張斌，郁聽，栗磊，孟祥河

1(浙江工業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，浙江杭州，310014)2(杭州博士達(dá)油脂有限公司，浙江杭州，311103)

植物甾醇(plant sterol，PS)又稱植物固醇，它是一種結(jié)構(gòu)與膽固醇類似但具有多重生理活性的三萜烯。早在19世紀(jì)50年代，人們就發(fā)現(xiàn)了PS的降膽固醇功效，之后又通過(guò)大量的動(dòng)物和臨床試驗(yàn)來(lái)研究PS的每日最適攝入量，歐洲食品安全局推薦每日應(yīng)攝入PS 1.5～3 g，這樣可降低人體內(nèi)7% ～11.3%的低密度脂蛋白膽固醇。PS主要來(lái)自于植物油的不皂化物，需經(jīng)過(guò)分離提取才能富集到高純度的產(chǎn)物，而且PS的水溶性和油溶性均較差，這會(huì)限制其在人體內(nèi)的吸收率。因此，本文就PS上述方面問(wèn)題總結(jié)了近些年國(guó)內(nèi)外的研究進(jìn)展，并對(duì)在食品加工貯藏時(shí)產(chǎn)生的植物甾醇氧化產(chǎn)物(plant sterol oxidation products，POPs)及其食用安全性問(wèn)題展開較全面的綜述。

1 來(lái)源

PS主要以自由醇結(jié)構(gòu)、脂肪酸酯、甾基糖苷及其?；锏刃问酱嬖谟谧匀唤纭S在食用油中以游離和酯化形式為主，這些油的來(lái)源包括堅(jiān)果、谷物、豆類和植物種子等［1-2］。當(dāng)然，從蛋黃、哺乳動(dòng)物的肝臟和甲殼類動(dòng)物等非植物膳食原料中也可獲取少量PS［3］。迄今為止報(bào)道的PS主要來(lái)源有:(1)植物油提取工藝副產(chǎn)物-脫臭餾出物(deodorizer distillate，DD)［4-5］;(2)工業(yè)生產(chǎn)的下腳料浮油［6-7］;(3)釀酒行業(yè)中的發(fā)酵廢棄物［8］。

2 分子結(jié)構(gòu)和生理功效

PS是以環(huán)戊烷多氫菲為主要骨架的3-羥基化合物(圖1)，一般在C-17位上連有由8～10個(gè)碳原子組成的側(cè)鏈，根據(jù)C-5位上有無(wú)雙鍵分為甾醇和甾烷醇。常見的PS有豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇和菜籽甾醇，它們主要的結(jié)構(gòu)區(qū)別在于支鏈大小和雙鍵數(shù)目。

圖1 幾種主要代表性甾醇與膽固醇結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure figures of several main representative sterols and cholesterol

PS C-3位上的OH和C-5位上的雙鍵決定其具有多重生理功效。目前人們研究最多的是PS的降膽固醇功效，而且普遍認(rèn)為PS能與膽固醇競(jìng)爭(zhēng)溶解于小腸內(nèi)腔的膽汁酸微膠束，減少微膠束中膽固醇的含量，使之不能運(yùn)送到達(dá)小腸微絨毛的吸收部位。而Liang等的研究結(jié)果表明，PS通過(guò)調(diào)控膽固醇代謝轉(zhuǎn)運(yùn)脂蛋白和相關(guān)酶的表達(dá)也能減少膽固醇在人體內(nèi)吸收［9-10］。此外，PS 還有抗炎、退熱、美容、抗癌、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)等生理功效。近幾年的研究熱點(diǎn)在減肥和抗氧化兩方面，如Furlan［11］等在動(dòng)物喂養(yǎng)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，小鼠若喂以含2%PS的高脂膳食(其中含有12% 的蛋白質(zhì)和35% 的脂肪)，持續(xù)8周小鼠體重較對(duì)照組明顯減輕。正因?yàn)镻S這么多的生理功效，因此早已被廣泛應(yīng)用于食品、藥品和化妝品等多個(gè)領(lǐng)域［12-14］。

3 PS分離提取技術(shù)

PS部分以酯化形式存在于原材料中，所以提取前一般先進(jìn)行水解使之全部轉(zhuǎn)化成游離PS。水解分為高溫高壓水解和堿水解，后者因條件溫和，且水解皂化一起進(jìn)行，因此使用較普遍。目前PS的提取方法根據(jù)其來(lái)源分:(1)植物油DD中PS提取工藝［15-16］(如圖2所示)。

a途徑適用于游離脂肪酸、甘油三酯和生育酚含量較多的DD，具體是先通過(guò)真空蒸餾或皂化反應(yīng)分離出游離脂肪酸，此時(shí)剩余物質(zhì)主要包括PS、生育酚、烴類、甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯，其中PS與苯甲酸酐酯化生成甾醇酯(sterol ester，SE)，再短程蒸餾去除生育酚，最后轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)后冷卻分離得到PS晶體。含游離脂肪酸和生育酚較少的DD則采用b途徑，由皂化反應(yīng)得到的未皂化物冷卻結(jié)晶分離得到PS粗制品;(2)浮油中PS提取工藝［17］(如圖3所示)。由正己烷萃取得到的未皂化部分經(jīng)熱水沖洗、有機(jī)相濃縮、蒸餾等步驟分別去除無(wú)機(jī)鹽、溶劑和輕餾分等得到PS晶體;(3)天然油料作物中提取PS:該提取工藝與浮油中PS的提取過(guò)程基本相似，只是在原料浸提和萃取時(shí)結(jié)合了微波輔助萃取、超臨界CO2萃取或固相萃取等新提取技術(shù)［18-20］，再通過(guò)高速逆流色譜法等技術(shù)分離純化［21］，PS的結(jié)構(gòu)和純度分析一般采用氣相色譜(gas chromatography，GC)［22-24］。

圖2 脫臭餾出物中甾醇的提取工藝Fig.2 Extraction process of sterol in deodorizer distillate

圖3 浮油中甾醇的提取工藝Fig.3 Extraction process of sterol in tall oil

4 溶解性的改性研究

天然的PS熔點(diǎn)高(130～180℃)，在水中不溶，油溶性也非常低且有白堊味，這些性狀是PS應(yīng)用的瓶頸。因此，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究人員嘗試通過(guò)PS溶解性改性以獲得更好的應(yīng)用。

4.1 PS水溶性研究

國(guó)內(nèi)外對(duì)于PS水溶性研究報(bào)道較少。早期人們主要通過(guò)添加硬脂酸鈉、卵磷脂和單甘酯等單一或復(fù)合乳化劑以改善PS在水中的分散性，或再制成微膠囊應(yīng)用于全脂到無(wú)脂等多種產(chǎn)品［25-26］。但是乳化方法只是提高了PS在水溶性食品中的分散性和穩(wěn)定性，其水溶性并未得到實(shí)質(zhì)改善。受到環(huán)糊精與黃酮類藥物包合應(yīng)用的啟發(fā)，張娟聰?shù)龋?7］嘗試以正丁醇為溶劑，PS濃度2%，β-環(huán)糊精與PS的摩爾比為4∶1，40℃，中等速度攪拌下將β-環(huán)糊精與PS包合12 h，PS的包合率可達(dá)90%，且水溶性得到明顯改善。之后呂曉玲［28］和周陽(yáng)［29］還對(duì)羥丙基-β-環(huán)糊精包合效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)包合物相比未經(jīng)包合的PS在水中的溶解度提高了200倍以上，并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)包合產(chǎn)物并不影響原PS的降血脂功效。

4.2 PS油溶性研究

油溶改性主要通過(guò)PS和脂肪酸酯化或者與脂肪酸甲酯酯交換合成植物甾醇酯(sterol esters，SE)，若利用長(zhǎng)鏈脂肪酸與PS反應(yīng)還可獲得更高的生物活性，因此該產(chǎn)品可廣泛應(yīng)用在含脂食品中。

酯化合成根據(jù)所用催化劑分為化學(xué)法和酶法。早期人們采用甲醇鈉催化化學(xué)法合成SE，但容易生成一些副產(chǎn)物(如氧化甾醇和脫水甾醇)，且得到的SE純度不高。因此Meng等［30］研究硅鎢酸作為酯化反應(yīng)催化劑，以獲得高產(chǎn)量高純度的SE，該研究證實(shí)硅鎢酸經(jīng)過(guò)六次連續(xù)使用后，仍然有比較強(qiáng)的催化能力，基本符合工業(yè)化生產(chǎn)要求。Valange等［31］發(fā)現(xiàn)，La2O3表面碳酸鹽堿性越小，SE酯化率越高，同時(shí)還能有效抑制β-谷甾醇側(cè)鏈的脫水反應(yīng)。酶法合成反應(yīng)條件溫和、專一性強(qiáng)、副反應(yīng)較少、產(chǎn)物質(zhì)量好并易于純化分離，所以近幾年人們?cè)诿阜ê铣缮线M(jìn)行了大量研究。Zheng等［32］利用假絲酵母固定化脂肪酶合成亞麻酸甾醇酯，該固定化酶不僅對(duì)反應(yīng)pH和溫度有較強(qiáng)抗性，而且在55℃、醇酸摩爾比1.5∶1、反應(yīng)6 h條件下，酯化率高達(dá)95.3% 。Hellner等［33］在無(wú)溶劑體系下以PS、辛酸和葵花油為原料酶法一步合成結(jié)構(gòu)脂質(zhì)和SE，酯化率和甘油三酯轉(zhuǎn)化分別為92.1%和44.1%。季國(guó)志等［34］將SE與α-亞麻酸復(fù)配并成功應(yīng)用于乳制品?？梢姡S著研究的深入，人們?cè)赟E合成反應(yīng)上必定向營(yíng)養(yǎng)功能最大化方向發(fā)展。

5 PS氧化物(POPs)

天然PS在光、熱、O2或酶等作用下，會(huì)發(fā)生自身氧化或者酶促氧化形成POPs。POPs種類繁多，主要分為主環(huán)氧化物和側(cè)鏈氧化物。自身氧化一般生成包含羥基(—OH)、酮基 keto-(=O)、環(huán)氧基(epoxy-)和三羥基(triol-)等結(jié)構(gòu)的主環(huán)氧化物，而活體內(nèi)的酶促氧化則生成側(cè)鏈氧化物，大都包含20 OH—、25 OH—、26 OH—、29 OH—等結(jié)構(gòu)(如圖4所示)。PS氧化速度和氧化產(chǎn)物因氧化條件不同而各異，如Rudzińska等［35］將含有 PS的黃油分別在 4℃和 20℃ 儲(chǔ)藏18周，儲(chǔ)藏結(jié)束時(shí)發(fā)現(xiàn)20℃下PS總量下降了30%，7-OH氧化物含量卻上升了3倍，epoxy-氧化物在第 6周達(dá)到最大值，隨后又不斷下降。關(guān)于POPs的分析，一般采用 GC-MS。Menéndez-Carre?o等［36］則認(rèn)為 GC×GC分離技術(shù)有助于更好地對(duì)POPs進(jìn)行選擇性分析，研究還證實(shí)了最易生成的POPs主要是7-OH、7-keto和5，6-epoxy氧化物。

圖4 POPs的一般形成過(guò)程和結(jié)構(gòu)Fig.4 General forming process and structure of POPs

6 安全性

盡管FDA和歐盟都已批準(zhǔn)PS可用于降膽固醇食品中，但是天然PS或由于加工不當(dāng)產(chǎn)生的POPs在人體內(nèi)的實(shí)際生理活性研究和安全性仍然是目前的研究熱點(diǎn)。

6.1 天然PS和SE

一般認(rèn)為，天然PS是安全性較高的新型功能食品添加劑。但Katan等［37］發(fā)現(xiàn)，PS的攝入會(huì)降低血液中脂溶性維生素的水平，可能是由于前者可減少血液中的脂溶性維生素載體-脂蛋白的含量所致，但這可以通過(guò)攝入富含對(duì)應(yīng)營(yíng)養(yǎng)成分的食物加以補(bǔ)充。

植物固醇血癥(又稱谷固醇血癥)是由于ABCG5和ABCG8(調(diào)控腸道內(nèi)PS吸收的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)的突變使PS在膽汁中代謝出現(xiàn)障礙而導(dǎo)致血液中PS水平過(guò)高的一種罕見的遺傳性脂質(zhì)代謝疾病，患有該代謝疾病的個(gè)體過(guò)多攝入PS有可能得黃瘤和早發(fā)性冠心?。?8］，至于 PS對(duì)兒童和孕婦的影響還有待考究［39］。總的來(lái)說(shuō)，天然PS具有較高的食用安全性。

6.2 POPs

因?yàn)镻OPs與膽固醇氧化產(chǎn)物(cholesterol oxidation products，COPs)在結(jié)構(gòu)上類似，所以POPs的安全性問(wèn)題也備受關(guān)注。到目前為止，POPs的生理活性和安全性研究包括:

6.2.1 降膽固醇功效

最新研究證明，膳食中摻入一定量豆甾醇氧化物會(huì)阻礙低密度脂蛋白受體(LDLR:跟血液中低密度膽固醇的去除有關(guān))和HMG-CoA還原酶(膽固醇合成速率限制酶)的表達(dá)［10］，而且豆甾醇氧化物無(wú)法激活LXRα(LXRα 是減少膽固醇吸收的靶向受體)［40］，因此大多POPs不再具備降膽固醇功效。

6.2.2 動(dòng)脈粥樣硬化和炎癥反應(yīng)

COPs目前已被證實(shí)可促使動(dòng)脈粥樣硬化，引起炎癥反應(yīng)，所以人們就POPs展開了類似的毒性試驗(yàn)。Yang等［41］發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇氧化混合物可減緩血管舒張，從而損傷主動(dòng)脈的功能性，這可能會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化。Vejux等［42］則證實(shí)了7-keto-谷甾醇可減少單核白細(xì)胞(U937細(xì)胞)中白介素-8的分泌，當(dāng)7-keto-谷甾醇濃度為60 μM時(shí)，還可促進(jìn)人體結(jié)腸癌細(xì)胞(Caco-2)中促炎性細(xì)胞因子、腫瘤壞死因子TNF-α和白介素-8的分泌，而TNF-α的增加直接影響腸上皮細(xì)胞的完整性?？梢娔承㏄OPs也可促使動(dòng)脈粥樣硬化，引起炎癥反應(yīng)，甚至致癌。

6.2.3 性激素分泌

不同POPs對(duì)雌性激素影響不同。混合POPs作用于乳腺癌細(xì)胞MCF-7刺激雌激素產(chǎn)生，而單純的7β-OH-豆甾醇氧化物作用則出現(xiàn)了抗雌激素反應(yīng)［43］，van den Heuvel等［44］卻發(fā)現(xiàn)，谷甾醇氧化物和豆甾醇氧化物的混合物僅影響雄性激素分泌而對(duì)雌性激素沒有影響，所以POPs對(duì)于性激素的影響可能要對(duì)不同種類的氧化物分別研究才能定論。

6.2.4 細(xì)胞毒性

POPs的細(xì)胞毒性是目前研究和報(bào)道較多的。Adcox等［45］首先提出高濃度下POPs具有細(xì)胞毒性，甚至引起細(xì)胞凋亡，高俊蘭［46］也對(duì)POPs的細(xì)胞毒性進(jìn)行了初探，發(fā)現(xiàn)其與COPs有類似的毒性，但毒性遠(yuǎn)低于 COPs。具體研究［47-49］表明，β-谷甾醇氧化物細(xì)胞凋亡的水平最高，在U937細(xì)胞中，同等濃度下triol-衍生物細(xì)胞毒性最大，但7β-OH衍生物和7-keto衍生物的細(xì)胞凋亡水平最高，且VC的添加可減少它們的細(xì)胞毒性，更有新型豆甾醇衍生物5，6，22，23-二環(huán)氧基豆甾烷和5，6-環(huán)氧基豆甾烷-22S，23S-二醇表現(xiàn)出了低濃度(30 μmol/L)高凋亡毒性［50］，但 POPs的這點(diǎn)對(duì)于化學(xué)療法選擇性致死癌癥細(xì)胞具有一定的研究?jī)r(jià)值。

Ryan等［49］在探究 POPs致使細(xì)胞凋亡的途徑時(shí)，發(fā)現(xiàn)7β-OH-谷甾醇氧化物和所有的豆甾醇氧化物都能降低U937細(xì)胞中谷胱甘肽，從而引起線粒體膜電位損失，最終使細(xì)胞色素c釋放進(jìn)入胞液，活化細(xì)胞凋亡的蛋白酶，但是確切途徑還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

總之，POPs的安全性問(wèn)題尚未完全定論，對(duì)人體健康的具體影響和分析方法以及如何最小化其在食品和人體內(nèi)含量是今后研究的重要方向。

7 結(jié)論

PS作為一種有效的生物活性組分已被廣泛應(yīng)用在食品、醫(yī)藥和化妝品等行業(yè)。目前，利用超臨界萃取或固相萃取等現(xiàn)代提取分離技術(shù)提取植源性基料中的PS是期望的，再通過(guò)高速逆流色譜法分離純化，得到的精制PS再用GC分析。對(duì)于PS溶解性差的問(wèn)題，主要引入了多不飽和脂肪酸進(jìn)行油溶改性，使其營(yíng)養(yǎng)功能最大化。在正常劑量下天然PS對(duì)人體基本無(wú)害，但對(duì)兒童和孕婦的影響還有待研究。至于POPs，它不僅沒有降膽固醇效果，還可能引起動(dòng)脈粥樣硬化和炎癥反應(yīng)，干擾性激素分泌，并具有細(xì)胞毒性，高濃度下甚至引起細(xì)胞凋亡，因此探究各種POPs的生理活性和安全性問(wèn)題將是今后研究的重要方向。

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