王 暉，李小靜，陳

抗炎因子TSG-6抑制兔耳瘢痕增生的實驗研究

王 暉，李小靜，陳

目的通過建立兔耳增生性瘢痕模型，研究腫瘤壞死因子α刺激基因-6（TSG-6）在增生性瘢痕形成過程中的作用及機制。方法建立兔耳增生性瘢痕模型，右側耳創(chuàng)面為實驗組，注射TSG-6，左側均注射等量PBS作為對照組，通過比較各組瘢痕指數(shù)（SEI）及Ⅰ、Ⅲ型膠原表達的不同來評價瘢痕增生程度的差異。采用免疫組化法及逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測炎癥因子白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）在各組中的表達；以透射電鏡觀察及TUNEL法檢測瘢痕組織成纖維細胞凋亡的變化。結果與PBS對照組比較，TSG-6治療組炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-α表達減少炎癥反應明顯減輕，瘢痕組織成纖維細胞凋亡明顯增多，且SEI及Ⅰ、Ⅲ型膠原含量均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論抗炎因子TSG-6能明顯減弱增生性瘢痕的形成，其對瘢痕形成的抑制作用可能與抑制炎癥反應及促進成纖維細胞凋亡相關。

動物模型；增生性瘢痕；兔；炎癥；TSG-6

腫瘤壞死因子α刺激基因-6（tumor necrosis factor α stimulated gene 6，TSG-6）是腫瘤壞死因子α誘導蛋白-6（tumor necrosis factor alpha induced protein，TNFAIP6）的編碼基因，是在篩選腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）干預的人纖維細胞cDNA表達文庫時發(fā)現(xiàn)的一個新基因，其表達可被TNF-α和白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1）等許多信號分子誘導［1－2］。由于基因啟動子序列中存在激活物蛋白1和核因子白細胞介素結合位點，TNF-α、IL-1等促炎因子刺激后，該基因在成纖維細胞中表達顯著增高，因此被認為是一個受TNF-α調節(jié)的、參與多種炎性反應的基因。TSG-6基因編碼蛋白含277個氨基酸，屬透明質酸（hyaluronic acid，HA）結合蛋白家族，主要由相鄰的連接組件和CUB組件組成，可與HA、硫酸軟骨素、蛋白多糖以及蛋白聚糖的G1鏈結合［3］。Tan et al［4］實驗證實抗炎因子TSG-6在瘢痕疙瘩、正常瘢痕和無瘢痕皮膚中的差異分布。然而，TSG-6對瘢痕組織形成的影響未見報道。該研究以兔耳瘢痕模型為基礎觀察TSG-6局部創(chuàng)面注射對增生性瘢痕形成的影響，并探討其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑rhTSG-6購于美國R＆D Systems公司，Ⅰ型、Ⅲ型膠原及TNF-α抗兔抗體購于美國Biorbyt公司，兔白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）抗體、兔白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）抗體購于美國Bioss公司，二氨基聯(lián)苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）購于美國Thermo Fisher Scientific公司，原位細胞凋亡檢測試劑盒購于美國Trevigen公司，逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）引物設計合成于上海捷瑞生物工程有限公司，逆轉錄試劑盒、RT-PCR擴增試劑盒購于寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 兔耳瘢痕模型的建立及用藥選用健康成年新西蘭大耳兔6只（購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心），雌雄不拘，體重2.5～3.0 kg，分籠飼養(yǎng)。兔耳瘢痕模型的制作參照Morris et al［5］方法：用3%戊巴比妥鈉30 mg／kg進行耳緣靜脈麻醉，嚴格無菌操作條件下，選取兔耳腹側面遠離耳根部位無毛或少毛區(qū)，沿長軸避開可見血管，以角膜環(huán)鉆在兔耳腹側作直徑為7 mm創(chuàng)面，去除兔耳全層皮膚并刮除軟骨膜，每只兔耳作6個相同創(chuàng)面，共計72個創(chuàng)面，術后創(chuàng)面暴露。選擇兔右耳瘢痕作為TSG-6實驗組，兔左耳瘢痕為PBS對照組。1 μg TSG-6予10 μl PBS溶解后用微量注射器分別于術后當天及術后5、10、15 d進行右側耳創(chuàng)面局部注射，左側兔耳創(chuàng)面同時注射等量PBS作對照。術后26 d，3%戊巴比妥鈉做耳緣靜脈麻醉，切取標本。用作HE、免疫組化染色的標本置于4%中性甲醛中固定，其余均用深低溫冰箱－80℃保存。

1.3 方法

1.3.1 HE染色 標本行4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水；二甲苯透明；常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色；光鏡觀察并攝片。瘢痕增生程度以光鏡下測量的瘢痕指數(shù)（scar elevation index，SEI）［5］表示。

1.3.2 透射電鏡觀察 標本行2.5%戊二醛4℃預固定2 h；PBS緩沖液漂洗3次；1%鋨酸4℃后固定2 h；常規(guī)電鏡樣品脫水、浸透、包埋、超薄切片和鈾鉛染色；透射電鏡觀察并照相。

1.3.3 免疫組化染色 各組兔耳病理性瘢痕組織石臘切片入梯度乙醇溶液中脫蠟；水化；PBS（pH 7.4）沖洗；3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶；枸櫞酸鈉緩沖液熱抗原修復；小牛血清封閉；一抗分別為Ⅰ型、Ⅲ型膠原及TNF-α抗兔抗體和兔IL-1β抗體、兔IL-6抗體；DAB顯色；蘇木精復染；中性樹膠封片。已知陽性片作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。顯微鏡觀察并拍照。

1.3.4 TUNEL法檢測細胞凋亡情況 實驗操作參照原位凋亡檢測試劑盒說明書進行，基本步驟如下：各組兔耳病理性瘢痕組織石臘切片置于梯度乙醇溶液中脫蠟，水化，PBS（pH 7.4）沖洗，20 μg／ml蛋白水解酶K（10 mmol／L Tris／HCl，pH 7.4）室溫下消化30 min，PBS漂洗切片2次，吸干樣品周圍水分，滴加50 μl TUNEL反應混合液（陰性對照滴加50 μl標記液），濕盒內37℃避光孵育60 min；PBS漂洗玻片3次，樣品直接或封片后顯微鏡觀察。染色區(qū)域位于細胞核，光鏡下觀察正常的成纖維細胞細胞核呈藍色，為陰性反應，凋亡細胞的細胞核呈深淺不一的棕褐色，為陽性反應，即凋亡細胞。在高倍鏡（× 400）視野下，每張切片選擇5個陽性視野，每個視野計數(shù)100個成纖維細胞中的陽性細胞數(shù)，計算平均陽性細胞數(shù)所占的百分比，即凋亡指數(shù)。

1.3.5 RT-PCR檢測炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-α的表達 將凍存的瘢痕組織放入研缽中加入液氮研磨，加入TRIzol后經過震蕩、離心將提取出的RNA沉淀溶于0.1%焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate，DEPC）水中，用紫外分光光度計分別檢測260、280 nm處吸光度（absorbance，A）值（A260、A280），并計算RNA濃度。逆轉錄反應參照逆轉錄試劑盒說明嚴格執(zhí)行。擴增引物由上海捷瑞生物工程有限公司設計合成，見表1。

擴增條件：95℃預變性3 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，72℃終末延伸8 min，共35個循環(huán)。最終獲得產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)對圖像進行分析，測定條帶光密度值，以β-actin作比較計算炎癥因子相對mRNA比值，并行統(tǒng)計學分析。

1.4 統(tǒng)計學處理采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，兩組之間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 大體觀察術后3 d死亡1只，剩余5只，全部納入實驗分析，創(chuàng)面均于術后12～14 d完全愈合，PBS對照組的30個創(chuàng)面模型中，術后21 d左右，瘢痕組織逐漸高出皮膚，呈現(xiàn)淡紅色，術后26 d，30個創(chuàng)面共形成增生性瘢痕24個，占80.0%，瘢痕增生明顯高出皮面且有攣縮現(xiàn)象。PBS對照組瘢痕塊顏色較紅，質地較硬，瘢痕高出皮膚平面，增生范圍未超出原創(chuàng)緣；TSG-6實驗組瘢痕顏色淡，質地較柔軟。

2.2 TSG-6與瘢痕增生顯微鏡下用測微尺進行測量并計算瘢痕指數(shù)，TSG-6實驗組瘢痕指數(shù)為（1.92±0.15），PBS對照組瘢痕指數(shù)為（1.29± 0.18），兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（n＝12，t＝9.31，P＜0.01）。免疫組化染色結果顯示TSG-6實驗組Ⅰ型、Ⅲ型膠原沉積明顯較PBS對照組減輕。見圖1。

2.3 TSG-6與細胞凋亡透射電鏡形態(tài)學觀察可見TSG-6實驗組細胞凋亡顯著，細胞內可見核固縮線粒體腫脹及凋亡小體等，而PBS對照組細胞內未見明顯凋亡表現(xiàn)。見圖2。TUNEL半定量檢測分析發(fā)現(xiàn)TSG-6實驗組凋亡指數(shù)為（0.42±0.05），明顯高于PBS對照組（0.30±0.03），差異有統(tǒng)計學意義（n＝12，t＝7.13，P＜0.01），見圖3。結果證實TSG-6實驗組細胞凋亡顯著。

2.4 TSG-6與炎癥反應免疫組化染色顯示TSG-6實驗組IL-1β、IL-6及TNF-α表達較PBS對照組顯著。見圖4。所有提取RNA樣品A260／A280比值均在1.8～2.0，說明標本提取RNA純度較理想，RTPCR半定量檢測證明3種炎癥因子于TSG-6實驗組表達均明顯低于PBS對照組。見表2。結果提示TSG-6具有抑制炎癥因子釋放，抑制炎癥反應的作用。

表2 兩組瘢痕組織IL-1β、IL-6及TNF-α mRNA相對定量值（n＝12，±s）

與PBS對照組比較：*P＜0.05

組別IL-1βIL-6TNF-α TSG-6實驗0.675±0.009*0.585±0.029*0.596±0.013*PBS對照0.756±0.0360.624±0.0200.618±0.012

3 討論

皮膚創(chuàng)傷愈合一般經歷炎癥、增殖和成熟或重塑3個階段。炎癥反應可作為抗感染的免疫屏障，同時刺激纖維蛋白合成以閉合創(chuàng)面。因此，適度的炎癥反應有利于創(chuàng)面愈合，然而過度炎癥反應將導致病理性瘢痕的形成。TSG-6是已被證實的具有明顯抗炎作用的細胞因子。它可以抑制炎癥因子IL-6、IL-1β等的表達、抑制中性粒細胞浸潤、減少炎性損傷，從而保護角膜免受化學及機械損害［6］；在關節(jié)炎鼠模型中，TSG-6可使炎癥局限，明顯減輕關節(jié)水腫，軟骨和骨質破壞得到很好地控制［7］。研究［8］證實，TSG-6主要是通過與HA、間α胰蛋白酶抑制物（IαI）、CD44等氨基葡聚糖類物質結合發(fā)揮上述生物學特性。本實驗通過免疫組化染色及RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)瘢痕組織炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-α于TSG-6實驗組表達均低于PBS對照組，結果提示TSG-6在瘢痕形成過程中亦具有明顯抗炎作用。

病理性瘢痕常以成纖維細胞過度增殖、膠原等細胞外基質大量沉積為特征，其中成纖維細胞是參與組織修復的主要功能細胞和效應細胞，膠原等細胞外基質主要是由成纖維細胞合成和分泌的。因此，如何誘導瘢痕組織成纖維細胞凋亡可能是瘢痕治療新的方式。Seidita et al［9］研究表明p53基因缺損的細胞中無TSG-6基因的表達，而在p53基因依賴的凋亡途徑中TSG-6表達水平上調，且在p53介導的細胞周期G1期靜止中，TSG-6直接受p53下游效應因子的調控。由此，可推測p53介導的細胞凋亡途徑可能是TSG-6的另一生物學作用。同時，Choi et al［10］發(fā)現(xiàn)TSG-6可抑制核轉錄因子NF-κB的表達，而NF-κB在增生性瘢痕形成中具有抑制細胞凋亡的作用。這些研究提示TSG-6可能具有誘導細胞凋亡的作用。Qi et al［11］實驗顯示TSG-6的抗纖維化作用。為進一步探討TSG-6對瘢痕組織成纖維細胞凋亡的影響，本研究以透射電鏡觀察及TUNEL法檢測瘢痕組織成纖維細胞凋亡的變化，結果顯示TSG-6實驗組凋亡指數(shù)明顯升高，但其機制尚不明確。

Tan et al［4］發(fā)現(xiàn)瘢痕疙瘩中TSG-6表達水平較無瘢痕修復皮膚明顯減少，但較正常皮膚增多，且HA、IαI的表達及分布與TSG-6相一致。TSG-6序列含有高度保守的HA結合區(qū)，HA和TSG-6結合非常穩(wěn)定［12］。已知HA可通過抑制前列腺素E2的水平、炎性細胞的趨化及氧自由基的產生等抗炎作用及抑制成纖維細胞分化等減少瘢痕形成，且在胎兒皮膚無瘢痕愈合過程中存在高濃度的HA［13］。課題組前期研究［14］表明TSG-6與病理性瘢痕形成具有相關性，本研究顯示TSG-6實驗組Ⅰ型、Ⅲ型膠原沉積明顯減低，同時證實TSG-6對瘢痕形成具有明顯抑制作用。

綜上所述，通過早期創(chuàng)面TSG-6干預并予瘢痕組織局部注射TSG-6的方法對瘢痕形成及增生具有抑制作用，其抗瘢作用可能與抑制炎癥反應及促進瘢痕組織細胞凋亡相關。

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The experimental study of anti-inflammatory cytokine TSG-6 inhibits hypertrophic scar formation in rabbit ears model

Wang Hui，Li Xiaojing，Chen Zhao
（Dept of Plastic Surgery，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo observe the effect of tumor necrosis factor α stimulated gene-6（TSG-6）on hypertrophic scarring by using a rabbit ear model.MethodsTSG-6 and PBS were injected intradermally in the right and left ear wounds，respectively.Collagen I and III expression detected by immunohistochemistry and scar elevation index（SEI）was used to evaluate the extent of scarring.The expression of inflammatory factors interleukin-1β（IL-1β），interleukin-6（IL-6）and tumor necrosis factor-α（TNF-α）was detected by immunohistochemistry and reverse transcription polymerase chain reaction.Transmission electron microscope（TEM）and TUNEL analyses were used to detect fibroblast apoptosis.ResultsCompared with control scars，TSG-6-treated wounds exhibited decreased inflammation significantly as evidenced by the lower levels of IL-1β，IL-6，TNF-α.The apoptosis rate was higher and the SEI and the synthesis of collagens I and III were significantly decreased in the TSG-6-treated scars（P＜0.05）.ConclusionImmediate topical injection of TSG-6 during the wound healing process can reduce the severity of hypertrophic scarring in a rabbit model.The anti-cicatrix effect of TSG-6 may result from controlling inflammation，inducing fibroblast apoptosis and promoting collagen degradation.

animal model；hypertrophic scar；rabbit；inflammation；TSG-6

R 619＋.6

1000－1492（2015）01－0045－05

2014－09－25接收

國家自然科學基金（編號：81272107）

安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院整形外科，合肥 230022

王 暉，男，碩士研究生；李小靜，女，教授，主任醫(yī)師，碩士生導師，責任作者，E-mail：lixiaojing5＠163.com