梁夢，王敏，朱蓓蓓，張會(huì)芳，盧仙球

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院，浙江 杭州 310005；2.暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510632）

·論著·

乳腺癌易感基因1和切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1 mRNA在乳腺癌中的表達(dá)及意義*

梁夢1，王敏1，朱蓓蓓2，張會(huì)芳1，盧仙球1

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院，浙江 杭州 310005；2.暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510632）

目的研究乳腺癌易感基因1（BRCA1）和切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1（ERCC1）在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及臨床意義。方法采用原位雜交技術(shù)（ISH）檢測BRCA1和ERCC1 mRNA在乳腺癌癌前病變和乳腺癌組織芯片中的表達(dá)，以及與乳腺癌臨床病理因素的關(guān)系。結(jié)果①BRCA1和ERCC1 mRNA在乳腺癌旁正常組織、乳腺癌癌前病變及乳腺癌組織中的陽性表達(dá)率呈遞減趨勢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。②BRCA1和ERCC1 mRNA在乳腺癌的表達(dá)差異顯著并具有相關(guān)性（P＜0.01）。③BRCA1 mRNA的陽性表達(dá)與乳腺癌組織學(xué)分級、腫瘤大小呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與發(fā)病年齡、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)（P＞0.05），ERCC1 mRNA的表達(dá)與腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），與患者發(fā)病年齡、組織學(xué)分級及臨床分期無關(guān)（P＞0.05）。結(jié)論BRCAl與ERCC1 mRNA表達(dá)的減少可能與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，兩基因的聯(lián)合檢測有利于乳腺癌的早期診斷與治療。

乳腺癌癌前病變；乳腺癌；乳腺癌易感基因1（BRCA1）；切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1（ERCC1）；原位雜交

近年來，隨著乳腺癌發(fā)病率的逐年遞增，針對其發(fā)病機(jī)制及治療方案的探索成為研究熱點(diǎn)。許多研究表明，DNA的損傷修復(fù)能力在一定程度上決定腫瘤的發(fā)生[1]，各種原因所致的DNA修復(fù)基因異常突變及甲基化都可引起其功能的失活和表達(dá)缺失，導(dǎo)致細(xì)胞基因組的不穩(wěn)定，罹患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)增大[2-3]。乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）和切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1（excision repair cross-complement gene 1，ERCC1）作為DNA損傷修復(fù)路徑的關(guān)鍵因子，在維系生物體基因組的穩(wěn)定及組織細(xì)胞的生長中起著重要的作用。本研究以高通量、多樣本乳腺疾病組織芯片為基礎(chǔ)，結(jié)合原位雜交技術(shù)（in situ hybridization，ISH）聯(lián)合檢測BRCA1和ERCC1 mRNA在乳腺癌癌前病變和乳腺癌中的表達(dá)，以探討其在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及相互關(guān)系，為乳腺癌發(fā)病的早期基因篩查及臨床診治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

乳腺疾病組織芯片購自陜西超英生物科技有限公司，內(nèi)含乳腺組織標(biāo)本芯粒68例。其中患者年齡22～83歲，中位年齡50歲。乳腺癌36例（浸潤性導(dǎo)管癌23例，浸潤性小葉癌4例，髓樣癌3例，黏液癌3例，導(dǎo)管內(nèi)癌3例），乳腺癌癌前病變22例（乳腺增生性病變13例，不典型增生9例），癌旁遠(yuǎn)端正常乳腺組織10例。每例點(diǎn)樣直徑1.5 mm，厚5μm，各點(diǎn)樣經(jīng)病理復(fù)閱確診。上述病例均為散發(fā)性女性患者，無乳腺癌家族史，其中36例癌癥患者術(shù)前均未接受放射及化學(xué)治療。

1.2 方法

試劑盒購自武漢博士德生物有限公司，為多相寡核苷酸探針，地高辛高敏感標(biāo)記，BRCA1的序列為：5'-TCTTAGAGTGTCCCATCTGTCTGGAGTTGA-3'；5'-TTCATAGTTGTTCTAGCAGTGAAGAGATAA-3'；5'-AGCCAGATGCCTGGACAGAGGACAATGGCT-3'。ERCC1的序列為：5'-CCTCAGACCTACGCCGAATAT GCCATCTCACAGCC-3'；5'-TTCGTGCGCAATGTGCC CTGGGAATTTGGCGACGT-3'；5'-GCTACCACAACC TCACCCAGACTACATCCATGGG-3'。探針標(biāo)記及雜交檢測程序按試劑盒說明書操作，以試劑盒內(nèi)配置陽性切片為陽性對照標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)RNA ase消化1 h后雜交為陰性對照組。雜交液中不加探針結(jié)果為陰性。若出現(xiàn)非特異性染色，通過不加探針及陰性樣本做對照加以排除。

1.3 結(jié)果評定標(biāo)準(zhǔn)

顯色后芯粒完整，無掉片組織點(diǎn)，原位雜交陽性信號為胞漿呈棕黃色或棕褐色（見圖1）。無明顯陽性反應(yīng)細(xì)胞為陰性（-）；陽性細(xì)胞＞10%、染色較強(qiáng)者為陽性（+）。

圖1 乳腺癌芯片大體圖（ISH×40）

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，樣本間比較用χ2檢驗(yàn)及Fishers精確檢驗(yàn)，兩因素相關(guān)性用Spearman等級相關(guān)分析法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BRCA1 mRNA的表達(dá)

原位雜交結(jié)果顯示，BRCA1的mRNA陽性表達(dá)呈棕黃色或棕褐色顆粒分布于細(xì)胞漿（見圖2）。癌旁正常組織、癌前病變及癌組織的陽性表達(dá)率分別為80.0%（8/10）、40.9%（9/22）和16.7%（6/36），3組間陽性表達(dá)率呈遞減趨勢，且表達(dá)差異具有相關(guān)性，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=14.754，P=0.001）。同癌旁正常組織比較，BRCA1 mRNA在癌前病變及癌組織中的陽性表達(dá)率明顯下降（χ2=4.219，P＜0.05；χ2=14.827，P＜0.05），而其在乳腺癌癌前病變中的表達(dá)亦明顯高于乳腺癌中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.185b，P＜0.05）。見表1。

2.2 ERCC1 mRNA的表達(dá)

經(jīng)原位雜交檢測，ERCC1 mRNA表達(dá)信號定位于細(xì)胞漿（見圖2），其在乳腺癌旁正常組織、癌前病變及癌組織的陽性表達(dá)率呈遞減趨勢，分別為90.0%（9/10）、50.0%（11/22）和22.2%（8/36），3者間陽性表達(dá)差異具有相關(guān)性，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=15.888，P=0.000）。與癌旁正常組織比較，ERCC1 mRNA在癌前病變及癌組織中的陽性表達(dá)率下降明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.693，P＜0.05；χ2=15.431，P＜0.01），而乳腺良性病變同乳腺癌比較，ERCC1 mRNA陽性表達(dá)下降明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.783，P＜0.05）。見表1。

圖2 BRCA1和ERCC1 mRNA的ISH檢測（×200）

表1 BRCA1和ERCC1 mRNA在乳腺病變中的表達(dá)

2.3 BRCA1與ERCC1 mRNA在乳腺癌中表達(dá)的相關(guān)性

通過對BRCA1、ERCC1 mRNA表達(dá)的相關(guān)分析，30例BRCA1 mRNA陰性表達(dá)的乳腺癌中，ERCC1 mRNA陽性表達(dá)2例，而6例BRCA1 mRNA陽性表達(dá)的乳腺癌中，ERCC1 mRNA也同時(shí)陽性表達(dá)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)兩者顯著相關(guān)（r=0.837，P＜0.01）。見表2。

表2 BRCA1和ERCC1 mRNA在乳腺癌中表達(dá)的相關(guān)性例

2.4 BRCA1和ERCC1 mRNA表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

BRCA1 mRNA的陽性表達(dá)與乳腺癌組織學(xué)分級和腫瘤大小呈負(fù)相關(guān)（χ2=4.425，P＜0.05；χ2=6.545，P＜0.05），與患者發(fā)病年齡、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)（P＞0.05），ERCC1 mRNA表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤大小呈負(fù)相關(guān)（χ2=4.251和8.233，P＜0.05），與患者發(fā)病年齡、組織學(xué)分級、臨床分期無關(guān)（P＞0.05）。見表3。

表3 BRCA1和ERCC1 mRNA表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系例（%）

續(xù)表3

3 討論

20世紀(jì)90年代，人們通過對早發(fā)型乳腺癌和卵巢癌的家族遺傳基因譜系分析，發(fā)現(xiàn)BRCA1作為一種特異而典型的抑癌基因，在人類乳腺腺管形成、細(xì)胞分化及上皮細(xì)胞增殖過程中起重要作用[4]。近年來，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為乳腺癌高危患者有家族遺傳性BRCA1基因突變，其雜合性丟失、表達(dá)的不穩(wěn)定性等因素均與乳腺癌的發(fā)病密切相關(guān)[5-7]，而其在非家族散發(fā)性乳腺癌中未發(fā)現(xiàn)突變，僅有報(bào)道該基因蛋白及mRNA水平在散發(fā)性乳腺癌組織中的表達(dá)明顯下降或失表達(dá)并有部分異位表達(dá)現(xiàn)象[8-10]。有研究表明，從乳腺上皮增生到癌的發(fā)生可能是連續(xù)進(jìn)展的過程，若將癌旁正常組織的基因改變與癌組織進(jìn)行比較，基本可以反映該基因在乳腺癌發(fā)生和進(jìn)展中的作用[11]。本研究結(jié)果顯示，與癌旁正常組織比較，BRCA1 mRNA在癌前病變及癌組織的陽性表達(dá)率明顯下降，且具有等級相關(guān)性（P＜0.05），進(jìn)一步證實(shí)BRCA1在乳腺疾病由良性向惡性轉(zhuǎn)變的過程中起重要作用[12]。另有研究顯示，該基因的表達(dá)與乳腺癌的組織學(xué)分級和腫瘤大小呈負(fù)相關(guān)，提示BRCA1的異常表達(dá)與散發(fā)型早期乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和不良預(yù)后密切相關(guān)[13]。通過對特定人群BRCA1的檢測，有利于乳腺癌及其他相關(guān)惡性腫瘤的早期診斷與治療。

ERCC1是一種高度保守的單鏈DNA核酸內(nèi)切酶，該基因所編碼的297個(gè)氨基酸可參與DNA修復(fù)系統(tǒng)中的核苷酸切除修復(fù)路徑修復(fù)損傷，以確保基因組的完整性。有關(guān)腫瘤發(fā)生和發(fā)展的學(xué)說認(rèn)為，腫瘤是致癌相關(guān)的危險(xiǎn)因素暴露造成DNA的損傷，再加上DNA修復(fù)基因表達(dá)低下，使基因損傷不斷地在上皮細(xì)胞內(nèi)累積，導(dǎo)致癌基因和抑癌基因突變等一系列連續(xù)事件的發(fā)生[14]。當(dāng)ERCC1表達(dá)低下時(shí)，其對損傷細(xì)胞的修復(fù)能力亦減弱，從而使損傷細(xì)胞在體內(nèi)不斷積聚，最終導(dǎo)致癌癥的發(fā)生，因此ERCC1低表達(dá)常伴隨著癌癥發(fā)病率的增加，而過表達(dá)與化療耐藥有關(guān)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，同癌旁正常組織相比，ERCC1在癌前病變及癌組織中的陽性表達(dá)率下降明顯（P＜0.05，P＜0.01），且在腫塊較大，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中表達(dá)率減少，不僅證實(shí)ERCC1基因低表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)，也提示預(yù)后不佳。目前，認(rèn)為該基因的表達(dá)可作為判斷腫瘤易感性的一個(gè)有價(jià)值的生物標(biāo)志[16]，也為治療及預(yù)后評估提供導(dǎo)向。

綜上所述，BRCA1、ERCC1基因作為DNA修復(fù)系統(tǒng)中的2個(gè)關(guān)鍵因子，在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用且可能具有相關(guān)協(xié)同性，目前國內(nèi)對兩基因的檢測多集中于蛋白表達(dá)方面，本研究則側(cè)重于mRNA水平的研究，通過原位雜交技術(shù)對兩基因進(jìn)行聯(lián)合檢測。原位雜交技術(shù)同其他技術(shù)相比具有操作流程簡便、可與多種檢測方法合并，并易于將mRNA基因活性同組織細(xì)胞形態(tài)相結(jié)合，已較為普遍地為研究者們所應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)研究以期通過兩修復(fù)基因的表達(dá)改變反映乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程，為乳腺癌及其他相關(guān)惡性腫瘤的高危篩檢提供幫助。

[1]王芹,劉強(qiáng),樊賽軍,等.XRCC1基因單核苷酸多態(tài)性與腫瘤易感性[J].中國臨床醫(yī)師雜志,2014,8(6):1123-1126.

[2]韋曄,李建祥.DNA修復(fù)基因甲基化與腫瘤發(fā)生關(guān)系的研究進(jìn)展[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2013,33(4):500-503.

[3]CLARICE P,SILVIA S,ANTONELLA T,et al.Polymorphisms in base excision repair genes:breast cancer risk and individual radiosensitivity[J].World Journal of Clinical Oncology,2014,5(5): 874-882.

[4]任婕,魏敏杰,金鋒,等.散發(fā)性乳腺癌中影響B(tài)RCA1蛋白失表達(dá)的參數(shù)分析[J].中國腫瘤臨床,2008,35(2):99-103.

[5]SIMARD J,DUMONT M,MOISAN AM,et al.Evaluation of BRCA1 and BRCA2 mutation prevalence,risk prediction models and a multistep testing approach in French-Canadian families with high risk of breast and ovarian cancer[J].J Med Genet, 2007,44(2):107-121.

[6]AHN SH,SON BH,YOON KS,et al.BRCA1 and BRCA2 germline mutations in korean breast cancer patient s at high risk of carrying mutations[J].Cancer Lett,2007,245(1/2):90-95.

[7]韋薇,李秋云,唐瑋,等.BRCA1基因在散發(fā)性乳腺癌中的表達(dá)及異常甲基化[J].重慶醫(yī)學(xué),2015,44(9):1174-1176.

[8]RAKHA EA,EL-SHEIKH SE,KANDIL MA,et al.Expression of BRCA1 protein in breast cancer and its prognostic significance[J]. Hum Pathol,2008,39(6):857-865.

[9]方宏才,張國強(qiáng),曹傳培,等.BRCA1和IGF1R在乳腺良惡性腫瘤中的表達(dá)及其意義[J].廣東醫(yī)學(xué),2010,31(1):90-92.

[10]FU YY.The function of BRCA1 gene and its structure features upstream regulation sequence[J].Carcinogenesis Teratogenesis and Mutagenesis,2002,4(1):47-49.

[11]馬金柱,張嘉玲,劉明,等.BRCA1與p53在散發(fā)性乳腺癌中的表達(dá)[J].實(shí)用腫瘤雜志,2011,26(3):233-235.

[12]馬文浩,韓玉貞,桑晶,等.BRCA1在散發(fā)性乳腺癌干細(xì)胞中的表達(dá)及意義[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2012,28(1):19-21.

[13]ZHANG QL,ZHANG QH,CONG H,et al.The ectopic expression of BRCA1 is associated with genesis,progression,and prognosis of breast cancer in young patients[J].Diagn Pathol, 2012,7(1):181.

[14]梁發(fā),謝忠.ERCC1、BRCA1在胃癌中的研究進(jìn)展[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2011,32(2):262-264.

[15]林肖鷹,陳小巖,黃穎.切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1在乳腺癌中的表達(dá)及意義[J].臨床腫瘤學(xué)雜志,2013,18(12):1096-1099.

（申海菊 編輯）

Expression of BRCA1 and ERCC1 mRNA in breast tumor and its clinical significance*

Meng LIANG1,Min WANG1,Bei-bei ZHU2,Hui-fang ZHANG1,Xian-qiu LU1
(1.The Third Affiliated Hospital,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou,Zhejiang 310005,P.R.China;2.The First Affiliated Hospital,Jinan University, Guangzhou,Guangdong 510632,P.R.China)

【Objective】To investigate the role of breast cancer susceptibility gene 1(BRCA1)and excision repair cross-compliment gene 1(ERCC1)in the development and progression of breast cancer and their clinical significance.【Methods】The mRNA levels of BRCA1 and ERCC1 in precancerous lesions and breast cancers were determined by in situ hybridization(ISH)using a tissue microarray,their correlation and clinicopathological factors were determined in 36 cases of breast cancer patients.【Results】①The positive rates of BRCA1 and ERCC1 mRNA in the normal tissues adjacent to breast cancer,the breast precancerous lesions and the breast cancer tissues progressively decreased；their expressions in the three kinds of tissues were significantly different(P＜0.05).②The expressions of BRCA1 and ERCC1 mRNA in the breast cancer were significantly different and correlated(P＜0.01).③The positive expression of BRCA1 mRNA was in negative correlations with the histological grade and tumor size of the breast cancer(P＜0.05),and unrelated to the age of onset,clinical stage or lymph node metastasis.The expression of ERCC1 mRNA was in negative correlations with tumor size and lymph node metastasis(P＜0.05),but not significantly correlative to other clinic pathological features(P＞0.05).【Conclusions】Down-regulation of BRCA1 and ERCC1 mRNA may be corre－lated with development and progression of breast cancer,and combined examination of both genes may be helpful for early diagnosis and treatment of this disease.

breast precancerous lesion；breast cancer；breast cancer susceptibility gene 1；excision repair cross-compliment gene 1；in situ hybridization

R737.9

A

1005-8982（2015）29-0018-05

2015-03-09

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院醫(yī)藥衛(wèi)生科研計(jì)劃基金（No：ZS12CA07）