張磊，靳魁奇，劉宇鵬

(河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物工程研究所，河南開封，475004)

去氫表雄酮(dehydroepiandrosterone，以下簡稱DHEA)是一種C19類固醇甾體化合物，具有抗炎、增殖及抭抑郁等活性，其衍生物能促進(jìn)動(dòng)物免疫應(yīng)答。此外，它還是合成甾體藥物的重要中間體?，F(xiàn)在DHEA的生產(chǎn)大多采用化學(xué)合成，原料價(jià)格昂貴，反應(yīng)過程復(fù)雜，對環(huán)境危害大。因而，采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)DHEA成為一種理想的生產(chǎn)方法。其主要反應(yīng)流程如圖1所示:先通過化學(xué)反應(yīng)將混合植物甾醇(多為甾醇的混合物，主要成分包括菜籽甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇和豆甾醇)3-位羥基保護(hù)，生成植物甾醇保護(hù)物，再利用微生物發(fā)酵生成去氫表雄酮甲氧基甲基醚，經(jīng)過水解，可得到 DHEA［1］。

圖1 微生物發(fā)酵法生產(chǎn)DHEA反應(yīng)流程圖Fig.1 The reaction scheme for DHEA production by microbial fermentation

文獻(xiàn)報(bào)道的植物甾醇類物質(zhì)的分析方法主要有薄層層析法(TLC)［2］、氣相色譜法［3-4］、紫外可見光分光光度法［5-6］以及高效液相色譜法(HPLC)［7］。其中，TLC只能根據(jù)斑點(diǎn)的大小和顏色的深淺判斷各組分的大致比例，靈敏度和準(zhǔn)確度較低，無法確定它們的精確含量;紫外可見光分光光度法干擾因素多，靈敏度不高;HPLC易受流動(dòng)相成分、比例和樣品處理方法等影響，且有DHEA、植物甾醇、植物甾醇保護(hù)物和去氫表雄酮甲氧基甲基醚的響應(yīng)值較小等缺點(diǎn)。

目前，國內(nèi)還未見氣相色譜同時(shí)檢測DHEA、植物甾醇保護(hù)物和去氫表雄酮甲氧基甲基醚的報(bào)道。本文采用氣相色譜內(nèi)標(biāo)法，試圖建立一種同時(shí)測定DHEA、植物甾醇、植物甾醇保護(hù)物、去氫表雄酮甲氧基甲基醚和發(fā)酵副產(chǎn)物雄甾烯二酮(4-Androstene-3，17-dione，4-AD)的方法。這種方法分離效果較好，簡化了樣品的預(yù)處理步驟，為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)DHEA的優(yōu)化和生產(chǎn)過程的分析與控制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器及色譜條件

1.1.1 儀器

島津GC-2014C氣相色譜儀;FID檢測器、SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用循環(huán)泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司;RF-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;VORTEX KB3漩渦振蕩儀、GL-3250B磁力攪拌器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司;QHZ-98A全溫度振蕩培養(yǎng)箱，太倉市華美生化儀器廠。

1.1.2 色譜條件

色譜柱:DB-1(30 m ×0.53 mm ×0.25 μm)毛細(xì)管柱;載氣:氮?dú)? mL/min;進(jìn)樣口溫度:280℃;檢測器溫度:310 ℃。進(jìn)樣量:2 μL，分流比 20∶1。

1.2 材料及試劑

1.2.1 材料

標(biāo)準(zhǔn)品DHEA，4-AD(Sigma公司);菜籽甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇和豆甾醇的標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司);混合植物甾醇(上海金穗生物科技有限公司，純度95%);標(biāo)準(zhǔn)品植物甾醇保護(hù)物，去氫表雄酮甲氧基甲基醚(實(shí)驗(yàn)室自制);角鯊?fù)?上海金穗生物科技有限公司)。以上標(biāo)準(zhǔn)品均為分析純。

1.2.2 試劑

乙酸乙酯、甲醇、甲縮醛、P2O5、硅藻土，均為分析純。

1.2.3 供試菌株和培養(yǎng)基

分枝桿菌(Mycobacterium sp.NRRLB-8128)。

種子培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 10，酵母膏 10，NaNO35，NaH2PO45，Na2HPO45，甾醇保護(hù)物 10，大豆油160 mL。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液

精確稱取DHEA標(biāo)準(zhǔn)品0.05 g，置于50 mL容量瓶中，用乙酸乙酯溶解并稀釋至刻度，得到質(zhì)量濃度為1.00 g/L的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，精密吸取20、15、10、5 mL標(biāo)準(zhǔn)品貯備液分別置于25 mL容量瓶中，用乙酸乙酯溶解并稀釋至刻度，得到梯度濃度的DHEA標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

同理，配制梯度質(zhì)量濃度(1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 g/L)的去氫表雄酮甲氧基甲基醚和4-AD標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

待測樣品加入50 μL(1 μL/mL)角鯊?fù)樽鳛閮?nèi)標(biāo)物，得到待測樣品。

1.3.2 植物甾醇3位羥基的保護(hù)反應(yīng)

稱取一定量的混合植物甾醇，置于裝有適量硅藻土和甲縮醛溶液的圓底燒瓶內(nèi)，攪拌。待甾醇完全溶解后，加入適量的P2O5，繼續(xù)攪拌。等混合植物甾醇完全轉(zhuǎn)化后，趁熱過濾，濾餅和圓底燒瓶用甲縮醛清洗。減壓濃縮之后，用1%K2CO3清洗，甩濾，水洗，60℃烘干，得到淡黃色固體，即為植物甾醇保護(hù)物。

1.3.3 植物甾醇保護(hù)物發(fā)酵工藝

種子培養(yǎng):31℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)40～48 h。

發(fā)酵培養(yǎng):待種子生長到對數(shù)生長期，按20%接種量接入500 mL發(fā)酵搖瓶，31℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)5 d。

1.3.4 DHEA提取與純化

見文獻(xiàn)［1］。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

植物甾醇、植物甾醇保護(hù)物、去氫表雄酮甲氧基甲基醚、4-AD以及DHEA均系弱極性物質(zhì)，常采用AC-5型色譜柱，SE-54型分析［8-10］。本文采用的是DB-1型(30 m ×0.53 mm ×0.25 μm)毛細(xì)管柱(非極性，高效柱)，DHEA、植物甾醇、植物甾醇保護(hù)物、去氫表雄酮甲氧基甲基醚和4-AD得到有效分離，色譜圖見2。

圖2 甾體化合物標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.2 Gas chromatorgram of the sterol standards

由圖2可知，標(biāo)準(zhǔn)品植物甾醇中各組分(菜籽甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇和豆甾醇)保留時(shí)間分別為12.869、13.011、13.380、14.400 min;植物甾醇保護(hù)物中各組分對應(yīng)(菜籽甾醇保護(hù)物、菜油甾醇保護(hù)物、β-谷甾醇保護(hù)物和豆甾醇保護(hù)物)的保留時(shí)間為15.388、15.657、16.042、17.383 min;DHEA、4-AD、去氫表雄酮甲氧基甲基醚和角鯊?fù)榈谋Ａ魰r(shí)間分別為6.301、6.956、7.171、7.286 min。

2.2 線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)

按照1.3.1中標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備方法配制溶液，取2 μL進(jìn)樣。根據(jù)峰面積(Y)和濃度(X)關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。各組分濃度線性范圍、回歸方程以及相關(guān)系數(shù)結(jié)果見表1。從表1看出，DHEA、去氫表雄酮甲氧基甲基醚和4-AD各組分在其各自線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 DHEA、去氫表雄酮甲氧基甲基醚和4-AD各組分的線性關(guān)系Table 1 Linear correlation of DHEA、3β-methoxymethy L-ether-dehydrepiandrosterone and 4-AD

2.3 回收率實(shí)驗(yàn)

取50 mL空白發(fā)酵液，分別加入標(biāo)樣DHEA、去氫表雄酮甲氧基甲基醚和4-AD為0.500 g，采用與待測樣品相同的預(yù)處理方法，重復(fù)進(jìn)樣5次。結(jié)果見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)樣品的回收率(n=5)%Table 2 Recovery of the standard samples(n=5)%

2.4 分析方法的精密度

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液2.00 μL，分別重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算DHEA、去氫表雄酮甲氧基甲基醚和4-AD的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別0.84%、0.65%、1.22%。

2.5 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取同一個(gè)發(fā)酵液樣品，按1.3.4所述方法對樣品進(jìn)行處理，重復(fù)測定樣品5次，DHEA、去氫表雄酮甲氧基甲基醚和4-AD均含量的RSD分別是2.87%、1.83%、1.72%，說明建立的氣相色譜內(nèi)標(biāo)分析方法重現(xiàn)性良好。

2.6 檢測方法專屬性的評價(jià)

取未加入植物甾醇保護(hù)物的空白發(fā)酵液，同樣操作進(jìn)行測定，色譜圖顯示，基線基本水平，無明顯出峰，可見空白發(fā)酵液中無其他雜質(zhì)干擾，此方法專屬性較好。

2.7 樣品中發(fā)酵產(chǎn)物的測定

取5批不同發(fā)酵液，按1.3.4方法處理。進(jìn)氣相檢測，色譜結(jié)果如圖3所示。

圖3 發(fā)酵液樣品氣相色譜圖Fig.3 Gas chromatogram of the fermentation broth

圖4 發(fā)酵液水解液氣相色譜圖Fig.4 Gas chromatogram of the hydrolysate of fermentation broth

由圖4可以看出，底物植物甾醇保護(hù)物基本上轉(zhuǎn)化完全。然后，按照上述各自對應(yīng)的線性關(guān)系，得出5批發(fā)酵液水解液中DHEA、去氫表雄酮甲氧基甲基醚和4-AD各自含量。定量結(jié)果見表3。

表3 發(fā)酵液水解后樣品的測定結(jié)果Table 3 The determination results of the sample by hydrolysis of fermentation broth

3 結(jié)論

本研究以角鯊?fù)闉閮?nèi)標(biāo)，乙酸乙酯為萃取劑，建立了氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測定分枝桿菌(Mycobacterium sp.NRRLB-8128)發(fā)酵液中DHEA、去氫表雄酮甲氧基甲基醚和4-AD的含量。DHEA在0.2～1.0 g/L范圍內(nèi)R2=0.998;去氫表雄酮甲氧基甲基醚在0.1～0.9 g/L范圍內(nèi)R2=0.992;4-AD在0.2～1.0 g/L范圍內(nèi)R2=0.998，線性關(guān)系良好。平均回收率依次為(97.88±0.74)%，(99.39±1.07)%，(98.91±1.09)%，精密度和準(zhǔn)確度較好，符合分析的要求，能夠滿足檢測工作的要求。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明采用氣相色譜法(GC)測定發(fā)酵液中DHEA、去氫表雄酮甲氧基甲基醚和4-AD的含量，其選擇性好，分離效果高，靈敏度高，分析速度快，大大簡化了實(shí)驗(yàn)操作過程，非常適合于微生物發(fā)酵方法生產(chǎn)DHEA過程中底物及產(chǎn)物的及時(shí)分析與監(jiān)測。

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