黃 勇綜述 曹式麗審校

◇綜 述◇

足細(xì)胞自噬在足細(xì)胞病中的研究進(jìn)展

黃 勇1綜述 曹式麗2審校

對(duì)近年來(lái)足細(xì)胞自噬在足細(xì)胞病中的作用及其機(jī)制的研究進(jìn)行了概述，闡述了哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路在足細(xì)胞自噬中扮演的角色。足細(xì)胞自噬活性的改變與足細(xì)胞病的進(jìn)程密切相關(guān)，mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)的自噬途徑是足細(xì)胞保持自身穩(wěn)定的重要調(diào)節(jié)器，以調(diào)控足細(xì)胞自噬平衡體系為干預(yù)靶點(diǎn)可能成為足細(xì)胞病防治的新靶點(diǎn)。

自噬；足細(xì)胞自噬；足細(xì)胞?。籱TOR

足細(xì)胞即腎小球臟層上皮細(xì)胞，是一種高度分化的終末細(xì)胞，其結(jié)構(gòu)和功能的正常對(duì)維持腎小球?yàn)V過(guò)屏障的完整性非常重要。自噬是近年來(lái)細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。自噬過(guò)度、障礙造成的細(xì)胞損傷及其誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡在疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。自從發(fā)現(xiàn)腎小球足細(xì)胞中存在自噬現(xiàn)象，足細(xì)胞自噬在足細(xì)胞病發(fā)生、發(fā)展中所扮演的角色已成為新的研究方向。該文就近年來(lái)足細(xì)胞自噬在足細(xì)胞病中的研究進(jìn)展及哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路在足細(xì)胞自噬中扮演的角色進(jìn)行闡述。

1 自噬與細(xì)胞的生理病理

自噬是一種廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)溶酶體依賴性蛋白及細(xì)胞器的分解代謝途徑。目前研究將自噬分為三種：巨自噬、微自噬和分子伴侶自噬［1］。其中巨自噬指細(xì)胞質(zhì)中可溶性蛋白和變性壞死的細(xì)胞器被非溶酶體來(lái)源的雙層膜結(jié)構(gòu)所包裹，繼而被溶酶體內(nèi)水解酶降解的過(guò)程；微自噬中溶酶體膜內(nèi)疊，使得一部分細(xì)胞質(zhì)直接進(jìn)入溶酶體腔而被分解；分子伴侶自噬需要細(xì)胞質(zhì)可溶性蛋白直接通過(guò)溶酶體膜，預(yù)先有伴侶分子將目標(biāo)蛋白解構(gòu)變性。而自噬通常是指巨自噬，是其中研究最多的一種。自噬是胞質(zhì)中大分子物質(zhì)和細(xì)胞器在雙層膜包囊泡中大量降解的生物學(xué)過(guò)程，其過(guò)程大致包括4個(gè)階段［2］：①隔離膜的形成：在饑餓、氧化應(yīng)激損傷等自噬誘導(dǎo)因素的刺激下，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的非核糖體區(qū)域、高爾基體等來(lái)源的自噬體膜脫落形成杯狀隔離膜，包裹在需降解的蛋白質(zhì)或細(xì)胞器周圍；②自噬體的形成：隔離膜逐漸延伸，將需降解的底物完全包繞形成自噬體；③自噬性溶酶體的形成：自噬體通過(guò)細(xì)胞骨架微管系統(tǒng)將其包裹的底物運(yùn)輸至溶酶體，并與之融合形成自噬性溶酶體；④自噬體內(nèi)容物的降解：自噬體與溶酶體融合后，自噬體內(nèi)膜及其內(nèi)容物被溶酶體中多種蛋白水解酶降解，自噬體膜脫落循環(huán)利用。

生理狀態(tài)下，幾乎所有細(xì)胞都存在基礎(chǔ)水平的自噬。正常水平的自噬可以清除未折疊或折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)，降解蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨基酸等供細(xì)胞再循環(huán)，從而維持細(xì)胞生存及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。自噬可被多種因素激活，如營(yíng)養(yǎng)或生長(zhǎng)因子缺乏、缺氧、活性氧刺激、DNA損傷、蛋白質(zhì)聚集、細(xì)胞器損傷或細(xì)胞內(nèi)病原體侵襲等因素［3］。在大多數(shù)情況下，自噬參與細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)，幫助細(xì)胞適應(yīng)營(yíng)養(yǎng)變化，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，延續(xù)細(xì)胞生命，是細(xì)胞對(duì)外界因素刺激的一種適應(yīng)性反應(yīng)，是細(xì)胞的一種自我保護(hù)機(jī)制，可阻抑有害應(yīng)激所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［4］。對(duì)于腫瘤細(xì)胞，自噬具有抑制和促進(jìn)的雙重作用，如在腫瘤發(fā)生初期自噬活性的增強(qiáng)可作為一種抑制因素，而在腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中卻可為腫瘤擴(kuò)增提供營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，而且自噬在不同類型腫瘤中扮演的角色亦不相同［5］。因此，自噬與細(xì)胞的生理和病理關(guān)系密切。目前研究對(duì)自噬在疾病中所扮演的角色尚無(wú)定論，探索其在不同疾病中的作用及其具體作用機(jī)制具有重要意義。

2 足細(xì)胞自噬與足細(xì)胞病

2002年足細(xì)胞病的概念首次被提出，以腎小球足細(xì)胞數(shù)量和（或）密度減少、腎小球基底膜增厚、腎小球基質(zhì)成分改變、足突融合等為特征的腎小球疾病統(tǒng)稱為足細(xì)胞病。足細(xì)胞是一種高度分化的終末細(xì)胞，其足突包繞在腎小球基底膜上，形成裂孔隔膜復(fù)合體，其結(jié)構(gòu)的完整性與腎小球?yàn)V過(guò)屏障功能的正常密切相關(guān)。足細(xì)胞的損傷和缺失是導(dǎo)致腎臟疾病發(fā)生及發(fā)展至腎功能衰竭的主要原因，足細(xì)胞數(shù)量的減少是預(yù)測(cè)腎臟疾病進(jìn)展的重要指標(biāo)［6］。成熟足細(xì)胞缺失后僅能依賴于足細(xì)胞的祖細(xì)胞再生，其再生能力極其微弱。且初始的局部損傷的足細(xì)胞可產(chǎn)生“多米諾效應(yīng)”，將損傷信號(hào)傳遞至正常足細(xì)胞，使疾病迅速發(fā)展至腎小球硬化［7］。因此，維護(hù)足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的正常，阻抑足細(xì)胞的損傷是腎臟病防治的重要環(huán)節(jié)。

自噬在腎臟疾病的研究已歷經(jīng)半世紀(jì)。1956年，Clark［8］通過(guò)電鏡觀察到小鼠腎組織細(xì)胞中存在大量具有膜性結(jié)構(gòu)的致密體，并發(fā)現(xiàn)其胞質(zhì)中常含有類似于線粒體的結(jié)構(gòu)。當(dāng)時(shí)學(xué)者們對(duì)自噬了解尚少，對(duì)自噬這一現(xiàn)象也沒(méi)有明確定義。1983年，Berkenstam et al［9］從大鼠近端腎小管細(xì)胞中分離出自噬性囊泡，證明大鼠腎臟固有細(xì)胞中存在自噬現(xiàn)象，自噬在腎臟病領(lǐng)域開(kāi)始受到關(guān)注。2003年Asanuma et al［10］發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞的分化和損傷修復(fù)過(guò)程存在自噬現(xiàn)象。加之同期足細(xì)胞病概念的提出，使得眾多研究者開(kāi)始探索足細(xì)胞自噬在足細(xì)胞病中所扮演的角色。Mizushima et al［11］通過(guò)綠色熒光蛋白標(biāo)記LC3（green fluorescent protein marked LC3，GFPLC3）轉(zhuǎn)基因小鼠模型發(fā)現(xiàn)腎小球足細(xì)胞顯著表達(dá)自噬，提示足細(xì)胞中存在基礎(chǔ)自噬活性。Hartleben et al［12］用GFP-LC3作為自噬體免疫熒光標(biāo)志物來(lái)檢測(cè)機(jī)體內(nèi)自噬水平，發(fā)現(xiàn)腎小球足細(xì)胞中LC3-Ⅱ的堆積速度明顯高于腎臟其他細(xì)胞，說(shuō)明足細(xì)胞相比于腎臟其他細(xì)胞表達(dá)出更高的自噬水平。且足細(xì)胞基礎(chǔ)自噬活性是維持足細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能完整性的重要機(jī)制，足細(xì)胞自噬平衡體系失衡會(huì)增加腎小球疾病易感性。糖尿病腎病是一種常見(jiàn)的足細(xì)胞病，高糖刺激可以引起足細(xì)胞自噬活性受到抑制，給糖尿病小鼠腹腔注射雷帕霉素可以減輕腎小球病理改變和足細(xì)胞損傷，其作用可能與促進(jìn)足細(xì)胞自噬有關(guān)［13］。在腎活檢病理表現(xiàn)為微小病變（minimal change disease，MCD）的患者中，足細(xì)胞自噬相關(guān)基因Beclin-1表達(dá)明顯高于局灶節(jié)段性腎小球硬化（focal segmental glomerular sclerosis，F(xiàn)SGS）患者，且對(duì)MCD患者重復(fù)腎活檢時(shí)發(fā)現(xiàn)，Beclin-1表達(dá)無(wú)明顯變化者其病理類型仍為MCD，而B(niǎo)eclin-1表達(dá)明顯下降、足細(xì)胞自噬活性降低者腎臟病理已轉(zhuǎn)化為FSGS［14］，說(shuō)明足細(xì)胞自噬活性的改變與足細(xì)胞病的進(jìn)程密切相關(guān)。上述研究結(jié)果提示：以調(diào)控足細(xì)胞自噬平衡體系為干預(yù)靶點(diǎn)或可為足細(xì)胞病的治療提供新的可行途徑。

3 m TOR信號(hào)通路——足細(xì)胞自噬“調(diào)節(jié)器”

細(xì)胞通過(guò)自噬來(lái)循環(huán)利用破損和無(wú)用的細(xì)胞器及大分子，同時(shí)產(chǎn)生能量，并恢復(fù)正常生長(zhǎng)所需要的構(gòu)件前體。mTOR和細(xì)胞自噬有著緊密聯(lián)系，在mTOR和細(xì)胞自噬聯(lián)系出現(xiàn)缺陷的地方，可引起腫瘤和神經(jīng)退行性病變等一系列疾病的發(fā)生［15］。mTOR是細(xì)胞內(nèi)一種高度保守的絲／蘇氨酸（Ser／Thr）蛋白激酶，其作為能量代謝的調(diào)控器，可整合營(yíng)養(yǎng)、生長(zhǎng)因子以及多種細(xì)胞外信號(hào)，參與基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)的翻譯、核糖體的合成等生物過(guò)程，在維持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮著重要的作用［15］。參與調(diào)節(jié)足細(xì)胞自噬平衡體系的分子系統(tǒng)非常復(fù)雜，目前研究主要集中在mTOR、核轉(zhuǎn)錄因子等信號(hào)通路。其中，mTOR是生理及應(yīng)激條件下協(xié)調(diào)生長(zhǎng)與自噬之間平衡的關(guān)鍵成分，是多條信號(hào)通路的匯聚點(diǎn)，成為目前自噬相關(guān)信號(hào)通路研究的熱點(diǎn)。

mTOR屬磷脂酰肌醇激酶（phosphoinositide-3 kinase ELISA Kit，PI3K）相關(guān)蛋白激酶家族，具有Ser／Thr蛋白激酶活性，能磷酸化蛋白底物的Ser／Thr殘基。細(xì)胞內(nèi)存在mTOR復(fù)合物1（mTOR complex 1，mTORC1）和mTOR復(fù)合物2（mTOR complex 2，mTORC2）兩種復(fù)合體。mTORC1復(fù)合體由mTOR蛋白和分別對(duì)復(fù)合體起正負(fù)調(diào)節(jié)作用的mTOR調(diào)控相關(guān)蛋白R(shí)aptor、Deptor等附屬蛋白組成，主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡、能量代謝和細(xì)胞自噬等［16］。mTORC2構(gòu)成包括Rictor及mSin1，通過(guò)磷酸化蛋白激酶C-a（protein kinase phosphorylation ca，PKC-a）通路來(lái)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白，在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架、細(xì)胞存活及代謝等方面發(fā)揮重要作用［17］。由于mTOR-Rictor復(fù)合物不能結(jié)合FKBP12-雷帕霉素耦聯(lián)體，mTORC2對(duì)雷帕霉素表現(xiàn)為不敏感。而最近研究［18］顯示延長(zhǎng)雷帕霉素治療時(shí)間可以影響Rictor與mTORC2的結(jié)合。細(xì)胞自噬的起始階段是由ULK1及VPS34兩種蛋白激酶調(diào)控，ULK1是VPS34的上游蛋白，ULK1會(huì)在細(xì)胞缺乏營(yíng)養(yǎng)的時(shí)候激活，ULK1和VPS34的激活使自噬基因（autophagy-related gene，ATG）蛋白聚集形成吞噬泡膜從而促進(jìn)自噬體的成熟，同時(shí)，ULK1和VPS34還能與mTORC1信號(hào)產(chǎn)生相互作用從而影響自噬［19］。mTORC1參與自噬的調(diào)節(jié)與PI3K／蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路密切相關(guān)。磷酸肌醇三磷酸（inositol triphosphate phosphate，PI3P）在這個(gè)過(guò)程中是一個(gè)重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，其可與多種具有同源性底物的蛋白質(zhì)相結(jié)合，如磷脂酰肌醇依賴性激酶1和Akt，PI3P與PDK1的結(jié)合可使Akt磷酸化、激活，激活的Akt進(jìn)一步使細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的其他目標(biāo)蛋白磷酸化，從而抑制mTORC1的激活，提高細(xì)胞內(nèi)的自噬活性［20］。此外，mTOR磷酸化的ATG13會(huì)降低ATG13和ATG1的親和力，而ATG1-ATG13的聯(lián)合以及下一步ATG1的激活對(duì)細(xì)胞自噬非常重要，因此在細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)充分時(shí)，mTOR誘導(dǎo)的ATG1解離有效阻止了細(xì)胞自噬［21］。上述研究提示，mTOR介導(dǎo)的自噬途徑是細(xì)胞自噬的重要調(diào)節(jié)器，且這一過(guò)程受多種細(xì)胞因子及信號(hào)的影響。

基礎(chǔ)狀態(tài)下，足細(xì)胞依賴于極低水平的mTOR活性及高水平的自噬活性以維持自身動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)腎小球應(yīng)激下改變這種平衡，導(dǎo)致mTOR活性增強(qiáng)和自噬活性減弱，則會(huì)造成足細(xì)胞損傷。Raptor和Rictor分別是mTORC1和mTORC2非常重要的亞單位。Godel et al［22］通過(guò)特異性敲除足細(xì)胞Raptor和Rictor顯示，剔除Raptor導(dǎo)致蛋白尿，足突變寬和消失，進(jìn)行性腎小球硬化；而剔除Rictor的足細(xì)胞只是在應(yīng)激（如用牛血清蛋白刺激）情況下表達(dá)出極小的表型變化，提示mTORC2對(duì)足細(xì)胞的作用不是十分明顯；而同時(shí)剔除了Raptor和Rictor的足細(xì)胞直接導(dǎo)致腎臟衰竭和快速死亡。提示mTORC1活性降低可導(dǎo)致足細(xì)胞損傷，Raptor和Rictor兩者都敲除比單獨(dú)敲除其中一個(gè)導(dǎo)致更嚴(yán)重的足細(xì)胞損傷，mTORC1和mTORC2在足細(xì)胞發(fā)育中起著重要的協(xié)同作用。此外，研究［23］表明過(guò)度激活mTORC1會(huì)引起小鼠腎小球系膜擴(kuò)張、足細(xì)胞胞體增大、足突消失、腎小球硬化，并在14周齡時(shí)因腎衰竭而死亡。這些研究［22－23］提示，體內(nèi)不表達(dá)或過(guò)度表達(dá)mTORC1都會(huì)導(dǎo)致足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變。糖尿病高血糖狀態(tài)下mTOR過(guò)度表達(dá)，自噬被抑制，這種持久性的刺激導(dǎo)致足細(xì)胞衰退，出現(xiàn)蛋白尿及腎小球硬化。在給予糖尿病腎病小鼠雷帕霉素后，發(fā)現(xiàn)足突融合明顯減少［24］。而雷帕霉素參與調(diào)節(jié)足細(xì)胞自噬的機(jī)制可能在于其與FK-結(jié)合蛋白12（FK-BP12）相結(jié)合，形成RPM／FKBP12復(fù)合物，阻礙Raptor和mTOR結(jié)合，從而影響mTORC1活性，阻止細(xì)胞周期中G1期向S期轉(zhuǎn)化，阻斷細(xì)胞鈣依賴性和非鈣依賴性的信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而抑制蛋白質(zhì)翻譯的啟動(dòng)而實(shí)現(xiàn)［25］。

綜上所述，自噬普遍存在于真核細(xì)胞中，可以清除細(xì)胞中損傷或衰老的細(xì)胞器及生物大分子，具有保護(hù)細(xì)胞的作用。自噬是足細(xì)胞的一種自我保護(hù)機(jī)制，自噬體系失衡與足細(xì)胞病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。隨著研究的不斷深入，其在足細(xì)胞病中的具體作用機(jī)制也將逐步明朗。尋求一種有效調(diào)控足細(xì)胞自噬平衡體系以阻抑足細(xì)胞損傷的途徑是目前亟待解決的問(wèn)題。從自噬的角度出發(fā)，有效調(diào)控腎小球足細(xì)胞自噬內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要“調(diào)節(jié)器”——mTOR信號(hào)通路，或可為足細(xì)胞病的防治提供新思路。

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R-1

A

1000－1492（2015）08－1200－04

2015－03－25接收

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：30772808）

1天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，2天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎病科，天津 300193

黃 勇，男，博士研究生；

曹式麗，女，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：shilicaoTCM＠163.com