宋　佳，張紹鵬，孫　巧，李天佩，曾萬勇，陳　平

(武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023 )

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珍稀藥用植物竹節(jié)參SRAP-PCR反應體系的構建與優(yōu)化

宋佳，張紹鵬，孫巧，李天佩，曾萬勇，陳平

(武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023 )

摘要：人參屬重要的藥用植物竹節(jié)參(Panax japonicus C. A. Mey)野生資源已近瀕危，開展其遺傳多樣性研究對于資源保護和可持續(xù)利用具有重要意義。研究構建并優(yōu)化了竹節(jié)參DNA的SRAP-PCR擴增體系。以竹節(jié)參根莖為材料，對PCR反應體系中的dNTPs、DNA模板、引物、Taq DNA聚合酶濃度和復性第二階段的退火溫度等條件進行探索和研究,得到了能穩(wěn)定擴增竹節(jié)參基因組的最佳反應體系(25μl)：DNA 40ng，dNTPs 0.2 mmol/L，Primer 0.36μmol/L，10×PCR Buffer 2.5 ul，Taq DNA polymerase 2U，退火溫度50℃。進一步檢測了隨機組合的24對引物，進行擴增，得到了2對帶型清楚、重復性較好的引物Me1/Em5和Me3/Em1。以這2對引物對10個不同產地竹節(jié)參DNA樣品進行SRAP-PCR擴增。產物的電泳圖譜表明，竹節(jié)參不同產地的DNA譜帶多態(tài)性豐富，帶型清晰，重復性好。說明建立的該SRAP-PCR反應體系穩(wěn)定可靠，為利用SRAP分子標記技術研究竹節(jié)參的植物遺傳多樣性奠定了工作基礎。

關鍵詞：竹節(jié)參；SRAP-PCR反應體系；構建；優(yōu)化

1引言

近年來，AFLP、RAPD、ISSR等分子標記技術逐漸應用到藥用植物的研究領域，已成為目前中藥資源系統(tǒng)研究的重要手段和方法，在人參屬植物如三七[1]、人參[2-3]、西洋參[4- 5]的遺傳多樣性研究方面目前已經取得了重要的研究進展。由Li和Quiros[6]開發(fā)的一種新型分子標記技術——標記序列相關擴增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism, SRAP) 因其具有簡單、高效、多態(tài)性豐富、重復性好、高共顯性、易測序且不需預知物種基因序列信息等優(yōu)點，已逐步被國內外學者應用于蘋果[7]、馬鈴薯[8]、油菜[9]等果蔬的遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建[10]、種質資源鑒定評價[11]，重要性狀基因標記[12]等研究。該標記根據基因啟動子、內含子中AT含量豐富及外顯子中GC含量豐富的特點設計引物，對基因開放讀碼框(ORFs)進行PCR擴增, 因不同個體間啟動子、內含子與間隔區(qū)的長度不同而產生多態(tài)性，被認為是研究群體遺傳變異最好的標記之一[13]，目前SRAP標記在竹節(jié)參的研究中尚未見有相關報道。構建竹節(jié)參基因組DNA的SRAP-PCR的優(yōu)化反應體系，為竹節(jié)參遺傳圖譜的構建、遺傳多樣性分析研究奠定基礎。

竹節(jié)參(PanaxjaponicasC.A.Mey)為五加科人參屬多年生草本植物，以干燥根莖入藥[14]。其又稱竹節(jié)人參、竹根七、竹節(jié)三七、白三七、大葉三七、北三七，主產于湖北、四川、云南、貴州等地，有止血生肌、散瘀止痛、舒筋活絡、滋補強壯等功效[15]。它兼具我國北藥人參和南藥三七的功用，被民間譽為“草藥之王”，為我國珍稀中藥材資源[16]。野生竹節(jié)參資源目前已處于瀕危狀態(tài)，經過多年的研究，在竹節(jié)參的植物分類[17]、化學成分研究[18-20]、臨床應用研究等方面取得了一定的進展[21-23]。在其藥用植物的生長發(fā)育、遺傳多樣性評估、品種鑒定及植物系統(tǒng)分類等方面的研究目前尚處于起步階段，本課題組在前期竹節(jié)參轉錄組測序研究的基礎上，利用單因素分析法[24]首次構建并優(yōu)化了竹節(jié)參SRAP-PCR反應體系。以竹節(jié)參(PanaxjaponicusC. A. Mey)為材料，對PCR反應體系中的dNTPs、DNA模板、引物、Taq DNA聚合酶濃度和復性第二階段的退火溫度等條件進行梯度實驗，構建并優(yōu)化了竹節(jié)參SRAP-PCR反應體系，為進一步開展竹節(jié)參的遺傳多樣性、種質資源研究和遺傳連鎖圖構建等系統(tǒng)研究提供技術基礎。

2材料與方法

2.1　材料

供試材料為竹節(jié)參(PanaxjaponicasC.A.Mey)的根莖，不同產地竹節(jié)參的材料見表1。

表1竹節(jié)參樣品

編號產地編號產地1湖北恩施華中藥用植物園6云南麗江2湖北宣恩7貴州玉舍3湖南八大山公8四川洪雅高廟4廣西融水9貴州雷公山5湖北七姊妹山10四川龍池

2.2　主要試劑

Taq DNA聚合酶、dNTP Mixture、10×PCR Buffer、DL10000 DNA Marker(武漢生物工程技術服務有限公司)，SRAP標記引物來自Li和Quiros[6](所選引物序列見表2，由上海桑尼生物科技有限公司合成，稀釋10umol/L備用),瓊脂糖(Biosharp),CTAB(Amresco)，無水乙醇、氯仿(國藥集團化學試劑有限公司)等。

表2SRAP引物序列

引物正向引物序列(5’-3’)引物反向引物序列(5’-3’)Me1TGAGTCCAAACCGGATAEm1GACTGCGTACGAATTAATMe2TGAGTCCAAACCGGAGCEm2GACTGCGTACGAATTTGCMe3TGAGTCCAAACCGGATTEm3GACTGCGTACGAATTGACMe4TGAGTCCAAACCGGAGCEm4GACTGCGTACGAATTAATMe5TGAGTCCAAACCGGTCCEm5GACTGCGTACGAATTCAAMe6TGAGTCCAAACCGGACCEm6GACTGCGTACGAATTGCAMe7TGAGTCCAAACCGGAAGEm7GACTGCGTACGAATTCTGMe8TGAGTCCAAACCGGTAAEm8GACTGCGTACGAATTCGAMe9TGAGTCCAAACCGGTGCEm9GACTGCGTACGAATTCAGMe10TGAGTCCAAACCGGTCAEm10GACTGCGTACGAATTCCA

2.3　竹節(jié)參基因組 DNA的提取與檢測

切取一小塊(0.2 g)竹節(jié)參樣品的最嫩部位，采用改良的CTAB法[25]提取各樣品基因組DNA。用液氮將樣品研磨至粉末，放入到加有CTAB提取緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0, 1.4 mol/L NaCl, 20 mmol/L EDTA pH 8.0, 2% CTAB, 1%PVP K-40, 1%β-巰基乙醇)中，65℃水浴1h，每10min輕輕搖晃一次，加入氯仿400ul，混勻后靜置2-3min，15℃，12 000r/min離心10min，輕輕吸取上清液400ul，加入等體積的異戊醇:氯仿(1:24),4℃, 12 000r/min離心10min，輕輕吸取上清液450ul，加入2.5倍體積的無水乙醇，4℃, 12 000r/min離心20min，棄上清，得到DNA沉淀物。經室溫干燥后，加入30ul ddH2O充分溶解。利用紫外分光光度計(PE Lambda25)和1%的瓊脂糖凝膠檢測其濃度和質量。

2.4　SRAP-PCR反應體系優(yōu)化

基礎擴增反應體系(25 μl)：模板l μl (50 ng/μl)，10×Buffer 2.5 μl，dNTP Mixture (10 mmol/L) 0.3 μl，正反引物各5 μl (1.5 μmol/L), Taq酶0.4 μl (5 U/μl)，剩余用ddH2O 補足。采用單因素分析法，設定dNTPs、DNA模板、引物、Taq DNA聚合酶濃度和復性第二階段的退火溫度5個參數(shù)。在反應體系中其他成分不變的情況下，將每個參數(shù)設置5個梯度(表3)。

2.5　SRAP-PCR擴增體系

SRAP-PCR反應采用復性變溫法，擴增反應程序如下：預變性94 ℃5 min；前5個循環(huán)變性94 ℃1 min，退火35 ℃ 1 min，延伸72℃ 1.5 min；后35個循環(huán)變性94℃ 1 min，退火50 ℃[6],1 min，延伸72 ℃ 1.5 min；最后延伸72 ℃ 5 min。

2.6　SRAP-PCR引物的篩選

以1號竹節(jié)參DNA為模板，進行SRAP-PCR反應引物的篩選。正反引物各10個，隨機組合挑選24對，進行PCR擴增，產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(表3)。

表3竹節(jié)參SRAP-PCR反應體系參數(shù)

水平參數(shù)Taq酶/UdNTP/mmol·L-1引物/umol·L-1模板/ng退火溫度/℃11.00.10.1254622.00.20.24104833.00.40.36205044.00.60.48405255.00.80.608054

3結果與分析

3.1　引物篩選結果

將正向引物和反向引物隨機組合成引物對，采用SRAP-PCR初始反應程序進行引物篩選，擴增結果見圖1。實驗結果表明4號(Me1/Em3)，7號(Me1/Em5)，12號(Me3/Em1)，13號(Me8/Em1)，20號(Me7/Em8)，23號(Me7/Em10)這6對引物能擴增出清楚、重復性較好的帶型。經過多次重復試驗后，最終確定選用Me1/Em5作為固定引物進行各因素優(yōu)化實驗。

圖1　24對引物SRAP-PCR擴增結果

3.2　SRAP-PCR優(yōu)化結果

3.2.1dNTPs濃度對SRAP-PCR擴增的影響

dNTPs是合成DNA鏈的原料，其濃度是影響PCR反應的決定性因素之一。圖2中結果表明，當dNTPs濃度為0.1—0.8 mmol/L時，都能擴增出條帶，但濃度為0.8 mmol/L時，擴增產物的譜帶較弱；濃度為在0.6 mmol/L時，擴增產物譜帶不太穩(wěn)定。故dNTPs濃度在0.1—0.4 mmol/L時效果最好。

圖2　不同dNTPs濃度SRAP-PCR擴增結果

圖3　不同引物濃度SRAP-PCR擴增結果

3.2.2引物濃度對SRAP-PCR擴增的影響

引物濃度過高會導致非特異性擴增和引物二聚體的形成，過低則PCR產量受到影響。由圖3可知，當引物濃度為0.12 umol/L時，擴增產物電泳條帶不清晰；隨著引物濃度的增加，擴增條帶逐漸清晰，在0.24—0.60 umol/L時，譜帶清晰且穩(wěn)定，確定竹節(jié)參SRAP擴增最優(yōu)引物濃度為0.36umol/L。

3.2.3DNA模板量對SRAP-PCR擴增的影響

高質量的模板也是PCR擴增的關鍵因素。由圖4可知，當模板DNA用量為5或10 ng時，擴增的譜帶較暗；而為20或40 ng時，擴增的譜帶主帶最清晰；當模板DNA用量為20—80 ng時，條帶穩(wěn)定且亮度基本保持不變，說明SRAP對竹節(jié)參模板DNA濃度適應范圍比較廣，本試驗確定竹節(jié)參SRAP擴增模板DNA濃度為40 ng。

圖4　不同DNA模板濃度SRAP-PCR擴增結果

3.2.4Taq酶對SRAP-PCR擴增的影響

Taq酶的用量對PCR擴增效率有著顯著影響。若濃度過低，擴增產物量降低；濃度過高，非特異性擴增幾率增大。由圖5可知，Taq DNA聚合酶為1.0 U時，擴增的條帶較少；用量為3.0—5.0 U時，條帶清楚但易產生非特異性條帶；綜合考慮，本試驗確定竹節(jié)參SRAP擴增的Taq DNA聚合酶適宜用量為2.0 U。

圖5　不同Taq酶濃度SRAP-PCR擴增結果

3.2.5退火溫度對SRAP-PCR擴增的影響

退火溫度對PCR擴增結果有著至關重要的影響。退火溫度過低，會導致反應結果中出現(xiàn)大量非特異性結合條帶；退火溫度過高，雖然特異性會好一些，但是擴增效率會降低，所以對退火溫度的篩選是很有必要的。如圖6所示，本實驗確定當退火溫度為50℃時較為適宜，產物有較清晰條帶。

圖6　不同退火溫度SRAP-PCR擴增結果

3.3　竹節(jié)參SRAP-PCR反應體系的確立和穩(wěn)定性檢測

考慮到試驗結果的穩(wěn)定性和降低試驗成本等因素，我們最終確定竹節(jié)參SRAP標記最優(yōu)擴增反應體系(25 μl)：DNA模板1 μl (40 ng/μl)，10×Buffer 2.5 μl，dNTP Mixture 0.4 μl (10 mmol/L)，引物6 μl (1.5 μmol/L)，Taq酶0.4 μl (5 U/μl)，退火溫度50℃，剩余用ddH2O補足。

利用上述最優(yōu)擴增反應體系，選取引物組合Me1/Em5和Me3/EmL對10個不同產地竹節(jié)參樣品進行擴增，以檢測該SRAP-PCR反應體系的穩(wěn)定性。結果顯示，所選引物可在10個不同產地竹節(jié)參樣品上擴增出清晰穩(wěn)定、重復性好的條帶(圖7和圖8)。

圖7　引物Me1/Em5對10個不同產地竹節(jié)參樣品SRAP-PCR擴增結果

圖8　引物Me3/Em1對10個不同產地竹節(jié)參樣品SRAP-PCR擴增結果

4討論

SRAP分子標記是在總結現(xiàn)有分子標記優(yōu)缺點基礎上開發(fā)出的一種新型的DNA分子標記技術，其擴增條帶比RAPD、ISSR 分子標記更穩(wěn)定，適用于不同植物的各種研究，目前已在數(shù)十種植物中應用，但在藥用植物的生長發(fā)育、遺傳多樣性評估、品種鑒定及植物系統(tǒng)分類等方面的研究尚處于起步階段，本研究首次構建并優(yōu)化了竹節(jié)參的SRAP-PCR反應體系。但是受反應條件及物種差異的影響，不同物種間SRAP最佳反應體系差別很大。因此，應用SRAP標記之前，應該對反應條件進行優(yōu)化，從而保證反應體系的重復性和穩(wěn)定性。

目前國內外尚未見有關竹節(jié)參SRAP-PCR反應體系構建的相關研究。在竹節(jié)參植物遺傳多樣性的研究方面，我們構建了針對竹節(jié)參基因組DNA的SRAP-PCR反應體系，對dNTPs、DNA模板、引物、Taq DNA聚合酶濃度和復性第二階段的退火溫度等條件進行探索和研究。結果發(fā)現(xiàn)，這5個參數(shù)對SRAP-PCR擴增結果有不同程度的影響，其中模板濃度對擴增結果影響較小，這與對枸杞[26]、香蕉[27]、馬鈴薯[8]的研究結果相一致；相比較而言，dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶濃度和復性溫度對擴增結果影響比較大，這與辣椒[28]在這方面研究結果相一致。所構建優(yōu)化并最終確定了竹節(jié)參SRAP-PCR擴增的最佳反應體系(25μl)：DNA 40ng，dNTPs 0.2 mmol/L，Primer 0.36μmol/L，10×PCR Buffer 2.5 ul，Taq DNA polymerase 2U，退火溫度50 ℃，這為SRAP分子標記在竹節(jié)參遺傳多樣性的研究中提供了一定的技術支持。

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Optimization by SRAP-PCR reaction system in rare medicinal herbPanaxjaponicusC. A. Mey

SONGJia，ZHANGShao-Peng，SUNQiao，LITian-Pei，ZENGWan-Yong，CHENPing

(School of Biology and Pharmaceutical Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023，China)

Abstract：Panax japonicus C. A. Mey, an important medicinal herb, its wild resources are becoming endangered. Genetic diversity research of P. japonicas is significant for the conservation and sustainable utilization of these resources. In this study, optimum SRAP-PCR reaction system for P. japonicus DNA was constructed for the first time. The DNA of rhizome in P. japoncius was abstracted as PCR template. And, the concentration gradient of dNTPs, primer, DNA and Taq polymerase and Tmwere assessed respectively to optimize SRAP-PCR reaction system.An optimal and stable SRAP-PCR system for P. japonicus(Total of 25 μl) was as follows: DNA 40 ng, dNTPs 0.2 mmol/L, primer 0.36 umol/L, 10×PCR Buffer 2.5 μl, Taq polymerase 2U, Tm 50.Then, 24 random primers were chosen for further test. 2 couple of primers, Me1/Em5 and Me3/Em1, which can get clear and repeatable bands, were obtained after PCR. Finally, 10 different P. japonicus DNA samples were used to test this method using these 2 primers, which showed that rich polymorphism among P. japoncius plants from different area. Thus, this stable and suitable SRAP-PCR system can be used as an important method of molecular markers analysis for Panax plants genetic diversity studying.

Key words：Panax japonicus; SRAP -PCR ; construction;optimization

DOI:10.3969/j.issn.2095-7386.2015.02.005

文章編號：2095-7386(2015)02-0020-05

基金項目:湖北省教育廳科學技術研究計劃青年人才項目(Q20151706).

通信作者：易陽(1986-),男,講師,E-mail:yiy86@qq.com.

作者簡介：孫杰(1986-)，男，碩士研究生,E-mail:15263238341@163.com.

收稿日期：2015-01-07.

中圖分類號：Q 949.95；TQ 460.6

文獻標識碼：A