張晶晶 曲 頌 雷 風(fēng) 葉奕菁 陸小軍

拉米夫定對乙型肝炎病毒 轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞放射敏感性的影響※

張晶晶1曲 頌2雷 風(fēng)1葉奕菁1陸小軍1

目的 探討拉米夫定對乙型肝炎病毒（HBV）轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞放射敏感性的影響。方法 拉米夫定對HBV轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞的抑制效果采用熒光定量PCR檢測，拉米夫定對HBV轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞放射敏感性的影響采用平板克隆觀察，癌細(xì)胞凋亡率采用流式細(xì)胞儀檢測。結(jié)果 HBV病毒抑制率隨著拉米夫定的濃度和作用時(shí)間增加而變大，拉米夫定和照射均能促進(jìn)HBV轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞的凋亡，降低乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸（HBV-DNA）的表達(dá)水平。結(jié)論 拉米夫定能夠抑制HBV復(fù)制，增強(qiáng)HBV轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞的放射敏感性，可能與增強(qiáng)放射誘導(dǎo)有關(guān)。

拉米夫定；乙型肝炎病毒；癌細(xì)胞；輻射耐受性

肝細(xì)胞癌屬于放射敏感腫瘤，目前放射治療是肝癌最有效的方法，能夠提高患者的生活質(zhì)量[1-3]。拉米夫定屬于胞嘧啶核苷衍生物，起效非?？?，是當(dāng)前抑制乙型肝炎病毒（HBV）復(fù)制的重要藥物，能夠抑制脫氧核糖核酸（DNA）的合成[4-5]。為分析拉夫米定的放射增敏效應(yīng)，現(xiàn)將拉夫米定作用于HBV轉(zhuǎn)染的肝癌細(xì)胞系HepG2215細(xì)胞中，通過流式細(xì)胞儀以及熒光定量 PCR等研究拉米夫定是否具有放射增敏作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料 采用 HBV轉(zhuǎn)染的肝癌細(xì)胞系HepG2215細(xì)胞株分析。細(xì)胞培養(yǎng)采用 Solarbio公司生產(chǎn)的DMEM培養(yǎng)基、Hyclone公司生產(chǎn)的胎牛血清、Solarbio公司生產(chǎn)G418、北京全式生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)胰蛋白酶、Sigma公司生產(chǎn)二甲基亞礬（DMSO）、噻唑藍(lán)溶液（MTT）等。

1.1.2 試驗(yàn)儀器 實(shí)驗(yàn)室使用的儀器主要包括蘇州凈化設(shè)備廠產(chǎn)超凈工作臺(tái)、上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠生產(chǎn)電熱恒溫烘箱、海爾公司產(chǎn)－20 ℃冰箱、微波爐、MJ Research公司產(chǎn)酶聯(lián)免疫檢測儀、珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司產(chǎn)UV-型紫外分析儀。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HBV轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞用10%胎牛血清及G418 380 μg/ml在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，放置于37 ℃的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每隔2個(gè)月篩選1次，后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作均采用含10%胎牛血清在DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。將肝癌細(xì)胞放置在紫外燈下照射30 min，向離心管中加入DMEM培養(yǎng)基溶液2 ml，取出細(xì)胞，迅速放入電熱恒溫水槽中，待融化后將細(xì)胞懸液放置在離心管中，離心半徑3 cm，1 000 r/min，離心5 min取下層沉淀，放置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，瓶口消毒，次日在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。取對數(shù)生長期細(xì)胞，細(xì)胞增至80%時(shí)次日凍存，滴加1 ml胰酶消化細(xì)胞，加入培養(yǎng)液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞數(shù)，離心5 min，加入新鮮配置的細(xì)胞凍存液，調(diào)整細(xì)胞濃度，分裝于凍存管內(nèi)，觀察細(xì)胞生長情況。取對數(shù)期生長的肝癌細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)采用血球計(jì)數(shù)板，稀釋，將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×104個(gè)/ml，設(shè)置空白凋零孔，不接種細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后從培養(yǎng)中取出放入96孔板中，加入20 μl MTT溶液，用針頭去除上清液。

1.2.2 細(xì)胞照射 細(xì)胞照射劑量分別為0、2、4、6、8 Gy，照射野為10 cm×10 cm，在培養(yǎng)皿中加等效膜，保證照射野劑量均勻。

1.2.3 拉米夫定濃度和作用時(shí)間的確定 取對數(shù)期肝癌細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞接種至培養(yǎng)皿中，加入不同濃度的拉夫米定，濃度分別設(shè)定為 0.0、

2.5、5.0、10.0、25.0 μg/ml，藥物作用24 h和48 h，提取培養(yǎng)皿上清液加入等量DNA濃縮液，離心去除上清液。在DNA提取液中加入HBV陰性質(zhì)控品，保存檢測數(shù)據(jù)。

1.2.4 拉夫米定對細(xì)胞放射敏感性的影響 采用平板克隆法測定，拉夫米定的濃度設(shè)定為10 μg/ml，分為加藥照射組、空白對照組、單純照射組和單純加藥組。單純照射組、加藥照射組采用X線照射細(xì)胞，細(xì)胞照射后繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞克隆情況，將細(xì)胞克隆數(shù)據(jù)換算成細(xì)胞生存率。按照單擊多靶模型公式以最小誤差法進(jìn)行肝癌細(xì)胞放射-生存曲線的擬和，根據(jù)放射曲線圖求得各參數(shù)值。

1.2.5 細(xì)胞凋亡率變化 采用 0.25%胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，盡快測定各組細(xì)胞凋亡率，重復(fù)3次。

1.2.6 RNA表達(dá)變化 提取總組細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄成DNA，利用Band leader 3.0圖像處理軟件分析各組細(xì)胞HBV-RNA的相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞生長狀況 用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞呈島狀聚集生長，大小不一，細(xì)胞接種2 d后增殖旺盛，呈對數(shù)期生長。

2.2 拉米夫定抑制HBV復(fù)制的作用 HBV抑制率隨著拉米夫定濃度的增加而變大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；HBV抑制率隨著拉米夫定作用時(shí)間的延長而增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 拉米夫定不同濃度時(shí)抑制HBV復(fù)制 的作用(%,±s)

濃度(μg/ml) 24 h抑制率 48 h抑制率 0.0 0.8±0.2 1.3±0.1 2.5 0.8±0.1 1.4±0.2 5.0 1.2±0.1 2.1±0.4 10.0 1.4±0.3 2.5±0.6 25.0 1.5±0.4 2.9±0.4

2.3 拉米夫定對HBV轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞放射敏感性的影響 加藥照射組的D0值、Dq值、N值、SF2值明顯低于單純照射組，SER值＞1，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表2。

表2 兩組拉米夫定對HBV轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞放射敏感性的影響

2.4 細(xì)胞凋亡率變化 空白對照組細(xì)胞凋亡率為（1.3±0.7）%，單純加藥組細(xì)胞凋亡率為（11.8± 1.5）%，單純照射組細(xì)胞凋亡率為（16.1±4.4）%，加藥照射組細(xì)胞凋亡率為（21.9±2.3）%，加藥照射組細(xì)胞凋亡率明顯高于其他各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5 拉米夫定和照射對HBV-RNA表達(dá)的影響 拉米夫定和照射均能降低HBV轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞的RNA表達(dá)水平，加藥照射組的 RNA相對表達(dá)值明顯低于其他各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 4組拉米夫定和照射對HBV-RNA表達(dá)的影響

3 討論

肝細(xì)胞癌屬于放射敏感腫瘤，主要是由慢性HBV感染所致，當(dāng)前肝癌的治療方法主要包括手術(shù)治療、放射治療等[6]。研究表明，HBV可能通過DNA整合插入宿主基因中導(dǎo)致癌癥的出現(xiàn)。拉米夫定屬于胞嘧啶核苷衍生物，能夠抑制DNA的合成，對癌細(xì)胞放射敏感性的影響有著非?，F(xiàn)實(shí)的意義。

本研究分析了拉米夫定對乙型肝癌細(xì)胞放射敏感性的影響，通過熒光定量法檢測拉夫米定對DNA的影響，結(jié)果表明10 μg/ml拉米夫定作用48 h具有最高的抑制效率。張娟等[7]研究結(jié)果也表明，拉米夫定對乙型肝炎相關(guān)癌細(xì)胞具有放射增敏作用。在以往的研究中對拉米夫定的放射增敏機(jī)制的研究非常少，很少推測細(xì)胞凋亡與增敏機(jī)制的相關(guān)性。在本研究中采用流式檢測法分析拉米夫定和照射對HBV轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞凋零的影響，結(jié)果表明拉米夫定能夠抑制HBV轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞的增值。有研究發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞生長周期中D1是細(xì)胞周期的關(guān)鍵期[8-9]，在本研究中，拉米夫定是否通過降低癌細(xì)胞D1的表達(dá)來增強(qiáng)HBV轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞的放射敏感性，還需相關(guān)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，拉米夫定能夠抑制HBV復(fù)制，增強(qiáng)乙型肝炎相關(guān)癌細(xì)胞的放射敏感性，為臨床抗HBV的治療提供了理論依據(jù)，在本研究中未分析拉米夫定對HBV轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞周期的影響，仍需進(jìn)一步完善。

[1]李井華,黃龍生,張吉翔.拉米夫定治療失代償期乙型肝炎肝硬化的療效觀察[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué),2012,18(19):155-156.

[2]蔡承紅,李朝霞,厲景南.抗結(jié)核藥物聯(lián)用拉米夫定治療和護(hù)理肺結(jié)核并乙肝病毒攜帶者85例效果[J].中國鄉(xiāng)村醫(yī)藥,2014,17(14): 5-6,10.

[3]趙波.拉米夫定聯(lián)合阿德福韋酯在失代償期乙型肝炎肝硬化患者中的應(yīng)用效果[J].河北醫(yī)藥,2014,36(2):187-188.

[4]彭玲珍.拉米夫定對人乙肝病毒相關(guān)肝癌細(xì)胞放射敏感性的影響及機(jī)制研究[D].南昌大學(xué),2012.

[5]李河博,周光耀.恩替卡韋與拉米夫定治療慢性乙型肝炎療效比較[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2014(22):3448-3449.

[6]趙紫煙.拉米夫定治療失代償期乙肝肝硬化的臨床治療進(jìn)展[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué),2011,17(13):65-66.

[7]張娟,陳建宗,張金平,等.黃芪甲甙體外抗乙型肝炎病毒的作用[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,28(24):2291-2293.

[8]李玲玲,華海清,秦叔逵.以毒攻毒法治療原發(fā)性肝癌獲長期生存1例[J].中醫(yī)雜志,2014,55(1):89-90.

[9]劉百舸,陳靜.拉米夫定聯(lián)合阿德福韋酯治療乙肝抗病毒初治癥的療效觀察[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué),2013,19(11):53-53.

R512.6+2;R735.7

A

1673-5846(2015)05-0031-03

1中山市人民醫(yī)院腫瘤放療科，廣東中山 528403

2廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療科，廣西南寧 530021

中山市科技計(jì)劃項(xiàng)目（20132A083）

張晶晶（1981-），雙博士學(xué)位

陸小軍（1957-），主任醫(yī)師。E-mail：L6993@163.com