劉華，魏愛淳，秦廣珍，陳清清，周永進

（江蘇省海安縣中醫(yī)院骨傷科，江蘇 海安 226600）

·論著·

雙合湯對酒精性股骨頭壞死兔微循環(huán)的影響*

劉華，魏愛淳，秦廣珍，陳清清，周永進

（江蘇省海安縣中醫(yī)院骨傷科，江蘇 海安 226600）

目的觀察雙合湯對酒精性股骨頭壞死（AOFH）兔微循環(huán)的影響。方法將60只中國白兔隨機分成正常組、模型組、美多巴組及雙合湯低、中、高劑量組。除正常組外，各組給予中國白酒（乙醇含量56%）10 ml/（kg·d）灌胃。在造模同時，各給藥組灌胃給藥，正常組、模型組給予生理鹽水。預(yù)防性灌胃給藥8周后測定血漿一氧化氮（NO）、內(nèi)皮素-1（ET-1）、血清超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）水平。采血后處死實驗動物，觀察組織病理學(xué)的變化。結(jié)果與正常組比較，模型組的NO、SOD水平顯著下降（P＜0.01），ET-1、MDA水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，雙合湯中、高劑量組可顯著降低ET-1、MDA水平，升高NO、SOD水平（P＜0.01）。雙合湯中、高劑量組的NO、ET-1、SOD、MDA水平與正常組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。模型組的空骨陷窩率顯著高于正常組（P＜0.01），軟骨下區(qū)血管計數(shù)顯著低于正常組（P＜0.01）。雙合湯中、高劑量組的空骨陷窩率明顯低于模型組（P＜0.01），軟骨下區(qū)血管計數(shù)明顯高于模型組（P＜0.01）。雙合湯中、高劑量組的空骨陷窩率、軟骨下區(qū)血管計數(shù)與正常組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論雙合湯能有效改善AOFH兔微循環(huán)，從而防治AOFH。

酒精性股骨頭壞死；雙合湯；微循環(huán)；一氧化氮；內(nèi)皮素-1；自由基

酒精性股骨頭壞死（alcohol-inducedosteonecrosis of the femoral head，AOFH）是導(dǎo)致非創(chuàng)傷性股骨頭壞死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）最為常見的因素之一，是由乙醇攝入過量導(dǎo)致[1]。AOFH的西醫(yī)治療主要以人工全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)為主。由于AOFH患者大部分為青壯年，而人工關(guān)節(jié)的使用壽命有限[2]，患者日后面臨多次翻修術(shù)的可能。雖然ONFH確切的發(fā)病機制尚未完全闡明，但普遍認(rèn)為其病理基礎(chǔ)為骨內(nèi)微循環(huán)障礙。祖國醫(yī)學(xué)以痰瘀同治為非創(chuàng)傷性O(shè)NFH的基本治則，在緩解疼痛和改善功能方面，取得較為滿意的療效[3]。雙合湯出自清代名醫(yī)沈金鰲所著《雜病源流犀濁》，筆者將其應(yīng)用于AOFH的臨床治療多年，收益患者較多。本實驗通過觀察雙合湯對AOFH兔微循環(huán)的影響，探討雙合湯對AOFH的治療作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

健康成年中國白兔60只，平均體重（2.5±0.3）kg，雌雄各半，由南通大學(xué)實驗動物中心提供，許可證編號：SYXK（蘇）2012-0031。美多巴（0.25g/片）由上海羅氏制藥有限公司提供，中國白酒（乙醇含量56%）由北京紅星股份有限公司提供。

雙合湯由本院中藥房提供，其處方為：桃仁6 g、當(dāng)歸9 g、白芍9 g、川穹9 g、紅花6 g、陳皮9 g、半夏9 g、茯苓9 g、白芥子9 g、生地黃9 g、生姜6 g、甘草6 g及竹瀝30 g，將藥物加水浸沒180 min后煎煮2次，第1次加8倍的水煎煮90 min，濾取煎液，藥渣加6倍量的水煎煮60 min，2次煎液合并，減壓濃縮至每毫升藥液相當(dāng)于1～2 g生藥，備用。一氧化氮（nitric oxide，NO）、內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒購自上海奧斯生物試劑公司，TDL80-2B臺式離心機購自上海安亭科學(xué)儀器有限公司，分光光度計購自上海強申生化儀器廠，γ放射免疫計數(shù)器購自科大創(chuàng)新股份有限公司，光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 動物分組

按隨機數(shù)字表法，將中國白兔分成6組，即正常組、模型組、美多巴組、雙合湯低劑量組、雙合湯中劑量組及雙合湯高劑量組，每組10只。

1.3 AOFH動物造模及給藥

參照劉忠堂等[4]方法進行造模，所有動物飼養(yǎng)于南通大學(xué)實驗動物中心，每組兔在同樣條件下單獨分籠飼養(yǎng)，自由飲食，溫度、換氣、照明等飼養(yǎng)環(huán)境控制在規(guī)定范圍內(nèi)，飼養(yǎng)1周適應(yīng)環(huán)境后開始實驗，采用灌胃法，除正常組外其余各組給予同種中國白酒10 ml/（kg·d）灌胃。采用白酒灌胃同時，低劑量組、中劑量組、高劑量組分別給予50、100和50 ml雙合湯灌胃，每日早晚各1次；美多巴組給予0.125 g美多巴灌胃，每日早晚各1次；正常組、模型組以100 ml生理鹽水灌胃，每日早晚各1次。

1.4 微循環(huán)指標(biāo)的測定

兔給藥8周后，禁食12 h，在兔耳中心靜脈取血10 ml，以3 500 r/min離心20 min，分離出血漿、血清。然后采用硝酸還原酶法測定血漿NO水平；采用放射免疫法測定血漿ET-1水平；采用黃嘌呤氧化酶法測定血清SOD水平；采用硫代巴比妥酸比色法測定過氧化脂質(zhì)（lipid peroxides，LPO）代謝物，即血清MDA水平代表LPO的水平。以上操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。

1.5 組織形態(tài)學(xué)觀察

采血后，以空氣栓塞法處死實驗動物，取雙側(cè)股骨頭沿冠狀面切開，10%福爾馬林溶液固定，5%稀硝酸脫鈣，常規(guī)石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，顯微鏡下觀察骨細(xì)胞、骨髓脂肪細(xì)胞及骨小梁結(jié)構(gòu)。骨細(xì)胞壞死病理變化以空骨陷窩率表示，即在高倍鏡下，隨機選10個視野，在每個視野中記數(shù)50個骨陷窩，數(shù)出其中的空骨陷窩數(shù)，然后計算空骨陷窩占50個骨陷窩數(shù)的百分比。在中倍鏡下，任選10個視野，通過墨染程度，進行軟骨下區(qū)血管計數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用配對t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組NO、ET-1、SOD、MDA水平比較

模型組的NO、SOD顯著低于正常組（P＜0.01）；模型組的ET-1、MDA顯著高于正常組（P＜0.01）。與模型組比較，雙合湯低劑量組和美多巴組可降低ET-1、MDA水平，升高NO、SOD水平（P＜0.05）。與模型組比較，雙合湯中、高劑量組可顯著降低ET-1、MDA水平，升高NO、SOD水平（P＜0.01）。雙合湯中、高劑量組的NO、ET-1、SOD、MDA與正常組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組NO、ET-1、SOD、MDA水平比較（±s）

表1 各組NO、ET-1、SOD、MDA水平比較（±s）

注：1）與正常組比較，P＜0.01；2）與模型組比較，P＜0.05；3）與模型組比較，P＜0.01

組別NO/（μmol/L）ET-1/（pg/ml）SOD/（u/ml）MDA/（nmol/L）正常組24.49±5.8713.32±3.95243.5±29.922.73±0.43模型組13.14±4.061）25.68±5.981）139.4±21.571）4.96±0.711）美多巴組20.53±4.952）19.39±4.822）203.7±24.632）3.78±0.592）低劑量組19.98±4.892）20.13±4.872）201.8±24.282）3.81±0.612）中劑量組23.68±5.693）14.01±3.983）240.9±29.693）2.86±0.473）高劑量組23.84±5.773）13.64±4.033）241.3±29.743）2.81±0.453）

2.2 組織形態(tài)學(xué)觀察

2.2.1 模型組骨小梁內(nèi)殘留少數(shù)正常骨細(xì)胞，骨細(xì)胞空骨陷窩多見；軟骨下骨髓區(qū)見大片骨髓組織明顯脂肪變性、壞死，髓內(nèi)血管的管腔變狹窄，其內(nèi)見較多血栓與脂肪栓子。見圖1。

圖1 模型組（HE×100）

2.2.2 美多巴組骨小梁內(nèi)殘留的正常骨細(xì)胞占一半，可見骨細(xì)胞空骨陷窩；軟骨下骨髓區(qū)見部分骨髓組織脂肪變性、壞死，部分髓內(nèi)血管的管腔變狹窄，其血栓與脂肪栓子比模型組減少。低劑量組與美多巴組類似。見圖2。

圖2 低劑量組（HE×100）

2.2.3 中劑量組骨小梁內(nèi)殘留的正常骨細(xì)胞占大部分，可見少許骨細(xì)胞空骨陷窩；軟骨下骨髓區(qū)見少許骨髓組織脂肪變性、壞死，少許髓內(nèi)血管的管腔變狹窄，少許血栓與脂肪栓子形成。見圖3。

圖3 中劑量組（HE×100）

2.2.4 高劑量組骨小梁內(nèi)的正常骨細(xì)胞占絕大部分，可見少許骨細(xì)胞空骨陷窩；軟骨下骨髓區(qū)見少許骨髓組織脂肪變性、壞死，少許髓內(nèi)血管的管腔變狹窄，但未見明顯血栓與脂肪栓子形成。見圖4。

2.2.5 正常組表現(xiàn)為完整結(jié)構(gòu)的正常股骨頭組織。見圖5。

2.3 各組空骨陷窩率、軟骨下區(qū)血管計數(shù)比較

模型組空骨陷窩率顯著高于正常組（P＜0.01）；模型組軟骨下區(qū)血管計數(shù)顯著低于正常組（P＜0.01）。雙合湯低劑量組與美多巴組空骨陷窩率低于模型組（P＜0.05）；雙合湯低劑量組與美多巴組軟骨下區(qū)血管計數(shù)高于模型組（P＜0.05）。雙合湯中、高劑量組空骨陷窩率明顯低于模型組（P＜0.01）；雙合湯中、高劑量組軟骨下區(qū)血管計數(shù)明顯高于模型組（P＜0.01）。雙合湯中、高劑量組空骨陷窩率、軟骨下區(qū)血管計數(shù)與正常組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

圖4 高劑量組（HE×100）

圖5 正常組（HE×100）

表2 各組空骨陷窩率、軟骨下區(qū)血管計數(shù)比較（±s）

表2 各組空骨陷窩率、軟骨下區(qū)血管計數(shù)比較（±s）

注：1）與正常組比較，P＜0.01；2）與模型組比較，P＜0.05；3）與模型組比較，P＜0.01

組別空骨陷窩率/%軟骨下區(qū)血管計數(shù)/例正常組10.63±3.259.00±2.45模型組23.94±6.311）5.50±1.861）美多巴組16.86±4.832）7.20±2.1 72）低劑量組17.04±4.912）7.15±2.1 22）中劑量組11.1 9±3.483）8.79±2.383）高劑量組11.01±3.373）8.86±2.413）

3 討論

長期酗酒成為ONFH最為常見的因素之一，酒精中毒是AOFH一個確定的病因[5]，但AOFH確切的發(fā)病機理尚未完全闡明。近年來提出多種學(xué)說，如脂質(zhì)代謝紊亂與酒精的細(xì)胞毒作用學(xué)說、脂肪栓塞與局部血管內(nèi)凝血學(xué)說、骨髓基質(zhì)細(xì)胞成脂分化學(xué)說、骨細(xì)胞脂肪變性等。但學(xué)者普遍認(rèn)為骨內(nèi)微循環(huán)障礙為ONFH的病理基礎(chǔ)，而微血管損傷則是導(dǎo)致骨內(nèi)微循環(huán)障礙的最重要因素[6]。在本實驗中，筆者發(fā)現(xiàn)模型組中股骨頭出現(xiàn)片狀墨汁缺乏現(xiàn)象，提示在AOFH過程中，血管損傷是一個極為重要的環(huán)節(jié)。

NO為血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascular endothelial cell，VEC）釋放最為重要的血管舒張因子，其減少是血管內(nèi)皮功能失調(diào)的主要表現(xiàn)，ET-1是與NO生理作用相拮抗的生物活性物質(zhì)。在VEC中，NO由NO合成酶催化L-精氨酸生成，NO是細(xì)胞間信息傳遞的主要調(diào)節(jié)因子，NO可使血管平滑肌內(nèi)的鳥苷酸環(huán)化酶激活，環(huán)磷酸鳥苷濃度升高，游離Ca2+濃度降低，使血管平滑肌松弛，血管舒張。ET-1是ET家族3種異構(gòu)體之一，分布在VEC中的ET-1是ET家族中發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)最主要的形式。ET-1與血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)的內(nèi)皮素A型受體結(jié)合可收縮血管，ET-1是至今為止最強烈的血管收縮肽，其收縮血管效應(yīng)最持久。正常生理條件下，ET-1與NO保持相對動態(tài)平衡，共同維持血管的正常壓力與血液的良好流動狀態(tài)。但在病理條件下，VEC功能受損時，NO釋放減少、ET-1釋放增多，兩者原有的動態(tài)平衡失調(diào)，導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷[7]，這些改變發(fā)生于股骨頭及其滋養(yǎng)血管，導(dǎo)致股骨頭內(nèi)微循環(huán)障礙，發(fā)生ONFH[8]。本研究結(jié)果顯示，模型組的NO水平顯著低于正常組，而ET-1水平顯著高于正常組，這與齊振熙等[8]的研究結(jié)果一致。另外，模型組中可見髓內(nèi)血管的管腔變狹窄，其內(nèi)有較多血栓與脂肪栓子，說明AOFH中存在微循環(huán)障礙。齊振熙等[8]認(rèn)為長期酗酒可引起血液中ET-1水平升高，使血管強烈收縮，但靜脈的收縮作用明顯強于動脈，致使股骨頭內(nèi)形成高灌低排的狀態(tài)，髓內(nèi)血液淤積，微血管內(nèi)栓塞較易形成。此外，ET-1還可引起血管平滑肌收縮，導(dǎo)致血管腔變狹窄，血栓更易形成；血液中NO水平的減少使血管舒張功能下降，致使股骨頭內(nèi)微血管灌注不足，最終引起股骨頭內(nèi)供血不足。

本研究結(jié)果還顯示，模型組的SOD水平顯著低于正常組，而MDA水平顯著高于正常組，這與MEYE等[9]研究的結(jié)果相似，說明AOFH中存在氧自由基代謝異常。SOD為機體防御內(nèi)、外環(huán)境中超氧離子損傷的主要酶，能清除機體內(nèi)氧自由基，具有保護生物膜與血紅蛋白免受損傷的作用。LPO為氧自由基與細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧反應(yīng)的產(chǎn)物，重要損傷部位是亞細(xì)胞器與細(xì)胞膜，能破壞生物膜，增加血小板的聚集性。LPO是反應(yīng)自由基對機體損傷的指標(biāo)。MDA是LPO的最終產(chǎn)物，其在組織中的水平可直接反應(yīng)機體脂質(zhì)過氧反應(yīng)程度。正常生理條件下，自由基的產(chǎn)生與清除保持平衡，長期酗酒可引起氧自由基代謝異常，股骨頭局部SOD活性降低，LPO水平增加，過多的自由基損傷毛細(xì)血管壁，不僅可引起血管內(nèi)凝血、血栓形成，導(dǎo)致骨內(nèi)微循環(huán)障礙，還可增加骨髓內(nèi)水腫，導(dǎo)致缺血程度加重。同時，血小板與白細(xì)胞積聚并產(chǎn)生自由基，可誘發(fā)組織釋放組織胺，組織胺作用于微血管上皮細(xì)胞，增強毛細(xì)血管的通透性，使骨內(nèi)微循環(huán)障礙，導(dǎo)致股骨頭缺血性壞死[8]。MEYE等[9]認(rèn)為酒精毒性作用使自由基生成增多，導(dǎo)致自由基的主要清除劑——SOD活性降低，LPO反應(yīng)增強，通過影響細(xì)胞膜的通透性引起VEC損傷，小動脈發(fā)生纖維變性與粥樣硬化，血供不足，最終導(dǎo)致股骨頭血運障礙而發(fā)生壞死。

黃立新等[10]應(yīng)用美多巴治療早期AOFH，隨訪27.8個月，患者臨床癥狀、X線與MRI表現(xiàn)有明顯改善。呂智等[11]的動物實驗研究顯示，美多巴能使血漿內(nèi)生長激素明顯升高，促進壞死股骨頭內(nèi)的新骨形成，從而增強壞死股骨頭的力學(xué)性能。本實驗亦選用美多巴作為對照藥物。在臨床中，筆者將ONFH辨證分型為氣滯血瘀型、痰瘀痹阻型及肝腎虧虛型，AOFH歸屬于痰瘀痹阻型，嗜酒無度損傷脾胃，導(dǎo)致脾失健運，肝失疏泄，濕熱內(nèi)蘊，痰濁郁結(jié)，瘀血阻滯。劉道兵等[3]經(jīng)過多年的研究提出脾虛生痰，由痰致瘀，因瘀致痹的非創(chuàng)傷性O(shè)NFH學(xué)說，以及健脾化痰與活血通絡(luò)的痰瘀同治基本原則。

雙合湯有活血化瘀、祛痰通絡(luò)的作用，方中桃仁、紅花、當(dāng)歸、川穹有活血化瘀、通絡(luò)止痛的作用，半夏、茯苓、白芥子、鮮竹瀝、陳皮有祛痰的作用，白芍有酸斂肝陰的作用，生地有黃養(yǎng)肝陰而泄伏熱的作用，生姜汁、甘草有溫中健脾、調(diào)和諸藥的作用，筆者根據(jù)酒精導(dǎo)致ONFH的病因特點，認(rèn)為痰瘀痹阻正是早中期AOFH的發(fā)病機制，故在臨床上，使用雙合湯加減治療塌陷前期AOFH，并獲得較理想療效。

其實雙合湯是以桃紅四物湯與二陳湯合并，并配以白芥子、竹瀝祛痰組成。現(xiàn)代藥理研究證實，桃紅四物湯具有保護血管內(nèi)皮細(xì)胞與改善血管內(nèi)皮細(xì)胞的分泌功能，通過改善血液流變學(xué)而降低血脂[12]；徐世紅等[13]的研究表明，桃紅四物湯具有促進骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨性分化活性的作用；二陳湯能有效調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂[14]。

本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，雙合湯中、高劑量組可顯著降低ET-1、MDA水平，升高NO、SOD水平；中劑量組中見少許髓內(nèi)血管管腔變狹窄，其內(nèi)少許血栓與脂肪栓子形成，而高劑量組中未見髓內(nèi)血管內(nèi)明顯血栓與脂肪栓子形成；雙合湯中、高劑量組空骨陷窩率明顯低于模型組，軟骨下區(qū)血管計數(shù)明顯高于模型組，提示雙合湯能緩解酒精引起的VEC損害，恢復(fù)NO與ET-1、氧自由基代謝平衡，改善股骨頭局部的微循環(huán)，從而起防治AOFH的作用。

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（申海菊 編輯）

Effect of Shuanghe Decoction on microcirculation of rabbits with alcohol-induced osteonecrosis of femoral head*

Hua LIU,Ai-chun WEI,Guang-zhen QIN,Qing-qing CHEN,Yong-jin ZHOU
(Department of Orthopedics,Chinese Medicine Hospital of Haian,Haian, Jiangsu 226600,P.R.China)

【Objective】To observe the effect of Shuanghe Decoction on microcirculation of Chinese white rabbits with alcohol-induced osteonecrosis of the femoral head(AOFH).【Methods】In this study 60 Chinese white rabbits were randomly divided into normal group,model group,Madopar group,and low-,medium-and high-dose Shuanghe Decoction groups.Except the normal group,each group was lavaged with Chinese spirit (alcohol content 56%)10 ml/（kg·d）.Meanwhile each dose group was lavaged with the drug.The normal group and the model group were given normal saline.After 8 weeks the rabbits were sacrificed to collect blood for determination of nitric oxide(NO),endothelin-1(ET-1),superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA).The rabbits were killed after collection of blood,and histopathological changes were detected.【Results】Compared with the normal group,the levels of NO and SOD in the model group were significantly decreased(P＜0.01),and the levels of ET-1 and MDA in the model group were significantly increased(P＜0.01).Compared with the model group,the levels of ET-1 and MDA were significantly decreased in the medium-and high-dose of Shuanghe Decoction groups,and the levels of NO and SOD were significantly increased(P＜0.01).Differences in the levels of NO,ET-1,SOD and MDA between the medium-and high-dose of Shuanghe Decoction groups and the normal group had no statistical significance(P＞0.05).Compared with the normal group,the empty bone lacuna rate in the model group was significantly increased(P＜0.01), and the blood vessel count in hypotegum of cartilage was significantly decreased(P＜0.01).Compared with the model group,the empty bone lacuna rate was significantly decreased in the medium-and high-dose of Shuanghe Decoction groups(P＜0.01),and the blood vessel count in hypotegum of cartilage was significantly increased(P＜0.01).Differences of the empty bone lacuna rate and blood vessel count in hypotegum of cartilage between the medium-and high-dose of Shuanghe Decoction groups and the normal group had no statistical significance(P＞0.05).【Conclusion】Shuanghe Decoction can effectively improve the microcirculation of rabbits with AOFH,thus prevent and cure AOFH.

alcohol-induced osteonecrosis of the femoral head；Shuanghe Decoction；microcirculation；nitric oxide；endothelin-1；free radical

R274.9

A

1005-8982（2015）29-0039-05

2015-01-04

江蘇省南通市市級科技計劃項目（No：HS13933）

魏愛淳，E-mail：jshawac@163.com