王釗 陳潔 儲偉明 達(dá)明杰 馬露 吳敏 鐘旖 王子露 宋曉萌 吳煜農(nóng)

1.南京醫(yī)科大學(xué)口腔疾病研究江蘇省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科；3.口腔病理科，南京 210029

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）作為一種口腔頜面部高發(fā)的，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移早且以淋巴轉(zhuǎn)移為主要轉(zhuǎn)移途徑的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)其發(fā)病率排第6位，每年新增約60萬病例。近30年來，OSCC的5年生存率無明顯改善，維持在60%[1-2]。為了改善OSCC的預(yù)后，很多抑癌基因隨之發(fā)現(xiàn)，并用于臨床，取得了較好的臨床效果。脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，SYK）作為一種候選抑癌基因，在多種惡性腫瘤的病理過程中起著極為重要的作用[3-4]。SYK基因在轉(zhuǎn)錄過程中會選擇性拼接，產(chǎn)生兩種蛋白異構(gòu)體[5]，即全長型SYK[SYK（L）]和短縮型SYK[SYK（S）]。近年來，有研究[6-7]發(fā)現(xiàn)SYK（L）在乳腺癌、肝癌中發(fā)揮著抑癌基因的功能，但迄今尚未見其在OSCC組織中表達(dá)的相關(guān)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（realtime quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）、免疫印跡（Western blot）、免疫組織化學(xué)法檢測SYK（L）在OSCC組織中的表達(dá)，初步探討其與OSCC發(fā)生以及轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為進(jìn)一步研究SYK（L）在OSCC中的作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 組織標(biāo)本

選取江蘇省口腔醫(yī)院口腔頜面外科2012—2013年期間OSCC患者27例，其中13例為單純OSCC患者，無頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；14例為OSCC患者伴一側(cè)或雙側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，每例患者收集其癌組織和癌旁組織各一份。所有的組織標(biāo)本及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均經(jīng)過手術(shù)和病理證實(shí)，同時(shí)收集正常口腔黏膜標(biāo)本14例作為正常對照，其中10例來自口腔黏膜良性增生物的正常邊緣，4例來自口腔創(chuàng)傷黏膜組織。每份標(biāo)本都分成3份，一份進(jìn)行RNA的提取，一份進(jìn)行總蛋白的提取，一份運(yùn)用石蠟切片技術(shù)處理。

1.2 SYK（L）特異性抗體定制與檢測

SYK（L）特異性抗體的定制參照文獻(xiàn)[6]，針對SYK（L）特有而SYK（S）缺失的23個(gè)氨基酸，合成氨基酸序列TWSAGGIISRIKSYSFPKPGHRKC，經(jīng)過鑰孔血藍(lán)蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）偶聯(lián)后免疫新西蘭白兔，提取免疫后陽性血清并與抗原親和純化，得到與抗原特異性結(jié)合的抗體（抗體制作由蘇州Abgent生物科技有限公司完成）。

1.3 RT-qPCR引物序列

聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。SYK（L）上游引物序列為：5'-GAATCAAATCATACTCCTTCCCAAA-3'，下游引物序列為：5'-GGCTCATACGGATTGAATGACA-3'。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參，上游引物序列為：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物序列為：5'-GAGATGGTGATGGGATTTC-3'。

1.4 方法

1.4.1 RT-qPCR技術(shù)檢測SYK（L）基因的相對表達(dá)量 用Trizol法提取組織標(biāo)本總RNA（Invitrogen公司，美國），紫外分光光度計(jì)測定其純度和濃度，并用PrimeScript RT Reagent Kit（TaKaRa公司，日本）試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR過程選用FastStart Universal SYBR Green Master（Roche公司，瑞士）試劑盒，在ABI7300HT RT qPCR儀（Applied Biosystems公司，美國）上進(jìn)行。具體反應(yīng)體系參照文獻(xiàn)[8]，總體系20 μL，95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，退火溫度為60 ℃，共35循環(huán)。原始數(shù)據(jù)值（Ct值）換算為基因的相對表達(dá)量，R=2-（ΔCP樣品-ΔCP對照），其中R是SYK（L）相對于內(nèi)參GAPDH的表達(dá)量，ΔCP=CtSYK(L)-CtGAPDH。

1.4.2 Western blot技術(shù)檢測SYK（L）蛋白的表達(dá) 用RIPA裂解液和苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）液提取組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，定量總蛋白樣品為15 μg并上樣，經(jīng)7.5%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）電泳后，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，與相應(yīng)的一抗4 ℃雜交過夜，磷酸鹽吐溫（phosphate-buffered saline tween，PBST）緩沖液漂洗，室溫下用含辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗（1︰3 000稀釋）室溫孵育1 h，洗膜后與化學(xué)發(fā)光HRP底物ECL發(fā)光液顯影劑結(jié)合，經(jīng)ImageQuant LAS 4000發(fā)光成像分析儀曝光并用Image J軟件測定各組SYK（L）與β-actin的灰度值比值作為SYK（L）蛋白的相對表達(dá)量。

1.4.3 免疫組織化學(xué)染色檢測SYK（L）蛋白的表達(dá)組織標(biāo)本經(jīng)多聚甲醛溶液固定并脫水包埋，連續(xù)5 μm切片。二甲苯脫蠟和乙醇梯度水化后，用PBS沖洗。檸檬酸鈉修復(fù)液中微波抗原修復(fù)20 min，待切片自然冷卻至室溫后置于3%過氧化氫中10 min，PBS沖洗，即用型正常山羊血清封閉20 min，4 ℃下SYK（L）（1︰300稀釋）一抗孵育過夜。用Polink-2 plus（GBI公司，美國）試劑盒結(jié)合一抗，DAB試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)公司）染色3 min，蘇木精復(fù)染，二甲苯透明，中性樹脂封片。以β-actin抗體（1︰1 000稀釋，Bioworld公司，美國）染色作為陽性對照，以山羊血清代替一抗作為陰性對照。染色判斷與評分標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[9]，由2位病理科醫(yī)師分別雙盲閱片。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)包含上皮組織的視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，由陽性細(xì)胞所占比例和染色程度綜合評分：陽性細(xì)胞<10%為0分，10%～30%為1分，31%～50%為2分，>50%為3分；細(xì)胞無顯色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。每例綜合積分為前述2個(gè)評分的乘積。積分≤2評判為陰性表達(dá)，>2為陽性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用T檢驗(yàn)分析不同組別SYK（L）基因的相對表達(dá)量；用χ2檢驗(yàn)分析免疫組織化學(xué)SYK（L）的表達(dá)差別，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SYK（L）在OSCC組織中的表達(dá)

RT-qPCR檢測結(jié)果見圖1。SYK（L）基因在口腔正常牙齦組織、癌旁組織及癌組織中表達(dá)量依次降低，各指標(biāo)間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 SYK（L）基因在正常牙齦、癌旁組織、癌組織中的相對表達(dá)量Fig 1 Relative expression of SYK(L) mRNA in normal tissues, OSCC tissues and its matched adjacent non-cancerous tissues

Western blot灰度值分析結(jié)果見圖2。在14例正常口腔黏膜、27例癌旁組織和對應(yīng)27例癌組織中，SYK（L）蛋白的相對表達(dá)量依次降低，且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與RT-qPCR結(jié)論相一致。同時(shí)免疫組織化學(xué)結(jié)果也顯示（圖3）：SYK（L）在正常組織中強(qiáng)陽性表達(dá)，在癌組織中表達(dá)降低或缺失。正常牙齦組織中SYK（L）蛋白陽性表達(dá)率為71.4%（10/14），癌組織中陽性表達(dá)率為29.6%（8/27），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對于同一患者，其癌組織和癌旁組織中SYK（L）表達(dá)也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖4）。

圖2 SYK（L）蛋白在正常牙齦、癌旁組織、癌組織中的表達(dá)Fig 2 Expression of SYK(L) protein in normal tissues, OSCC tissues and its matched adjacent non-cancerous tissues

圖3 SYK（L）在不同組織中的表達(dá)差異 免疫組織化學(xué)Fig 3 Expression of SYK(L) in different tissues immunohistochemistry

2.2 SYK（L）的表達(dá)與OSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

由圖5可見，在癌組織及癌旁組織中，轉(zhuǎn)移組的SYK（L）的相對表達(dá)量與癌組織淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)關(guān)系見圖5。SYK（L）表達(dá)量都比對應(yīng)未轉(zhuǎn)移組的表達(dá)量低，其中SYK（L）蛋白在癌組織中差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.01），而在癌旁組織中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.3 SYK（L）蛋白表達(dá)的定位差異

免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示：正常的牙齦組織中，SYK（L）蛋白在胞漿中均有表達(dá)，陽性表達(dá)率為100%（14/14），其在胞核中的陽性表達(dá)率為64.3%（9/14）；而在癌組織中，SYK（L）蛋白在胞漿中陽性表達(dá)率為100%（14/14），但在胞核中的陽性表達(dá)率明顯降低，僅為25.9%（7/27），SYK（L）蛋白在胞核中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.017）。

圖5 SYK（L）在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異Fig 5 Relative expression of SYK (L) in OSCC and its matched adjacent non-cancerous tissues

3 討論

OSCC是頭頸部最常見的惡性腫瘤，約占全身惡性腫瘤的3%[10]。近年來口腔癌的發(fā)病率逐年增高，且有年輕化、女性化趨勢。治療失敗或局部復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移是口腔癌患者主要死亡原因。雖然經(jīng)過以手術(shù)、放療和化療為主的綜合治療后，口腔癌患者5年生存率達(dá)到60%，但晚期患者5年生存率為20%～40%[11]。因此，尋找口腔癌新的治療靶點(diǎn)一直是該領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。淋巴轉(zhuǎn)移是OSCC主要的轉(zhuǎn)移方式，轉(zhuǎn)移率為50%～59%，且對預(yù)后有著重要影響。OSCC頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移受諸多因素的影響，其中包括患者的免疫狀態(tài)、臨床病理相關(guān)因素、轉(zhuǎn)移相關(guān)基因等，但其相關(guān)分子機(jī)制尚未闡明。

SYK基因最早由日本學(xué)者[12]于1991年從豬脾cDNA中克隆出來，該基因位于人染色體9q22，蛋白相對分子質(zhì)量為72 000，在較長時(shí)間內(nèi)被認(rèn)為是造血細(xì)胞特有的分子，后來發(fā)現(xiàn)SYK在多種非造血細(xì)胞中也有表達(dá)。SYK作為酪氨酸激酶家族成員，其在免疫系統(tǒng)中參與廣泛的信號級聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，隨著細(xì)胞類型、底物、受體的不同，能調(diào)節(jié)多種信號通路。核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是近年來研究熱門的核轉(zhuǎn)錄因子，其在組織損傷、應(yīng)激、細(xì)胞分化、凋亡以及腫瘤微環(huán)境中作用廣泛。SYK可以通過磷酸化NF-κB的抑制物IκB來激活核NF-κB信號通路，發(fā)揮下游轉(zhuǎn)錄功效，啟動或者抑制下游靶基因的轉(zhuǎn)錄功能。Src和表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）作為在腫瘤中研究較為深入的酪氨酸激酶，在腫瘤中表達(dá)異常增高，介導(dǎo)著腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。而SYK可通過降低Src的活性，干擾EGFR及其下游信號分子的磷酸化來抑制Src和EGFR的信號通路。另外，SYK還可以通過激活磷脂酰肌醇激酶、絲裂原活化蛋白激酶等信號通路直接或間接影響細(xì)胞的生長[13]。

自2000年Coopman等[14]首先發(fā)現(xiàn)SYK在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)以來，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)其在肝癌、胃癌、肺癌、黑色素瘤等多種癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，推斷SYK可能是一種潛在的抑癌基因[3]。以往關(guān)于SYK在頭頸癌中表達(dá)的研究甚少，Luangdilok等[8]發(fā)現(xiàn)SYK在頭頸部鱗癌（squamous cell carcinoma of the head and neck，SCCHN）細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，且增加了SCCHN細(xì)胞的運(yùn)動性。而Ogane等[15]研究結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)，SYK在OSCC中表達(dá)缺失，是潛在的抑癌基因。SYK在SCCHN和OSCC中作用的截然相反是否由組織來源的差異導(dǎo)致的，仍需進(jìn)一步證實(shí)。

更深入的研究發(fā)現(xiàn)，SYK在轉(zhuǎn)錄過程中會選擇性地拼接，產(chǎn)生兩種蛋白異構(gòu)體，一種為SYK（L），有研究[5-7]發(fā)現(xiàn)其發(fā)揮著抑癌基因的功能，而選擇性拼接導(dǎo)致IDB域缺失了23個(gè)氨基酸的SYK（S）沒有此項(xiàng)功能[16]。SYK（L）與SYK（S）在亞細(xì)胞定位上也存在差異，這為更加深入研究SYK在OSCC中的亞型差異提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

近年來，洪健等[17]關(guān)于SYK（S）亞型蛋白的研究顯示，SYK（S）可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，首次提示SYK可能扮演著癌基因的角色，這也顯示出區(qū)分SYK不同亞型在研究癌癥發(fā)生發(fā)展過程中的必要性。本研究將SYK（L）在口腔癌中單獨(dú)檢測，結(jié)果顯示SYK（L）在OSCC中表達(dá)下調(diào)，并在轉(zhuǎn)移和非轉(zhuǎn)移患者中表達(dá)趨勢也不同，表明SYK（L）與OSCC的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。這一結(jié)論和既往大部分的報(bào)道相一致，驗(yàn)證了其抑癌基因的作用，同時(shí)也為不同結(jié)論提出合理的解釋，即SYK“抑癌基因”的角色實(shí)際是由SYK（L）亞型擔(dān)任，而SYK（S）可能具有癌基因的功能，兩者功能相反，可能是獲得不同結(jié)論的原因。本研究還發(fā)現(xiàn)SYK（L）在口腔癌中失去核定位能力，這也為SYK（L）在口腔癌中的作用缺失提供了有力證據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)SYK（L）的表達(dá)缺失是OSCC高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率和高侵襲性的重要原因，為進(jìn)一步揭示惡性腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)分子機(jī)制提供了新思路。目前針對腫瘤的治療除傳統(tǒng)的手術(shù)治療、放射治療和化療外，腫瘤的綜合治療，特別是基因治療和免疫治療為腫瘤的治療提供了新途徑。隨著SYK在腫瘤的研究不斷深入及技術(shù)的發(fā)展，相信可為腫瘤的診斷提供新的科學(xué)依據(jù)。同時(shí)提供基因治療，比如對突變或缺失的SYK基因進(jìn)行修補(bǔ)，有望成為治療腫瘤新的方法，將SYK基因轉(zhuǎn)染入免疫細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞，激活更多的免疫細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤免疫作用并阻止腫瘤細(xì)胞的生長與擴(kuò)散。這就進(jìn)一步提示，在頭頸部腫瘤中對于SYK的檢測將能進(jìn)一步促進(jìn)基因治療的步伐，有極強(qiáng)的臨床意義。

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