章亞兵，汪 寧

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽合肥 230031;2.安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽 合肥 210051)

通過體外藥理實(shí)驗(yàn)研究中藥及復(fù)方制劑藥理作用，由于中藥成分的復(fù)雜性［1］，體外實(shí)驗(yàn)對培養(yǎng)體系的干擾因素大，易受到中藥中的滲透壓、pH、鞣酸及離子等成分的干擾，影響到了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。日本學(xué)田代真一提出了中藥血清藥理學(xué)方法的概念［2］，中藥血清藥理學(xué)是指將中藥或中藥復(fù)方經(jīng)口給動(dòng)物灌服一定時(shí)間后采集動(dòng)物血液，分離血清，用含有藥成分的血清進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。作為一種改良的中藥體外實(shí)驗(yàn)方法，中藥血清藥理學(xué)研究排除了中藥粗制劑直接加入反應(yīng)系統(tǒng)所帶來的干擾，有利于發(fā)現(xiàn)體外沒有作用而體內(nèi)有作用的藥物，相對真實(shí)地反映藥物的整體作用［3］。但是機(jī)體在服用一定劑量的某種藥物后，藥物的成分或代謝產(chǎn)物經(jīng)過血液循環(huán)到達(dá)其作用的靶器官，而最終與靶器官的細(xì)胞上的作用靶點(diǎn)直接接觸的并不是含藥血清，而是含有一定濃度活性成分的組織液［4］。在機(jī)體產(chǎn)生的組織液中，腦脊液是常見的也是一種十分重要的組織液。但是由于血腦屏障(Blood-brain barrier，BBB)作用，使得腦脊液的成分與血清的成分，不論是生理性還是藥物(代謝)成分都存在差異。血腦屏障是存在于腦組織和血液之間的一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞系統(tǒng)，控制血腦兩側(cè)的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，從而保證中樞神經(jīng)組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定［5］。BBB受損是腦血管疾病發(fā)生、發(fā)展的主要原因之一［6］?？赏ㄟ^代謝進(jìn)入血清的中樞神經(jīng)藥物有效成分因受BBB的選擇性通過作用是否能夠達(dá)到腦脊液中，發(fā)揮中樞神經(jīng)保護(hù)作用，是研究者們對中藥復(fù)方進(jìn)行藥效學(xué)研究時(shí)面臨的難題。近來有學(xué)者提出用含藥腦脊液通過體外實(shí)驗(yàn)用于研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物的藥理作用。以中藥復(fù)方的含藥腦脊液來代替含藥血清通過體外實(shí)驗(yàn)研究中藥的藥理作用及確定中藥的有效成分將可能縮小研究范圍，突出重點(diǎn)，并可避免血清中復(fù)雜成分的干擾，更能體現(xiàn)有效成分的藥理作用，增加有效成分研究的針對性［7－10］。

1 腦脊液藥理學(xué)方法的提出

中藥腦脊液藥理學(xué)是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給予一定劑量的中藥后，通過采集動(dòng)物含藥腦脊液作為受試藥進(jìn)行藥理研究的實(shí)驗(yàn)方法。腦脊液是存在于各腦室、蛛網(wǎng)膜下腔和脊髓中央管內(nèi)的無色透明液體，由腦部特殊的毛細(xì)血管網(wǎng)產(chǎn)生。而血腦屏障是存在于腦部的血漿與腦細(xì)胞之間的屏障，其中存在著緊密連接蛋白等特殊生物學(xué)結(jié)構(gòu)，僅僅分子質(zhì)量較小的脂溶性物質(zhì)及氣體分子才能順利通過進(jìn)入腦脊液。其他化學(xué)物質(zhì)，即使是對腦組織有治療作用的藥物也有可能被認(rèn)為是對大腦內(nèi)部環(huán)境產(chǎn)生不利影響而阻擋在BBB以外，這樣才能保證維持大腦內(nèi)生理環(huán)境相對穩(wěn)定和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常結(jié)構(gòu)與功能［11－13］。BBB對于腦部正常的生理活動(dòng)起著至關(guān)重要的作用，但是由于其同時(shí)能夠阻止藥物自由進(jìn)入腦組織，也增加了對中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病的治療難度，對于新藥篩選和藥理藥效的保護(hù)作用及其機(jī)制的闡述同樣增加了難度。鑒于此，在對新藥篩選和藥理藥效的保護(hù)作用及其機(jī)制的闡述時(shí)，中藥的有效成分是否能夠通過BBB作用于腦部神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮藥理作用是我們實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。梅建勛等［14］提出中藥腦脊液藥理學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法，并研究了這一方法對星形膠質(zhì)細(xì)胞的離體作用。在家兔灌胃給予中藥后，采集腦脊液并作用于正常星形膠質(zhì)細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，正常星形膠質(zhì)細(xì)胞在含腦脊液培養(yǎng)基中培養(yǎng)狀態(tài)明顯優(yōu)于含相同濃度血清培養(yǎng)基［15］，表明中藥腦脊液方法優(yōu)于血清藥理學(xué)方法，并使用此方法研究了腦益智方的含藥腦脊液對神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用［16］。

2 中藥腦脊液藥理學(xué)的現(xiàn)狀

2.1 中藥腦脊液藥理學(xué)的應(yīng)用 在具體試驗(yàn)時(shí)，如何造模以及細(xì)胞損傷指標(biāo)的選擇是學(xué)者們根據(jù)研究對象的不同而具體選擇，一般通過采集含藥腦脊液后作用于經(jīng)過加入化學(xué)物質(zhì)如谷氨酸［17］、KCl［18］、過氧化氫［19］、連二亞硫酸鈉［20］等進(jìn)行造模的細(xì)胞株，通過考察細(xì)胞的各類指標(biāo)研究其保護(hù)作用及作用機(jī)制。選擇合適的化學(xué)物質(zhì)造模后，細(xì)胞的各項(xiàng)指標(biāo)如膜通透性［21］、氧化應(yīng)激水平［22］、能量代謝［23］、鈣超載程度［24］、各類基因、蛋白的表達(dá)均會(huì)發(fā)生變化［25］，通過對這些指標(biāo)的檢測可確認(rèn)含藥腦脊液是否有保護(hù)作用，以及通過一系列指標(biāo)的測定找出其作用靶點(diǎn)。在膜通透性檢測方面，可使用AO/EB染色，臺(tái)盼蘭染色，培養(yǎng)上清液中LDH濃度等指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn);在衡量細(xì)胞氧化應(yīng)激水平方面，NO濃度、SOD活性、MDA濃度、ROS濃度均是常用參數(shù);在能量代謝水平方面，ATP酶活性檢測、羅丹明123染色利用流式細(xì)胞術(shù)分析等試驗(yàn)是良好的方法;在鈣超載程度衡量時(shí)可使用細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度檢測，Westen-blotting方法檢測鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)比值衡量磷酸化程度等方法。在凋亡蛋白表達(dá)方面，c-fos和c-jun、凋亡基因bax、bcl-2 和 caspase-3 均是不錯(cuò)的選擇［26－30］。由于腦脊液是體內(nèi)重要的神經(jīng)營養(yǎng)液，通過給藥后可從下列方面說明可應(yīng)用于藥效學(xué)的研究。首先，含藥腦脊液中可能含有效應(yīng)物質(zhì)，可應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物的體外藥效學(xué)研究。葉光華等［31］證明了清心開竅方含藥腦脊液對αβ25-35損傷的PC12細(xì)胞具有保護(hù)作用。李福東等［32］發(fā)現(xiàn)PC12細(xì)胞在開心散含藥腦脊液無血清培養(yǎng)基中也能夠生長，并且具有含藥腦脊液濃度相關(guān)性。開心散復(fù)方中的有效成分能夠經(jīng)過吸收、轉(zhuǎn)化并通過BBB進(jìn)入腦部發(fā)揮藥效。張曉艷等［33］通過研究發(fā)現(xiàn)，清心開竅方含藥腦脊液能夠明顯提高KCL所致?lián)p傷的PC12細(xì)胞活力，在AD的治療效果是顯著的。上述研究成果從不不同方面說明了含藥腦脊液可改善損傷細(xì)胞的保護(hù)作用，為臨床用藥提供了依據(jù)，為保護(hù)機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。其次，含藥腦脊液中新化學(xué)物質(zhì)研究可闡述中藥復(fù)方的物質(zhì)基礎(chǔ)。孫志翠等［34］在相同色譜條件下比較了各組的HPLC指紋圖譜，初步鑒定出了腦脊液成分、復(fù)方成分以及代謝產(chǎn)物，證實(shí)了給藥后腦脊液中出現(xiàn)了復(fù)方中的有效成分。李越峰等［35］利用HPLC法比較大鼠給藥后血中以及腦脊液中的移行成分，確認(rèn)了復(fù)方中的有效成分為辛弗林、芍藥苷、柴胡皂苷C及甘草次酸的混合物。汪寧等［36］通過研究通竅活血顆粒家兔灌胃后利用氣相色譜法研究腦脊液移行成分，并且發(fā)現(xiàn)了通竅活血顆粒復(fù)方制劑中君藥麝香所含成分麝香酮，并提出可定量測定其含量以此作為復(fù)方制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)之一。上述研究表明，含藥腦脊液的藥效學(xué)結(jié)果均有物質(zhì)基礎(chǔ)依據(jù)，是藥效學(xué)的重要佐證。另外，腦脊液的成分變化引起腦內(nèi)其他生物活性物質(zhì)變化也是研究的熱點(diǎn)。謝寧等［37－38］通過灌胃方式給予家兔地黃飲子水提取物后抽取家兔腦脊液并用來研究了含藥腦脊液對β-淀粉樣蛋白(αβ25-35)所致PC12損傷細(xì)胞即早基因c-fos和cjun、凋亡基因bax、bcl-2和caspase-3表達(dá)作用的影響。結(jié)果顯示 c-fos、c-jun、bax和 caspase-3表達(dá)被抑制，只有bcl-2的表達(dá)是提高的，含藥腦脊液可通過引起腦內(nèi)基因的表達(dá)影響神經(jīng)細(xì)胞的生長。

2.2 中藥腦脊液藥理學(xué)的關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)步驟

2.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇 大小鼠、家兔、犬是我們常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。鄒永杰在對Longa法加以改良，建立小鼠的線栓法永久性大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型，深入研究了高壓氧預(yù)適應(yīng)對小鼠MCAO模型的腦缺血保護(hù)作用［39］。池欣欣用大鼠進(jìn)行了缺血再灌注大鼠腦損傷的實(shí)驗(yàn)研究［40］。大鼠由于價(jià)格低廉、飼養(yǎng)費(fèi)用低、腦血管解剖結(jié)構(gòu)與高等動(dòng)物相似、生態(tài)學(xué)和倫理學(xué)等因素考慮［41］，是實(shí)驗(yàn)者常選擇的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一。劉聰?shù)韧ㄟ^新西蘭兔灌胃柴黃顆粒后取腦脊液研究了腦脊液中發(fā)熱介質(zhì)的影響［42］。家兔可取得腦脊液量遠(yuǎn)大于大小鼠，雖然費(fèi)用較之稍高，為保持理化、生物特性的一致性，可減少因種群差異產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信度，也是實(shí)驗(yàn)者常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。張升等建立一種新的手術(shù)模型，實(shí)現(xiàn)對腦脊液(CSF)的多次采集，動(dòng)物手術(shù)存活率為80%，模型成功率為60%［43］，有利于多次累積采集腦脊液，適合用于對腦脊液需求量大的實(shí)驗(yàn)。馬鋒等利用六味地黃丸兔、大鼠、人3種不同種屬動(dòng)物含藥腦脊液腦脊液對αβ1-40誘導(dǎo)的細(xì)胞活力減低有明顯抑制作用，且未發(fā)現(xiàn)差異性［44］，提示種群差異不是我們動(dòng)物選擇的唯一標(biāo)準(zhǔn)。

2.2.2 腦脊液采集 動(dòng)物的腦脊液體積很少，實(shí)驗(yàn)者應(yīng)根據(jù)自身能力及特點(diǎn)，盡量采取熟練的、可行的獲取方法。楊子等［45］進(jìn)行了3種采集方法的比較，以選擇可靠的采集方法。第一，經(jīng)皮穿刺延髓池抽取腦脊液。本方法雖然操作簡單，但是難度太大，未能成功采集合格腦脊液，其原因是采集者不能不能確保進(jìn)針位置的絕對準(zhǔn)確，且不能保證進(jìn)針深度合適，容易刺穿延髓池。第二，直視下劃破硬脊膜抽取腦脊液。本方法10只大鼠均能采集到清涼腦脊液，但離心后出現(xiàn)8例血性腦脊液，合格率為20%。究其原因，在用手術(shù)刀片劃破硬脊膜時(shí)極易劃破組織血管，導(dǎo)致采集失敗，且待腦脊液流出后再用微量注射器采集，在流出和采集的間隔極易被污染。第三，直視下經(jīng)硬脊膜穿刺微量進(jìn)樣器抽取腦脊液。本方法100%采集到清涼合格的腦脊液，且每只能采集超過100 μL。本方法能夠成功采集足量腦脊液的原因?yàn)?，在直視下采集者可用微量注射器直接刺入枕大孔采集，不易產(chǎn)生偏差，且腦脊液未流出之前不與外界接觸，不容易產(chǎn)生污染，加之腦脊液只會(huì)流向微量注射器，不會(huì)產(chǎn)生損失。馬偉等［46］采取了直視下經(jīng)硬脊膜穿刺微量進(jìn)樣器抽取腦脊液的方法，通過枕大孔共抽取了30只SD大白鼠，3只未取出，5只因出現(xiàn)混血失敗，其余22只均成功抽出，平均76 μL，成功率為73%，并且其中有18只腦脊液超過100 μL。另通過枕大孔取了50只家兔，其中2例未取出，4例出現(xiàn)混血失敗，其余均成功采集，平均700 μL，成功率88%。上述結(jié)果表明兩組實(shí)驗(yàn)者采取的直視下經(jīng)硬脊膜穿刺微量進(jìn)樣器抽取腦脊液的方法可行，一組采集者成功率略低的原因可能在于采集手法及熟練程度存在差異，并不表明采集方法不可靠，本方法為目前采集者的首選方法。

2.2.3 腦脊液的保存 腦脊液離體后，可立即實(shí)驗(yàn)，或者短期－20℃保存，一般不超過30 d，以防變性。夏吉榮等［47］通過比較腦脊液和血清中共同含有的化學(xué)物質(zhì)神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)，發(fā)現(xiàn)在相同溫度下腦脊液中的NSE穩(wěn)定性較差，說明腦脊液對離體后的化學(xué)物質(zhì)保護(hù)作用更差。另外發(fā)現(xiàn)腦脊液中的NSE測定值比文獻(xiàn)中的測定值低，可能是實(shí)驗(yàn)后放置的時(shí)間過長導(dǎo)致NSE分解。通過以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步表明，標(biāo)本保存溫度、時(shí)間可能是NSE穩(wěn)定性的重要影響因素，這就要求實(shí)驗(yàn)者的盡量縮短采集時(shí)間，并在采集結(jié)束后盡快于－20℃保存。

3 中藥腦脊液藥理學(xué)的總結(jié)和展望

中藥腦脊液藥理學(xué)是近年應(yīng)用于中樞神經(jīng)疾病與治療藥物研究的熱點(diǎn)，其模擬了中藥經(jīng)過加工、給藥、吸收、代謝后在腦部的分布情況，為中藥及其成方制劑研究提供了良好的離體實(shí)驗(yàn)方法，有利于中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物的保護(hù)作用、作用機(jī)制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。隨著方法學(xué)的進(jìn)一步完善，其必將適用于更加廣泛的研究領(lǐng)域中。

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