多種腫瘤細胞及組織具有促凋亡作用[7-8]。Omi/HtrA2的發(fā)現是對線粒體調控細胞凋亡中心理論的完善和補充，它是一種線粒體絲氨酸蛋白酶，在生理條件下具有促進細胞存活的作用，然而在應激情況下，將成為一種促凋亡蛋白[9]。在凋亡信號的刺激下，Omi/HtrA2釋放到胞漿，轉化成具有促凋亡功能的成熟分子，進而通過依賴和非依賴半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）途徑促進細胞凋亡[10]。Caspase途徑的進行是通過成熟形式Omi/HtrA2分子的N端與凋亡抑制蛋白家族（IAPs）的BIR（桿狀病毒IAP的重復序列區(qū)）結構域相結合，從而解除IAPs對Caspase的抑制作用[11-12]。非依賴Caspase途徑促進細胞凋亡的實現與Omi/HtrA2蛋白酶活力密切相關[13]。本實驗研究，在甲狀腺乳頭狀癌中的表達情況，并深入探討參與甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生、發(fā)展及增殖惡變的分子生物學機制，有助于進一步全面明確甲狀腺乳頭狀癌的惡性生物學行為及機制，為甲狀腺乳頭狀癌患者的早期診斷、合理治療以及預后判斷找到新的靶點。

本研究運用免疫組織化學及Western-blot技術檢測Omi/HtrA2蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織、正常甲狀腺組織及結節(jié)性甲狀腺腫中的表達量，結果顯示，該蛋白在甲狀腺乳頭狀癌中的表達水平高于正常甲狀腺組織和結節(jié)性甲狀腺腫。這表明Omi/HtrA2蛋白可能參與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、發(fā)展。惡性腫瘤在發(fā)生、發(fā)展過程中逐漸獲得抵抗凋亡的能力，具有促凋亡功能的Omi/HtrA2過度表達未能阻止腫瘤的發(fā)展，其原因值得探究。研究表明，可能是由于Omi/HtrA2的表達量不足以觸發(fā)細胞死亡。TRENCIA等[14]研究也證明，腫瘤細胞中過多表達的抗凋亡蛋白ped/pea15可以抑制由Omi/HtrA2引發(fā)的細胞凋亡。因此可以認為，由Omi/HtrA2介導的促細胞凋亡作用可能依賴于其本身的活性和其他抗凋亡蛋白的水平，如IAPs。另一種可能是，一部分Omi/HtrA2被隔離在線粒體中或者不被釋放到細胞質中。LIU等[15]的研究表明，鳥核苷酸結合蛋白（RAS）通過抑制線粒體Omi/HtrA2蛋白酶釋放到細胞質中來抑制細胞凋亡。因此，線粒體中的Omi/HtrA2被封存也可能是其未能抑制腫瘤發(fā)展、轉移的原因。

筆者還進一步對Omi/HtrA2蛋白的表達與甲狀腺乳頭狀癌各臨床病理指標的關系進行分析，結果顯示，Omi/HtrA2蛋白的陽性表達與甲狀腺乳頭狀癌的包膜浸潤、淋巴結轉移、腫瘤臨床分期及腫瘤分化有關。在無包膜浸潤、無淋巴結轉移、臨床分期早和分化程度高的甲狀腺乳頭狀癌組織中，Omi/HtrA2表達相對增多，提示Omi/HtrA2與甲狀腺乳頭狀癌的進展密切相關，可能促進甲狀腺乳頭狀癌細胞的凋亡，與腫瘤細胞的抗凋亡作用相抗衡。

綜上所述，本研究結果提示，Omi/HtrA2可能是預測甲狀腺乳頭狀癌惡性生物學行為的新標志，同時其基因也是抗腫瘤靶向治療的一個新的突破點，研究針對其設計的新治療靶點，可促進腫瘤細胞的凋亡，從而達到抑制癌細胞的生長、浸潤與轉移的目的，這可能對延緩腫瘤復發(fā)、提高患者的生存率有一定的幫助。

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（張蕾 編輯）

Expression of Omi/HtrA2 protein in papillary thyroid carcinoma and its significance

Ru-hua GUAN1,Hui FANG2,Gang XU2,Ying YANG2,Mei-liu YANG2,Cui-lin ZHANG1, Li ZHOU1,Yu-kai LI3,Lei ZHOU2,Ya-zhong ZHANG2,Jin-li TIAN2,Yue YANG2
(1.Department of Endocrinology,North China University of Technology,Tangshan,Hebei, 063000,P.R.China;2.Department of Endocrinology,the Worker's Hospital of Tangshan, Tangshan,Hebei,063000,P.R.China;3.Department of Endocrinology,Hebei Medical University,Shijiazhuang,Hebei,050000,P.R.China)

【Objective】To analyze the expression of mitochondrial serine protease(Omi/HtrA2)in papillary thyroid carcinoma and its correlation with clinicopathologic parameters.【Methods】Immunohistochemistry and Western blot were used to assess the expression of Omi/HtrA2 protein in 120 cases of papillary thyroid carcinoma,40 cases of nodular goiter and 40 cases of normal thyroid tissue,and its associations with clinicopathologic parameters were analyzed.【Results】Immunohistochemistry showed the expression of Omi/HtrA2 was positive in 71.67%of the papillary thyroid carcinoma tissue,which was significantly higher than that in the nodular goiter(30.00%)and nomal thyroid tissue(32.50%,P＜0.05).Western blot showed the relative amount of Omi/HtrA2 protein in the papillary thyroid carcinoma tissue was(1.184±0.060),which was significantly higher than that in the nodular goiter(0.559±0.096)and normal thyroid tissue[(0.606±0.097),P＜0.05].The expression of Omi/HtrA2 was correlated with extracapsular invasion,lymph node metastasis,clinical staging and tumor differentiation(P＜0.05).【Conclusion】The expression of Omi/HtrA2 protein may be amarker for judging the malignancy and prognosis of papillary thyroid carcinoma.

papillarythyroidcarcinoma；mitochondrialserineprotease；immunohistochemistry；Western blot

R736.1

A

1005-8982（2015）30-0028-05

2015-04-07

房輝，E-mail：fanghui@medmail.com.cn