楊晨，趙文靜，孟天麗

[1.徐州醫(yī)學院（江蘇省麻醉學重點實驗室），江蘇 徐州 221004；2.徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科，江蘇 徐州 221006]

·論著·

C型鈉尿肽對百草枯致肺纖維化小鼠Toll樣受體4表達的影響

楊晨1，趙文靜2，孟天麗1

[1.徐州醫(yī)學院（江蘇省麻醉學重點實驗室），江蘇 徐州 221004；2.徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科，江蘇 徐州 221006]

目的觀察C型鈉尿肽（CNP）對百草枯（PQ）誘導的小鼠肺纖維化的保護作用及機制。方法72只雄性昆明小鼠隨機分為對照組（D組）、模型組（PQ組）和治療組（CNP組），每組24只。分別于給藥后7、14、21和28 d處死小鼠，收集肺組織，監(jiān)測小鼠一般情況，Western blot檢測肺組織Toll樣受體4（TLR4）表達。結果與D組相比，PQ組7、14、21和28 d TLR4表達明顯升高，肺損傷嚴重，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；CNP組各指標無明顯變化。結論CNP對PQ誘導的小鼠肺纖維化有保護作用，可能與其抑制TLR4表達有關。

C型鈉尿肽；百草枯；肺纖維化；Toll樣受體4

百草枯（Paraquat，PQ）是一種非選擇性的高效接觸性除草劑，對人畜有較強毒性，PQ中毒后可致肺、腎、肝等多臟器功能損傷，肺是主要受損的靶器官[1]。誤服或自殺服用PQ導致中毒是臨床常見的急危重癥，其具體的中毒機制尚未明確，無特效解毒藥物，臨床病死率高達80%[2]。死亡的首要原因是漸進的不可逆肺纖維化引起進行性呼吸衰竭[3]。C型鈉尿肽（C-type natriuretic peptide，CNP）是鈉尿肽家族的第3個成員，由血管內皮細胞產(chǎn)生，具有抗炎和抗增殖能力[4]。最新研究表明，Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）活化增加轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β)的敏感性，同時導致成纖維細胞增多[5]。本實驗通過建立小鼠百草枯中毒致肺纖維化模型，觀察肺組織TLR4的激活和表達，旨在從動物實驗的角度探討CNP干預效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥品及主要試劑

清潔級雄性昆明小鼠，8～10周齡，體重30～35 g，由徐州醫(yī)學院實驗動物中心提供。百草枯粉劑（上海藥物研究所）純度＞99.4%，CNP（美國Phoenix Biotech公司），TLR4單抗（美國ABCOM公司），其他試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 動物分組和模型的建立

小鼠室溫條件下飼養(yǎng)在鼠籠中，保持濕度。實驗前飼養(yǎng)1周，使小鼠適應環(huán)境，期間密切觀察。實驗過程中自由進食、水，用生理鹽水配制成藥物溶液。按隨機數(shù)字表法將72只雄性昆明小鼠平均分為3組：①對照組（D組）生理鹽水0.1 ml/d；②模型組（PQ組）百草枯（10 mg/kg）0.1 ml/d；③治療組（CNP組）百草枯（10 mg/kg）0.1ml/d+CNP 3μg/（kg·d）。給藥方式：①腹腔注射生理鹽水+PQ，3 d/次，共5次；②尾靜脈注射CNP，2 d/次，至28 d。各組分別于染毒后7、14、21和28 d處死6只小鼠，打開胸腔，取出完整肺組織。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠一般情況實驗期間觀察小鼠活動、精神及呼吸等。

1.3.2 肺組織TLR4蛋白測定取肺組織制備勻漿，用Western blot檢測蛋白，蛋白樣品經(jīng)電泳、轉膜、封閉、加兔抗TLR4多克隆抗體孵育，漂洗，加羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）孵育，再漂洗等步驟后，用化學發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色，在成像儀中觀察結果。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，組間比較用q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

D組小鼠活潑好動，精神狀態(tài)佳，呼吸平穩(wěn)，毛發(fā)色澤光亮潔凈，體重增加。PQ組小鼠表現(xiàn)為倦怠嗜睡，活動少，呼吸急促，毛發(fā)色澤暗淡，體重增加緩慢，早期體重減輕。與PQ組小鼠比較，CNP組小鼠中毒反應相對較輕。

2.2 肺組織TLR4蛋白含量變化

與D組相比，PQ組TLR4蛋白含量顯著升高；CNP組無明顯變化。見圖1～4。

圖1 第7天各組TLR4蛋白含量表達

圖2 第14天各組TLR4蛋白含量表達

圖3 第21天各組TLR4蛋白含量表達

圖4 第28天各組TLR4蛋白含量表達

3 討論

百草枯又名克蕪蹤，為聯(lián)吡啶類化合物。1962年發(fā)現(xiàn)以來，被世界各國廣泛應用于農(nóng)業(yè)，可經(jīng)皮膚、呼吸道、消化道吸收造成急性中毒。PQ中毒2 h后，即出現(xiàn)肺纖維化[6]，早期死于急性肺損傷（acute lung injury，ALI）所致的急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），晚期死于肺間質纖維化所致的呼吸衰竭[7]。最新研究顯示，PQ中毒致肺纖維化是損傷、炎癥、修復和肺損傷相互作用的結果。百草枯中毒的發(fā)病機制包括兩個階段，初始階段涉及多個器官急性損傷，可能會出現(xiàn)死亡，并與肺、腎、循環(huán)衰竭等有關。這個階段的存活患者可發(fā)展到第二階段，其特征幾乎只損傷肺，廣泛的肺纖維化隨之而來，導致呼吸困難、紫紺、呼吸衰竭，最終死亡。百草枯中毒后，肺組織中PQ濃度比血漿濃度高10～90倍[8]，主要通過Ⅰ、Ⅱ型肺泡上皮細胞和細支氣管膜上多胺運輸系統(tǒng)[9-10]的主動攝取而選擇性地在肺內聚集，其肺毒性是由一系列氧化還原反應循環(huán)及細胞內氧化應激反應所致。

ALI是各種直接或間接因素導致的肺泡上皮細胞和毛細血管內皮細胞損傷，造成彌漫性肺間質及肺泡水腫，導致的非心源性的急性低氧性呼吸功能不全。發(fā)展至嚴重階段（氧合指數(shù)＜200）稱為ARDS。肺纖維化被定義為一種慢性免疫應答，其特征在于炎癥、組織重塑和修復過程。無論任何病因，纖維化疾病都有相似之處，包括一個持久刺激也會導致結締組織元素的沉積，從而重塑組織的正常結構。成纖維細胞參與機體炎癥反應，并同時啟動纖維化機制，細胞外基質沉積可以在一定程度上修復急性炎癥反應引起的組織損傷，過度的沉積則會引起組織纖維化疾病，并導致一系列結構和功能的改變。PQ誘導的肺纖維化特征是肺血管阻塞、膠原纖維顯著增加和成纖維細胞在肺泡積聚[11]，是一種慢性、進行性、不可逆的間質性肺疾病。

CNP最初在豬腦中分離，為22個氨基酸的多肽，結構與心房鈉尿肽和腦鈉尿肽有關，三者遺傳性不同，但都具有利尿和舒血管作用[12]。人類CNP前體分子包括126個氨基酸殘基，在種屬間大量存在，鼠、豬和人有95%同源性[13]。CNP主要是由血管內皮細胞分泌的具有調節(jié)血管活性的多種生物學功能的多肽，其受體廣泛分布于血管平滑肌、心肌、腎臟、腎上腺、骨/軟骨、神經(jīng)元等多器官組織，參與調節(jié)血管緊張度、組織損傷修復、免疫調節(jié)、細胞保護及促進軟骨骨化等體內重要臟器的多種生理功能[14]。CNP是鈉尿肽受體-B唯一的天然配體，對ALI具有保護作用[15]。

TGF-β1是公認的參與肺纖維化的關鍵因子[16-17]，誘導膠原合成和基質改變，PQ中毒早期即可檢測到TGF-β1表達，并在整個纖維化進展的過程中持續(xù)表達。TLRs是一種模式識別受體，廣泛表達于細胞表面。TLR4作為已識別的哺乳動物和人類共同擁有的10種Toll樣受體之一[18]，能夠激活與適應性免疫有關的基因。在多種臟器纖維化中，TGF-β和TLR4表達增加且相互作用[19-22]。有研究報道，TLR4基因失活可明顯減弱膿毒癥癥狀，通過改善肺順應性，阻止肺水腫的形成，改善組織學變化[23]。

目前，國內外文獻中未發(fā)現(xiàn)有關外源性CNP對PQ中毒致肺纖維化影響的報道。實驗結果顯示，早期給予CNP干預，可以降低TLR4蛋白的表達，從而減輕肺組織病理損傷，具有一定的保護作用。

[1]佟飛,扈琳,田英平,等.褪黑素對急性百草枯中毒大鼠肺組織核因子-kB誘導型一氧化氮合酶的影響及治療作用的研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志,2006,16(24):3733-3735.

[2]鄭福祿,劉宇鵬.老年百草枯中毒患者血清酶學變化及意義[J].中國老年學雜志,2011,31(7):1253-1254.

[3]GE W,WANG HL,SUN RP.Clinical characteristics of paraquat poisoning in 22 Chinese children[J].Indian Journal of Pediatrics, 2013,81(7):670-674.

[4]SCHACHNER T,ZOU Y,OBERHUBER A,et al.Perivascular applicationofC-type natriuretic peptide attenuates neointimal hyperplasia in experimental vein grafts[J].European Journal of Cardio-thoracic Surgery,2004,25(4):585-590.

[5]BHATTACHARYYA S,KELLEY K,MELICHIAN DS,et al. Toll-like receptor 4 signaling augments transforming growth factor-β responses a novel mechanism for maintaining and amplifying fibrosis in scleroderma[J].American Journal of Pathology, 2013,182(1):192-205.

[6]XIE H,WANG R,TANG X,et al.Paraquat-induced pulmonary fibrosis starts at an early stage of inflammation in rats[J].Immunotherapy,2012,4(12):1809-1815.

[7]劉會芳,趙燕燕,魏芳,等.生脈注射液對百草枯中毒大鼠急性肺損傷的保護作用[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志,2009,19(24):3688-3691.

[8]崔曉悅,俞鳳.百草枯中毒患者血清黃嘌呤氧化酶及超氧化物歧化酶水平變化及其意義[J].安徽醫(yī)藥,2014,18(9):1737-1740.

[9]SMITH LL,LEWIS CP,WYATT I.The importance of epithelial uptake systems in lung toxicity[J].Environmental Health Perspectives,1990,85:25-30.

[10]錢潔,呂利雄,朱長清.百草枯肺與多胺轉運體[J].中國勞動衛(wèi)生職業(yè)雜志,2010,28(7):554-556.

[11]MALEKINEJAD H,MEHRABI M,KHORAMJOUY M,et al. Antifibrotic effect of atorvastatin on paraquat-induced pulmonary fibrosis:role of PPARγ receptor[J].European Journal of Pharmacology,2013,720(1/2/3):294-302.

[12]CHEN HH,BURNETT JC.C-type natriretic peptide:the endothelial component of the natriuretic peptide system[J].Journal of Cardiovascular Pharmacology,1998,32(3):22-28.

[13]關德明.C型促尿鈉多肽研究現(xiàn)狀[J].哈爾濱醫(yī)科大學學報, 2000,5(34):388-390.

[14]LINCOLN RP,SARAH AH,DEBORAH MD.Natriuretic peptides,their receptors and cyclic guanosine monophosphate-dependent signaling functions[J].Endocrine Reviews,2006,27(1): 47-72.

[15]張劍鋒,李超乾,陳雯,等.C型鈉尿肽及其受體在急性肺損傷大鼠肺組織的表達變化及其意義[J].蛇志雜志,2010,22(1):5-8.

[16]曾玉蘭,冷凡.大蒜素對肺纖維化大鼠肺組織α-SMA和TGF-β1表達的影響[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志,2011,21(15):1814-1818.

[17]彭張哲,朱玉嫻,陶立堅,等.卡托普利對博萊霉素致小鼠肺纖維化的防治作用及其機制探索[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志,2010,20(4): 539-543.

[18]YOKOTA S,OKABAYASHI K,YOKOSAWA N,et al.Measles virus P proteinsuppresses Toll-likereceptorsignalthrough up-regulation of ubiquitin-modifying enzyme A20[J].Faseb J, 2008,22(1):74-83.

[19]PULSKENS WP,RAMPANELLI E,TESKE GJ,et al.TLR4 Promotes fibrosis but attenuates tubular damage in progressive renal injury[J].J Am Soc Nephrol,2010,21(8):1299-1308.

[20]DONG XS,XU XY,SUN YQ,et al.Toll-like receptor 4 is involved in myocardial damage following paraquat poisoning in mice[J].Toxicology,2013,312:115-122.

[21]SEKI E,MINICIS SD,OSTERREICHER CH,et al.TLR4 enhances TGF-β signaling and hepatic fibrosis[J].Nature Medicine, 2007,13(11):1324-1332.

[22]CHEN J,ZENG B,YAO H,et al.The effect of TLR4/7 on the TGF-β-induced smad signal transduction pathway in human keloid[J].Burns,2013,39(3):465-472.

[23]趙雙平,鄔嬌,劉志勇,等.血必凈注射液對膿毒癥患者外周血TLR4表達的影響[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志,2010,20(4):559-561.

（申海菊 編輯）

Effects of C-type natriuretic peptide on Toll-like receptor 4 expression in mice with Paraquat induced pulmonary fibrosis

Chen YANG1,Wen-jing ZHAO2,Tian-li MENG1
(1.Jiangsu Provincial Key Laboratory of Anesthesiology,Xuzhou Medical College,Xuzhou, Jiangsu 221004,P.R.China;2.Department of Intensive Care Medicine,the Affiliated Hosptial,Xuzhou Medical College,Xuzhou,Jiangsu 221006,P.R.China)

【Objective】To observe that protective effect of C-type natriuretic peptide(CNP)on Paraquat induced pulmonary fibrosis in mice and its mechanism.【Methods】Totally 72 male Kunming mice were randomly divided into three groups with 24 in each group:control group(D group),model group(PQ group)and treatment group(CNP group).The mice were sacrificed 7,14,21 or 28 days after administration of drug and the lung tissue was collected.The general physical condition was observed.The expression of Toll-like receptor 4(TLR4)was measured by Western blot.【Results】At the corresponding time point,the pathological damage of lung tissue in the PQ group was significantly more severe than that in the D group and the level of TLR4 in the lung tissue in the PQ group were significantly higher than that in the D group(P＜0.05). Those in the CNP group showed no significant changes compared to the D group.【Conclusion】The protective effect of CNP on Paraquat induced pulmonary fibrosis may be related to its inhibition of TLR4 expression.

C-type natriuretic peptide；Paraquat；pulmonary fibrosis；Toll-like receptor 4

R563.9；R595.4

A

1005-8982（2015）29-0035-04

2015-03-03

趙文靜，E-mail：zhaowj886@sina.com