劉德裕，翦新春，徐普，朱蓉，周超，王媛

（1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心，海南 海口 570208；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院口腔頜面外科，湖南 長沙 410008）

·論著·

口腔黏膜下纖維性變中堿性成纖維細(xì)胞生長因子和CD34的表達(dá)及意義*

劉德裕1，翦新春2，徐普1，朱蓉1，周超1，王媛1

（1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心，海南 ?？?570208；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院口腔頜面外科，湖南 長沙 410008）

目的評(píng)價(jià)不同階段口腔黏膜下纖維性變（OSF）的CD34和堿性成纖維生長因子（bFGF）表達(dá)及其在計(jì)數(shù)新生血管中的價(jià)值。方法30例OSF患者納入本研究，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CD34和bFGF表達(dá)，根據(jù)CD34和bFGF染色強(qiáng)度計(jì)數(shù)口腔黏膜組織新生血管數(shù)目。結(jié)果采用CD34評(píng)價(jià)時(shí)，對(duì)照組及早、中、晚期OSF的平均血管密度（MVD）分別為42.08、20.48、17.40和14.85。采用bFGF評(píng)價(jià)時(shí)，對(duì)照組及早、中、晚期OSF的MVD分別為32.50、15.55、13.88和14.50。OSF組和對(duì)照組的MVD比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。對(duì)照組上皮細(xì)胞層厚度（ET）（高倍鏡下上皮細(xì)胞數(shù)）為20～37，平均32.90。OSF組平均ET值為16.10。OSF組和對(duì)照組ET值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。早、中、晚期OSF的平均ET值分別為15.45、17.29和9.50。結(jié)論隨著OSF進(jìn)展，MVD和ET顯著降低。

堿性成纖維生長因子；CD34；口腔黏膜下纖維性變

1950年口腔黏膜下纖維性變（oral submucous fibrosis，OSF）首先在印度被發(fā)現(xiàn)，OSF是一種口腔慢性癌前病變，臨床上表現(xiàn)為口干、灼痛、進(jìn)食刺激性食物疼痛、進(jìn)行性張口受限、吞咽困難等[1]。隨著OSF進(jìn)展，患者口腔上皮萎縮和表皮突丟失。一般認(rèn)為，OSF上皮萎縮是由結(jié)締組織基質(zhì)中血管減少導(dǎo)致血液灌注缺少引起。最近有研究表明，OSF進(jìn)展過程中血管數(shù)量并沒有減少[2]。

目前，OSF的血管分布程度仍然存在爭議，雖然不能直接檢測(cè)新生血管數(shù)量，但是可以通過檢測(cè)CD34、CD31和CD105等內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物計(jì)算平均血管密度（mean vascular density，MVD），從而間接反映新生血管生成。CD34為人類造血祖細(xì)胞抗原，是高度糖基化的i型跨膜糖蛋白，分子量為110 kD。CD34也是重要的血管生成標(biāo)記物，能夠反映組織微血管密度[3]。CD34在造血干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及真皮層樹突細(xì)胞中表達(dá)，分布在血管周圍和神經(jīng)鞘內(nèi)。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)顯示，CD34主要在小血管或新生血管、內(nèi)皮及腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)[4]。

堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）及低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor，HIF）等生長因子在維持OSF結(jié)締組織血管完整性中發(fā)揮重要作用。成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）是一種肝素結(jié)合蛋白（heparin-binding protein，HBP），F(xiàn)GF的信號(hào)傳導(dǎo)需要FGF與細(xì)胞表面乙酰肝素蛋白聚糖的結(jié)合[5]。FGF家族包括22個(gè)成員，所有成員都能通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖及形成管狀結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)血管生成。bFGF不但能促進(jìn)血管形成，還能促進(jìn)多種細(xì)胞有絲分裂[6]。

本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)OSF中CD34和bFGF的表達(dá)，并根據(jù)CD34和bFGF的免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果對(duì)OSF組織中新生血管進(jìn)行定量分析。比較不同組織學(xué)分級(jí)OSF的平均血管密度，并探討不同組織學(xué)分級(jí)OSF中CD34和bFGF的表達(dá)意義及相關(guān)性，旨在進(jìn)一步闡明微血管系統(tǒng)在OSF進(jìn)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2014年1月-2014年12月在中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院口腔科就診，經(jīng)臨床和病理確診的OSF患者30例為實(shí)驗(yàn)組，取患者口腔頰部黏膜。其中男性19例，女性11例；平均年齡42.5歲。對(duì)照組10例標(biāo)本取自本院口腔外科拔除埋伏阻生牙的健康口腔黏膜，所有健康志愿者無檳榔咀嚼史。30例OSF組織樣本中，早期11例，中期17例，晚期2例。對(duì)照組包括7例男性和3例女性，平均年齡30.6歲。30例OSF患者中，17例患者（56.7%）有檳榔咀嚼史，12例患者（40.0%）吸煙時(shí)咀嚼檳榔。

1.2 免疫組織化學(xué)法

所有標(biāo)本4μm石蠟連續(xù)切片，60℃烤片2 h，常規(guī)脫蠟至水，30 ml/L過氧化氫滅活內(nèi)源過氧化物酶10 min，0.1 mol/L磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌，枸櫞酸修復(fù)液（pH=6.0）微波加熱修復(fù)15 min，0.1 mol/L PBS洗滌，正常山羊血清封閉液封閉15min，滴加CD34或bFGF抗體，常溫放置30 min，4℃濕盒過夜，0.1 mol/L PBS洗滌，滴加二抗工作液室溫孵育20 min，0.1 mol/L PBS洗滌，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵自素工作液，37℃孵育20 min，0.1 mol/L PBS洗滌。滴加新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine，DAB），高倍鏡下控制染色，充分水洗終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)染、透明、脫水，中性樹脂封片。免疫組織化學(xué)法染色以背景清晰及胞漿、胞膜上出現(xiàn)棕黃色顆粒為CD34或bFGF陽性結(jié)果；組織細(xì)胞僅為淡淡的淺黃背景，無棕黃色顆粒為CD34或bFGF陰性結(jié)果。高倍鏡下（×200）每張切片采集5個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)及陽性細(xì)胞數(shù)，得到陽性細(xì)胞的百分率（陽性細(xì)胞的百分率=陽性細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)×100%），取平均值。按陽性細(xì)胞數(shù)所占比例不同分為4級(jí)：無染色或陽性率＜5%為陰性（-），6%～30%為陽性（+），31%～50%為較強(qiáng)陽性（++），＞50%為強(qiáng)陽性（+++）。以已知CD34或bFGF陽性切片為陽性對(duì)照，0.01 mol/L PBS代替一抗為陰性對(duì)照組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，用χ2檢驗(yàn)和Fisher精確概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)法

CD34蛋白及bFGF陽性細(xì)胞的胞膜或胞質(zhì)呈棕黃色，主要表達(dá)于上皮基底細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞上，而成纖維細(xì)胞極少見其表達(dá)分布。CD34蛋白在正?？谇火つそM織和OSF組織中的陽性表達(dá)率分別為90%（9/10）和30%（9/30），OSF組顯著低于對(duì)照組（χ2=14.697，P＜0.05）（見圖1）；bFGF蛋白在正?？谇火つそM織和OSF組織中的陽性表達(dá)率分別為80%（8/10）和23.3%（7/30），OSF組顯著低于對(duì)照組（χ2=21.372，P＜0.05）（見圖2）。

圖1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CD34的表達(dá)（×200）

圖2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)bFGF的表達(dá)（×200）

2.2 OSF組織中的新生血管分布

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)CD34和bFGF免疫組織化學(xué)法的陽性染色強(qiáng)度，評(píng)估受試者口腔黏膜組織中新生血管分布。采用CD34評(píng)價(jià)時(shí)，對(duì)照組及早、中、晚期OSF的MVD分別為42.08、20.48、17.40和14.85。采用bFGF評(píng)價(jià)時(shí)，對(duì)照組及早、中、晚期OSF的MVD分別為32.50、15.55、13.88和14.50。OSF組和對(duì)照組的MVD比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。見圖3。

圖3 OSF組織中的新生血管分布

2.3 上皮細(xì)胞層厚度

對(duì)照組上皮細(xì)胞層厚度（epithelial cell layer thickness，ET）（高倍鏡下上皮細(xì)胞數(shù)）為20～37，平均32.90。OSF組平均ET值為16.10。由于OSF組ET值大致為對(duì)照組的1/2，因此可以將對(duì)照組ET值（32.90）的1/2作為上皮萎縮臨界值。OSF組和對(duì)照組ET值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。早、中、晚期OSF的平均ET值分別為15.45、17.29和9.50。早、中、晚期OSF的ET值與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002、0.000和0.014）。見圖4。

圖4 各組平均ET值比較

3 討論

OSF是影響口腔黏膜的潛在慢性纖維化病變，少數(shù)情況下也會(huì)影響咽部和食管上段[7]。隨著疾病發(fā)展，上皮和黏膜纖維化導(dǎo)致口腔黏膜及深層組織僵硬，張口和舌活動(dòng)受限，造成吃飯、吞咽、發(fā)聲困難。上皮細(xì)胞發(fā)育不良和萎縮是晚期OSF的標(biāo)志。

目前，OSF血管形成機(jī)制仍然存在爭論。一般認(rèn)為隨著OSF進(jìn)展，灌注缺失，上皮萎縮導(dǎo)致血管減少。近期有研究表明，疾病進(jìn)展期并沒有明顯減少血管[2]。血管不能直接計(jì)數(shù)，但是可以通過血管生成標(biāo)志物間接測(cè)量。本研究采用CD34和bFGF評(píng)估OSF血管數(shù)目。

平均血管密度是微血管計(jì)數(shù)平均值，是通過顯微鏡觀察一定區(qū)域內(nèi)（3或4個(gè)視野）的血管計(jì)數(shù)得到，主要選擇有血管的區(qū)域（熱點(diǎn)）進(jìn)行計(jì)數(shù)。本實(shí)驗(yàn)中，CD34計(jì)數(shù)所得微血管數(shù)比bFGF多，提示CD34表達(dá)是評(píng)估腫瘤血管數(shù)量的更可靠方法。以往有研究表明，CD34作為標(biāo)志物比血管性假血友病因子和凝血因子Ⅷ更好[8]。方廠云等[9]研究分析OSF組織中黏膜血管分布，表明微血管增生發(fā)生在早期OSF，中期和晚期反而顯著減少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MVD與不同階段OSF相關(guān)，與對(duì)照組比較，MVD顯著減少。CD34計(jì)數(shù)MVD時(shí)，早、中、晚期OSF的血管數(shù)量逐漸減少，bFGF計(jì)數(shù)也同樣逐漸減少，與方廠云等[9]的研究結(jié)果一致。本研究也顯示，bFGF計(jì)數(shù)MVD時(shí)，晚期OSF略高于中期，這可能是由于晚期樣本量較少導(dǎo)致。

與之相反，DESAI等[10]采用免疫組織化學(xué)法計(jì)算MVD，發(fā)現(xiàn)MVD隨著疾病進(jìn)展而增加。RAJENDRAN等[2]通過圖像分析也發(fā)現(xiàn)OSF組的MVD與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，認(rèn)為MVD增加是黏膜組織短暫性缺血、缺氧的適應(yīng)性反應(yīng)。DESAI等[10]采用CD34陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)血管數(shù)目增加，從而推測(cè)惡變時(shí)，血管增長在腫瘤增殖中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果表明，OSF組的MVD明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與DESAI等[10]的研究結(jié)果不一致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，OSF組的ET值與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，進(jìn)展階段OSF的ET值顯著低于對(duì)照組，與DESAI等[10]的研究結(jié)果相似。

大多數(shù)研究中，瘤內(nèi)高M(jìn)VD常常和不良組織學(xué)預(yù)后相關(guān)。PAZOUKI等[11]也報(bào)道血管減少常發(fā)生在正常組織向發(fā)育異常早期癌癥階段的轉(zhuǎn)變過程中。筆者推測(cè)，OSF進(jìn)展階段血管減少導(dǎo)致短暫性缺血、缺氧，而缺氧使細(xì)胞外基質(zhì)增加，從而在纖維化過程中起重要作用。腎纖維化體外研究發(fā)現(xiàn)，缺氧能夠刺激成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrixc，ECM）蛋白（Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和纖連蛋白）、組織抑制因子-1（tissue inhibitor of matrix metalloprotease-1，TIMP-1）和組織抑制因子-3（tissue inhibitor of matrix metalloprotease-3，TIMP-3）mRNAs表達(dá)，抑制MMP-1 mRNA水平，與ECM的積累一致。TILAKRATNE等[12]注意到OSF成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)上升，提示缺氧在OSF中具有重要意義。因此，認(rèn)為基質(zhì)玻璃樣變和隨之發(fā)生的上皮細(xì)胞缺氧會(huì)導(dǎo)致上皮缺血性萎縮。但與RAJENDRAN等[2]的觀點(diǎn)不一致，推測(cè)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）可能在OSF上皮萎縮中起作用，認(rèn)為細(xì)胞缺少是由于角質(zhì)細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞毒性和基因毒性作用。本研究證實(shí)TILAKRATNE等[12]的觀點(diǎn)，即真皮層纖維化和血管減少伴隨細(xì)胞因子活動(dòng)變化，為煙草和檳榔中的致癌物質(zhì)創(chuàng)造一個(gè)獨(dú)特的環(huán)境，從而作用于上皮細(xì)胞?？梢哉J(rèn)為檳榔中致癌物長時(shí)間積累在上皮組織下，使得致癌物可以長時(shí)間作用于上皮組織而不侵入到更深層中。同時(shí)，血管減少也會(huì)減慢致癌物吸收到體循環(huán)中。

筆者謹(jǐn)慎地認(rèn)為除基質(zhì)纖維化和血管減少外，致癌物積累也會(huì)影響已經(jīng)受累的上皮細(xì)胞。上皮細(xì)胞發(fā)育異常及侵入到結(jié)締組織，為腫瘤細(xì)胞迅速生長創(chuàng)造良好的微環(huán)境。血管生長因子釋放導(dǎo)致血管生成和腫瘤細(xì)胞增殖，這也可以解釋OSF惡變過程中MVD上升的機(jī)制。DESAI等[10]發(fā)現(xiàn)，CD34陽性基質(zhì)細(xì)胞減少或缺失，尤其在OSF近上皮位置，與正常黏膜CD34陽性基質(zhì)細(xì)胞均一分布不同。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，近上皮和基質(zhì)內(nèi)CD34陽性基質(zhì)細(xì)胞完全缺失。但是與DESAI等[10]發(fā)現(xiàn)正常黏膜CD34陽性基質(zhì)細(xì)胞均一分布相反，本研究未發(fā)現(xiàn)CD34陽性基質(zhì)成纖維細(xì)胞。這可能是由于方法差異導(dǎo)致，包括內(nèi)皮標(biāo)志物敏感性。本研究結(jié)果表明，bFGF免疫反應(yīng)性在成纖維細(xì)胞和早期OSF組織上皮細(xì)胞中升高，在晚期纖維化基質(zhì)中bFGF表達(dá)顯著降低，與BISHEN等[13]的研究結(jié)果一致。不同階段OSF血管減少以及明顯ET改變進(jìn)一步證實(shí)灌注缺少可導(dǎo)致上皮細(xì)胞萎縮，進(jìn)而引起上皮細(xì)胞發(fā)育異常。

總之，本研究有助于更好地理解OSF的發(fā)生、發(fā)展，及OSF發(fā)生、發(fā)展過程中CD34和bFGF的具體作用機(jī)制。本研究為CD34和bFGF作為OSF的診斷標(biāo)志物、治療靶點(diǎn)及臨床預(yù)后提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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（申海菊 編輯）

Expression of CD34 and basic fibroblast growth factor and its significance in oral submucous fibrosis*

De-yu LIU1,Xin-chun JIAN2,Pu XU1,Rong ZHU1,Chao ZHOU1,Yuan WANG1
(1.Stomatology Center,the Affiliated Haikou Hospital,Xiangya Medical School,Central South University,Haikou,Hainan 570208,P.R.China;2.Department of Oral and Maxillofacial Surgery,Xiangya Hospital,Central South University,Changsha,Hunan 410008,P.R.China)

【Objective】To evaluate the immunoreactivity of CD34 and basic fibroblast growth factor (bFGF)in different histological grades of oral submucous fibrosis(OSF).【Methods】A total of 30 cases of OSF were included in the study and mean vascular density(MVD)was calculated using CD34 and bFGF.【Results】Using CD34,MVD in the controls,the early OSF,the moderately advanced OSF and the advanced OSF was 42.08,20.48,17.40 and 14.85,respectively.As evidenced by bFGF expression,MVD in the controls,the early OSF,the moderately advanced OSF and the advanced OSF was 32.50,15.55,13.88 and 14.50,respectively.The difference in MVD between the cases and the controls was statistically significant(P =0.000).Epithelium thickness(ET)in the controls was in the range of 20～37 with the mean ET of 32.90 while the OSF cases showed mean ET of 16.10.The ET was statistically different between the OSF cases and the controls(P=0.000)as the mean ET was 15.45 in the early OSF,17.29 in the moderately advanced OSF and 9.50 in the advanced OSF.The correlation of ET amongst different stages of OSF and controls was also statistically significant.【Conclusion】Mean vascular density and ET significantly decrease as OSF advances.

basic fibroblast growth factor；CD34；oral submucous fibrosis

R739.85；R781.59

A

1005-8982（2015）29-0007-05

2015-06-25

國家自然科學(xué)基金（No：81260166）

翦新春，E-mail：jianxinchun@hotmail.com