邱翠婷， 呂安林，李寰， 姜曉宇， 馬曉磊， 李珊， 郭顯

鈣磷誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細胞鈣化的機制研究*

邱翠婷， 呂安林，李寰， 姜曉宇， 馬曉磊， 李珊， 郭顯

目的： 探討氧化應(yīng)激損傷在鈣磷誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞（VSMCs）鈣化過程中的作用機制。

方法： 采用氯化鈣（CaCl2）聯(lián)合β-甘油磷酸鈉（β-GP）建立大鼠VSMCs鈣化模型。實驗分為4組，對照組、鈣化組、鈣化+過氧化氫（H2O2）組和鈣化+過氧化氫酶組。8天后分別通過茜素紅S染色法和鄰甲酚肽絡(luò)合酮比色法檢測各組細胞鈣結(jié)節(jié)形成及鈣含量；活性氧檢測試劑盒 （DCFH-DA探針）檢測各組細胞活性氧陽性細胞數(shù)；蛋白免疫印跡法檢測各組細胞中成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2的蛋白表達量。

結(jié)果： 鈣化組活性氧的產(chǎn)生、鈣結(jié)節(jié)、鈣含量及Runx2蛋白表達量均顯著高于對照組，鈣化+過氧化氫組與鈣化組相比，各項指標進一步升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。鈣化+過氧化氫酶組活性氧產(chǎn)生量、鈣結(jié)節(jié)、鈣含量及Runx2蛋白表達量均低于鈣化組和鈣化+過氧化氫組，仍高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但其中Runx2蛋白表達量與對照組相比則差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

結(jié)論： 氯化鈣聯(lián)合β-GP通過激活ROS-Runx2信號通路誘導(dǎo)大鼠VSMCs鈣化形成。

血管平滑肌細胞鈣化；氧化應(yīng)激；活性氧；Runx2蛋白

Methods: The VSMC calcification was induced by incubating the cells with calcium chloride (CaCl2) and β-sodium glycerophosphate (β-GP) for 8 days, and the cells were divided into 4 groups:①Control group,②Calcification group,③Calcification + H2O2group,④Calcification + catalase group. The calcium nodule formation and calcium deposition in VSMC were detected by Alizarin red staining and o-cresolphthalein complexone method, the reactive oxygen species (ROS) was detected by DCFH-DA probe staining and the protein expression of Runx2 was examined by Western blot analysis.

Results: Compared with Control group, Calcification group showed the higher ROS production, more calcium nodule and calcium deposition, higher Runx2 protein expression; while compared with Calcification group, the above indexes were even higher in Calcification + H2O2group, P＜0.05. The ROS production, calcium nodule, calcium deposition and Runx2 protein expression were lower in Calcification + catalase group than those in Calcification group and Calcification + H2O2group, but still higher than that in Control group. The protein expression of Runx2 was similar between Calcification + catalase group and Control group, P＞0.05.

Conclusion: CaCl2and β-GP treatment may induce VSMC calcification via activating ROS-Runx2 signal pathway in experimental rats.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:64.)

糖尿病、慢性腎功能不全的患者隨著病情的逐漸發(fā)展會出現(xiàn)不同程度的血管鈣化現(xiàn)象。最新研究表明，血管鈣化并非簡單地由于磷酸鈣晶體被動沉積于血管壁，其形成過程類似于骨發(fā)育，鈣化的主要環(huán)節(jié)是血管平滑肌細胞（VSMCs）在病理因素影響下向具有合成和分泌功能的成骨樣細胞分化，合成并分泌骨形成相關(guān)蛋白[1,2]。近來研究發(fā)現(xiàn)該過程與氧化應(yīng)激損傷具有密切的關(guān)系，慢性腎功能不全的患者機體鈣磷代謝紊亂，過量的鈣（Ca2+）和磷（Pi）會引起細胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，細胞內(nèi)活性氧（ROS）產(chǎn)生增加[3]。過氧化氫（H2O2）是一種能夠自由通過細胞膜的ROS,參與細胞內(nèi)多條信號通路的調(diào)控。成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2是調(diào)節(jié)成骨細胞和軟骨細胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在動脈粥樣硬化患者的血管壁中及小鼠鈣化的主動脈管壁中均發(fā)現(xiàn)Runx2的高表達，而正常的血管壁中則未發(fā)現(xiàn)其表達。本研究擬通過氯化鈣（CaCl2）聯(lián)合β-甘油磷酸鈉（β-GP）建立VSMCs鈣化模型，明確ROS對VSMCs鈣化的影響及ROS-Runx2通路在其中的作用。

1 材料與方法

材料與主要試劑：2013-11至2014-09選擇雄性SD大鼠，4周齡，體重80～100g（購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心）。CaCl2、β-GP及茜素紅S（Sigma）。改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基DMEM（Hyclone，中國北京）。胎牛血清（FBS，Hyclone，中國北京）?；钚匝鯔z測試劑盒（S0033，碧云天生物公司）。鈣測定試劑盒（鄰甲酚肽絡(luò)合酮比色試劑盒，北京中生北控生物公司）。Runx2抗體（ Cell Signaling Technology，美國）。

大鼠VSMCs的培養(yǎng)： 無菌條件下分離大鼠胸主動脈，完整剝?nèi)ネ饽?，將血管剪? mm長的動脈環(huán)接種于細胞培養(yǎng)瓶中，用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)（含45 g/L葡萄糖，100 U/L青霉素及鏈霉素，20%胎牛血清），置于37 ℃含5% CO2孵箱中培養(yǎng)，3～5 d后更換培養(yǎng)基。經(jīng)形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)法鑒定為VSMCs。實驗取用3～8代的VSMCs[4]。

細胞鈣化模型的建立及實驗分組： 將細胞以5×104/L接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后用含終濃度7.2 mM CaCl2和10 mM β-GP的高糖DMEM聯(lián)合誘導(dǎo)8 d，每2 d更換一次培養(yǎng)基[3]。分別取6孔板中正常培養(yǎng)的VSMCs隨機分4組：對照組；鈣化組；鈣化+過氧化氫組；鈣化+過氧化氫酶組，其中過氧化氫和過氧化氫酶分別在鈣化誘導(dǎo)第一天與鈣化培養(yǎng)基同時干預(yù)細胞。各組設(shè)置平行實驗進行重復(fù)檢測并分別進行3次獨立實驗。

細胞內(nèi)活性氧檢測： 將細胞以5×104/L接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后施加干預(yù)，以上4組每組設(shè)6個復(fù)孔。48 h后，去除細胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的活性氧熒光DCFH-DA探針，無血清培養(yǎng)基1:1000稀釋，37℃孵育20 min。無血清培養(yǎng)基洗滌3次，以充分去除未進入細胞的DCFH-DA探針。激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照[5]。

細胞鈣化鑒定及檢測:①茜素紅S染色：細胞干預(yù)8 d后，4 ℃磷酸緩沖液洗滌3次，多聚甲醛固定20 min，加入1% 茜素紅S（1 g茜素紅S，100 ml蒸餾水），室溫下孵育20 min，磷酸緩沖液沖洗3次，普通光學(xué)顯微鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)被染成紅色[6]。②細胞鈣沉積含量檢測：以上4組每組設(shè)6個復(fù)孔，細胞干預(yù)8 d后，4 ℃磷酸緩沖液洗滌3次，0.6 M HCl 37 ℃孵育24 h脫鈣，次日收集上清液用于鈣含量檢測。將6孔板中的細胞洗滌3次，加入1 M NaOH/0.1% SDS裂解細胞，提取上清液，BCA法檢測細胞蛋白含量[7]。用每孔細胞的蛋白含量對鈣含量進行標準化（鈣含量/蛋白含量）[8]。

蛋白免疫印跡法（Western blot） 檢測Runx2蛋白表達水平:取各組6 孔培養(yǎng)板中密度達1×107/L的VSMCs，預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS） 洗滌3次后，加入160～180微升裂解液，提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，計算各組上樣量，8% 聚丙烯酰胺凝膠（SDS- PAGE）電泳、轉(zhuǎn)膜3 h、5%牛奶封閉、加兔抗鼠Runx2蛋白I抗（1:1500稀釋）、4 ℃孵育過夜、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔Ig G 孵育1 h。Bio-Rad蛋白成像儀顯像。Image J軟件分析蛋白條帶積分吸光度值（IA），以目的蛋白IA 值/β-actin IA 值的比值反映目的蛋白相對水平。

統(tǒng)計學(xué)處理:計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示。采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

VSMCs中 ROS檢測：對照組中ROS陽性細胞數(shù)為4±2.73，而鈣化組中ROS陽性細胞數(shù)增多39±4.32，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（n=3，P=0.006）。

鈣化+過氧化氫組中ROS陽性細胞數(shù)進一步增加74±8.74，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0091），而使用過氧化氫清除劑—鈣化+過氧化氫酶組ROS陽性細胞數(shù)為10±3.29，較鈣化組顯著減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0057）,以上數(shù)值均檢測三次，取其平均值。圖1

圖1 激光共聚焦顯微鏡觀察各組血管平滑肌細胞中細胞內(nèi)活性氧表達，細胞內(nèi)活性氧陽性細胞呈綠色熒光（×200）

鈣化形態(tài)學(xué)及鈣含量檢測：鈣化組鈣結(jié)節(jié)形成，鈣含量為（71.70±7.81）μg/mg蛋白，比對照組（2.99±0.4）μg/mg蛋白顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0001），鈣化+過氧化氫組鈣結(jié)節(jié)形成[鈣含量為（111.3±21.34）μg/mg蛋白]較鈣化組增加差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.03），鈣化+過氧化氫酶組鈣結(jié)節(jié)形成較少，鈣含量為（37.29±8.29）μg/mg蛋白，與鈣化組和鈣化+過氧化氫組相比均顯著降低,與對照組相比仍升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0064；P=0.0025）。圖2

圖2 茜素紅S染色法檢測各組血管平滑肌細胞鈣結(jié)節(jié)形成

Runx2的蛋白表達定量分析：蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，在56 kDa（Runx2）處可見穩(wěn)定的特異性條帶。各組目的蛋白灰度值與β-actin（43 kDa）的灰度值比較計算相對灰度值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鈣化組Runx2蛋白表達（相對灰度值為0.58±0.029）較對照組（0.27±0.025）升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0005），鈣化+過氧化氫組Runx2蛋白表達（0.79±0.036）較鈣化組相比進一步升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.003），而鈣化+過氧化氫酶組Runx2蛋白表達（0.36±0.029）與鈣化組及鈣化+過氧化氫組相比均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0032，P=0.0001），與對照組相比則差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P=0.073） 。圖3

圖3 蛋白免疫印跡法檢測各組血管平滑肌細胞中Runx2蛋白表達（n=3）

3 討論

高膽固醇血癥、高血壓、糖尿病和慢性腎功能不全的晚期患者發(fā)生心血管事件風(fēng)險增加，血管鈣化被認為是其心血管疾病發(fā)病率和死亡率的獨立危險因素[9,10]，血管鈣化也是評價糖尿病及慢性腎功能不全患者的一項預(yù)后指標[11]。因此預(yù)防和治療血管鈣化對于原發(fā)病的發(fā)展和預(yù)后均具有重要的臨床意義[12]。

當(dāng)機體發(fā)生不同程度氧化應(yīng)激損傷，大量ROS的產(chǎn)生在血管鈣化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，也與 ROS影響細胞內(nèi)成骨蛋白的表達有關(guān)[3,13]。Miller等[14]研究證實了ROS在不同種類瓣膜鈣化發(fā)病過程中的起重要作用，如ROS能夠促進主動脈瓣鈣化，并導(dǎo)致主動脈瓣狹窄。慢性腎功能不全患者高血磷高血鈣，糖尿病患者體內(nèi)終末期糖基化產(chǎn)物堆積導(dǎo)致的血管鈣化與氧化應(yīng)激損傷有關(guān)

[1,5]。本研究采用CaCl2和β-GP聯(lián)合誘導(dǎo)VSMCs，并成功建立VSMCs鈣化模型，同時發(fā)現(xiàn)鈣化組ROS升高。為了進一步證實ROS在鈣化形成過程中的作用，本研究在Ca2+和Pi干預(yù)的基礎(chǔ)上加入0.2 mM H2O2，發(fā)現(xiàn)細胞中ROS產(chǎn)生量增加，且鈣化程度較單純Ca2+和Pi聯(lián)合誘導(dǎo)組的鈣化程度加重。過氧化氫酶是細胞內(nèi)過氧化氫的清除劑，催化過氧化氫分解成水和氧氣，因此我們在Ca2+和Pi存在的基礎(chǔ)上又加入過氧化氫酶，發(fā)現(xiàn)細胞中ROS顯著減少，同時鈣結(jié)節(jié)和鈣含量與鈣化組相比也顯著減少。

H2O2是ROS中較常見的形式之一。大量研究證實H2O2作為第二信使參與氧化應(yīng)激損傷的過程，而VSMCs鈣化又與氧化應(yīng)激損傷具有密切關(guān)系。Runx2是調(diào)節(jié)成骨細胞和軟骨細胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，由此推論H2O2作為第二信使上調(diào)成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2在VSMCs中的表達，從而促使VSMCs由收縮表型向成骨樣細胞轉(zhuǎn)化[15,16]。本研究發(fā)現(xiàn)Ca2+和Pi聯(lián)合誘導(dǎo)VSMCs中成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2蛋白表達量升高，為了證實ROS在VSMCs鈣化形成中的作用，我們分別通過促進或減少ROS的表達，即在Ca2+和Pi干預(yù)的基礎(chǔ)上分別加入H2O2和過氧化氫酶，檢測VSMCs中Runx2的蛋白表達量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入H2O2后與Ca2+和Pi聯(lián)合誘導(dǎo)的VSMCs相比Runx2蛋白表達量進一步升高，而使用過氧化氫酶的VSMCs中Runx2蛋白表達量降低，并與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

本研究證實了VSMCs鈣化形成與氧化應(yīng)激損傷有關(guān)，ROS作為第二信使激活VSMCs中成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2的表達，由具有收縮表型的平滑肌細胞向成骨樣細胞轉(zhuǎn)變并促使鈣化形成[17]。此外，我們在實驗中還發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷可造成細胞超微結(jié)構(gòu)如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹和溶解，進而造成細胞發(fā)生程序性死亡—凋亡，且大量研究證實凋亡與VSMCs鈣化形成密切相關(guān)[7,18,19]，因此，氧化應(yīng)激損傷是否通過多條途徑促進VSMCs鈣化形成還有待進一步深入研究，進而探明動脈鈣化的重要發(fā)病機理，為動脈鈣化提供新的治療靶點。

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Investigation for the Mechanism of Vascular Smooth Muscle Cell Calcification Induced by Calcium and Phosphorus in Experimental Rats

QⅠU Cui-ting, LV An-lin, LⅠ Huan, JⅠANG Xiao-yu, MA Xiao-lei, LⅠ Shan, GUO Xian.
Department of Cardiology, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi’an (710032) Shaanxi, China
Co-corresponding Authors: LV An-lin, Email: lvanlin@fmmu.edu.cn and LⅠ Huan, Email: lihuan816@yahoo.com

Objective: To explore the effect of oxidative stress injury on the mechanism of vascular smooth muscle cell (VSMC) calcification induced by calcium and phosphorus in experimental rats.

Vascular smooth muscle cell calcification; Oxidative stress; Reactive oxygen species; Runx2 protein

2014-08-29）

（編輯：汪碧蓉）

國家自然科學(xué)基金（NO.81170256）；陜西省科技計劃項目（項目編號：2009K13-01）

710032 陜西省西安市，中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院 心內(nèi)科

邱翠婷 碩士研究生 主要從事動脈鈣化研究 Email：qiucuiting87410@163.com 通訊作者：呂安林 Email：lvanlin@fmmu.edu.cn 李寰Email：lihuan816@yahoo.com

R54

A

1000-3614( 2015 ) 01-0064-04

10.3969/ j. issn. 1000-3614. 2015.01.017