李海燕，郭瑩，李夏媛，李枝林

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)花卉研究所，云南昆明 650201)

目前，蘭花的育種仍是以雜交育種為主，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，多倍體育種具有其他育種方式不可代替的優(yōu)勢(shì)。將蘭花遠(yuǎn)緣雜交育種與多倍體育種相結(jié)合，不僅可以克服遠(yuǎn)緣雜交不親和性，而且可以育成觀賞性狀更好的蘭花新品種。蘭花是蘭科植物(Orchidaceae)的總稱，我國(guó)習(xí)慣上將蘭花分為國(guó)蘭和洋蘭［1］。國(guó)蘭主要指人們常說(shuō)的春蘭、蕙蘭、建蘭、寒蘭、墨蘭這5大類，因其株型秀麗、葉姿態(tài)飄逸、花色素雅、花香清幽而深受國(guó)人的喜愛(ài);洋蘭大多數(shù)是指那些花序大、花瓣平整寬大，花型豐滿圓潤(rùn)、花色鮮艷的種類，如蝴蝶蘭、石斛、兜蘭、卡特蘭、大花蕙蘭等。國(guó)蘭和洋蘭各自具有良好的觀賞性狀，如何通過(guò)雜交育種方法，選擇、選配父母本培育出受市場(chǎng)青睞的具有更多優(yōu)良性狀的蘭花新品種，是國(guó)內(nèi)外蘭花育種工作者為之不懈奮斗的目標(biāo)。筆者對(duì)用多倍體育種克服遠(yuǎn)緣雜交不親和性，結(jié)合組織培養(yǎng)方法獲得性狀優(yōu)良的蘭花新品種的方法進(jìn)行闡述，以期為今后蘭花雜交育種提供依據(jù)。

1 蘭花遠(yuǎn)緣雜交育種的歷史

我國(guó)栽培蘭花的歷史已有2 000多年，但是雜交育種工作開(kāi)展卻很少。在自然狀態(tài)下蘭花雜交僅限于屬內(nèi)，主要有以下原因:①許多蘭花以特定的昆蟲(chóng)為其傳粉;②不同種類蘭花花期不同;③由于地理分布的阻礙及雜交不親和性。在蘭花遠(yuǎn)緣雜交工作中，若能解決遠(yuǎn)緣雜交不親和性，那么通過(guò)人工授粉來(lái)進(jìn)行蘭花雜交育種則可使雜交后代出現(xiàn)的可能性大大增加。我國(guó)蘭屬植物的雜交育種起始較晚，在國(guó)際上登錄的雜交種寥寥無(wú)幾［2］?？赡苁軅鹘y(tǒng)文化的影響，要遵從萬(wàn)物自然生長(zhǎng)的規(guī)律，不能人為干擾，所以長(zhǎng)期以來(lái)幾乎一直沒(méi)有人用人工雜交育種來(lái)生產(chǎn)新的雜交品種。1992年，美國(guó)植物生理學(xué)家發(fā)現(xiàn)糖類能代替真菌提供蘭花種子萌發(fā)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在無(wú)菌條件下將蘭花種子播種于含糖的培養(yǎng)基上就能正常萌發(fā)［3］。此后，蘭花品種間、種間及屬間的雜交育種得以開(kāi)展。

2 蘭花遠(yuǎn)緣雜交育種和多倍體育種取得的成就

據(jù)《國(guó)際散氏蘭花種雜種登記目錄》(Sarder’s List of Orchid Hybrids)記載，人工雜種約在4萬(wàn)種以上，而且還以每年1 000種以上的速度增加，僅遠(yuǎn)緣雜交就育成由7個(gè)屬雜交產(chǎn)生的集體雜種［4］。張志勝等從1996年開(kāi)始進(jìn)行蘭花遠(yuǎn)緣雜交的試驗(yàn)研究來(lái)改良墨蘭的性狀，蘭屬內(nèi)雜交組合有下山墨蘭 ×大花蕙蘭(Cymbidium grandiflorium Ldl．)、寒蘭 × 建蘭、墨蘭×建蘭、企劍白墨×春蘭;屬間雜交組合有墨蘭×文心蘭(Oncidium flexuosum L．)和墨蘭 × 蝴蝶蘭［5］。曾宋軍等用仙殿墨蘭自交及其與象白牙或西藏虎頭蘭雜交，育成2個(gè)新品種，其花色美觀，在生長(zhǎng)勢(shì)和抗逆性等方面均優(yōu)于親本，現(xiàn)已進(jìn)行大規(guī)模推廣［6］。麥奮用我國(guó)傳統(tǒng)春蘭品種‘翠蓋’與垂花型雜交蕙蘭成功培育出具有雙親半數(shù)特征的新品種［7］。李方等通過(guò)蕙蘭×臺(tái)蘭種間雜交獲得中間型開(kāi)花的植株［8］。朱根發(fā)等曾報(bào)道獲得了建蘭×蓮瓣蘭(C．a(chǎn)loifolium)雜交后代［9］。李枝林等選擇蘭屬、蝴蝶蘭屬、貝母蘭屬、鶴頂蘭屬、壇花蘭屬、兜蘭屬、槽舌蘭屬作為屬間雜交親本;以蘭屬的6個(gè)種碧玉蘭、沉香虎頭蘭黃素、蓮瓣蘭和大雪蘭作為種間雜交親本，獲得了一批雜交種子［10］。同時(shí)，對(duì)大花蕙蘭×虎雪蘭和春綠蘭×虎雪蘭的F1代進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)，獲得了異源多倍體植株。

深受人們喜愛(ài)的紅花系大花蕙蘭均為雜交種，染色體倍性呈多樣性，有二倍體、三倍體、四倍體、甚至六倍體，以它們作為親本與其他蘭花進(jìn)行雜交，育成了多種在國(guó)際上獲得獎(jiǎng)項(xiàng)的新品種。近年來(lái)，美國(guó)、日本和新西蘭等國(guó)的育種者將大花蕙蘭與建蘭、紋瓣蘭等雜交，培育出了一些早花(秋冬開(kāi)花)、微香、短葉型或垂花型大花蕙蘭品種，很受市場(chǎng)歡迎［11］。

3 蘭花遠(yuǎn)緣雜交與多倍體育種方法

3．1 蘭花雜交育種方法

3．1．1 建立蘭花種質(zhì)資源圃。我國(guó)野生蘭花資源極其豐富，約有173屬1 200多種蘭花原生種。建立蘭花種質(zhì)資源圃，首先要對(duì)野生蘭花的生境及種類進(jìn)行調(diào)查，模擬蘭花生境自然條件，盡可能搜集不同的蘭花原生種進(jìn)行試驗(yàn)種植，觀察并記錄它們的各個(gè)性狀(如株高、葉型、花色、花香、花朵數(shù)量等)以及抗逆性、適應(yīng)性、生育期、性狀遺傳規(guī)律、對(duì)環(huán)境條件的要求等，確定蘭花雜交親本組合親本的選擇。

3．1．2 親本選擇。良好的觀賞性是進(jìn)行蘭花雜交育種的首要目標(biāo)，其次是提高抗性。人們趨向于培育出花大色艷、有香味的新品種。可以結(jié)合國(guó)蘭和洋蘭各自的優(yōu)點(diǎn)來(lái)進(jìn)行親本的選擇，如國(guó)蘭中的墨蘭葉型漂亮、葉幅寬有光澤，但香味不足;蕙蘭香氣濃、抗逆性強(qiáng)，但開(kāi)花時(shí)間晚且不易開(kāi)花;建蘭最易上花，香氣也足，但開(kāi)花時(shí)間短，集中在夏秋兩季。大多數(shù)的洋蘭品種雖花大、色艷，1個(gè)花序上著花較多，但無(wú)香味。在進(jìn)行父母本選擇時(shí)，針對(duì)已有的原種優(yōu)缺點(diǎn)擬定合適的組合進(jìn)行雜交。

3．2 多倍體誘導(dǎo)方法 人工誘導(dǎo)多倍體的途徑主要有物理方法、化學(xué)方法和2n配子法。①物理方法主要是用溫度驟變、機(jī)械創(chuàng)傷、電離射線和非電離射線處理等方法進(jìn)行染色體加倍［12］。早期誘導(dǎo)多倍體大多采用摘心和高低溫處理授粉后的幼胚等機(jī)械方法［13］。經(jīng)過(guò)高溫處理可以誘導(dǎo)楊樹(shù)的二倍體花粉［14］，但總的來(lái)看溫度驟變和機(jī)械創(chuàng)傷是染色體加倍的頻率很低，而射線在使染色體加倍的同時(shí)又會(huì)引起基因突變，因此運(yùn)用物理方法多不理想。②化學(xué)方法是利用一些化學(xué)誘變劑，如秋水仙素、萘嵌戊烷和富民農(nóng)等。在蘭花多倍體誘導(dǎo)過(guò)程中大多是用秋水仙素，一般濃度在0．01% ～1．00%，以0．20%最為常用。通常是誘導(dǎo)的方法有浸漬法、涂抹法、滴液法、套罩法、毛細(xì)管法和復(fù)合處理等方法。蘭花多倍體的誘導(dǎo)大多采用浸漬法和混培法，將蘭花的原球莖、叢生芽或幼苗浸泡在不同濃度的秋水仙素溶液中，然后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，或者將誘導(dǎo)材料接入含有不同濃度的秋水仙素溶液里培養(yǎng)。在用秋水仙素進(jìn)行處理時(shí)，必須要注意藥劑濃度、處理時(shí)間、細(xì)胞分裂時(shí)期和植物生長(zhǎng)狀況。孟英用濃度3%的秋水仙素處理大花蕙蘭×虎雪蘭的原球莖72 h，多倍體誘導(dǎo)率達(dá)30%。由于秋水仙素是一種較強(qiáng)的神經(jīng)性毒劑，對(duì)人、畜危害極大。近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)一些除草劑(如Oryzalin、Sufflan、Trifulan等)，這些藥劑是一類安全、高效的植物染色體加倍劑，因?yàn)檫@些藥劑對(duì)植物的微管蛋白的親和性高，同時(shí)對(duì)動(dòng)物蛋白的親和性低［15］。其中，Oryzalin能阻止正在分裂中的細(xì)胞紡錘絲形成，在藥效消失后細(xì)胞又恢復(fù)常態(tài)，重新分裂而形成多倍體，對(duì)植株的危害小，但目前在國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)到使用Oryzalin誘導(dǎo)蘭花多倍體的報(bào)道。③利用2n配子法獲得多倍體。用秋水仙素等化學(xué)誘變劑誘導(dǎo)的多倍體只能將原有類型染色體數(shù)增加1倍，誘變后都是偶數(shù)倍的多倍體。通過(guò)有性雜交，親本形成配子之前染色體數(shù)目不減半，而是形成2n配子，與正常配子受精可以產(chǎn)生同源多倍體，繼而產(chǎn)生一系列非整倍體。Watanabe用抗病馬鈴薯2n配子與易感病的四倍體雜交，并獲得了抗病的四倍體后代。同時(shí)，通過(guò)2n配子和正常二倍體雜交可以直接得到三倍體，而不需要四倍體親本。在自然界多倍體形成的主要途徑是利用2n配子，而目前在人工多倍體誘導(dǎo)中很少采用，現(xiàn)已較為深入地研究和應(yīng)用2n雄配子，而2n雌配子相對(duì)較少。可以效仿天然多倍體的形成途徑，利用2n配子進(jìn)行生物多倍體育種，2n配子的雜合性和二倍性，使其在生物多倍體育種上極具意義，對(duì)2n配子產(chǎn)生條件和遺傳控制機(jī)制進(jìn)行深入研究，選擇高產(chǎn)2n配子的生物個(gè)體應(yīng)用到育種中，必將推動(dòng)多倍體育種工作的發(fā)展［16］。

遠(yuǎn)緣雜交是獲得新種的重要因素，利用遠(yuǎn)緣雜交方式可以將更多雙親的優(yōu)良性狀集中在雜交后代，獲得的雜種后代通常具有雜種優(yōu)勢(shì)。但是，由于2個(gè)親本的形態(tài)特征、遺傳組成和細(xì)胞結(jié)構(gòu)等方面不同常常導(dǎo)致雜種F1代細(xì)胞在減數(shù)分裂時(shí)不能進(jìn)行正常聯(lián)會(huì)而不育。通過(guò)對(duì)親本之一進(jìn)行染色體加倍成同源多倍體或者對(duì)雜交雙親同時(shí)加倍，來(lái)克服雜交不孕性。例如，二倍體甘藍(lán)與白菜不易雜交成功，但四倍體甘藍(lán)則能與之雜交。此外，也可以對(duì)F1代進(jìn)行染色體組加倍，使其細(xì)胞在減數(shù)分裂時(shí)能正常聯(lián)會(huì)，來(lái)克服遠(yuǎn)緣雜種的不育性。

在進(jìn)行蘭花新品種選育過(guò)程中，多倍體育種的意義還表現(xiàn)為通過(guò)染色體加倍的植物表現(xiàn)出的“巨大性”，可以培育出花朵大、花瓣多且厚、花色濃的蘭花新品種。此外，多倍體蘭花的植株粗壯、葉片寬闊濃綠，進(jìn)一步提高蘭花的觀賞價(jià)值和商品價(jià)值［17］。多倍體植株對(duì)外界環(huán)境條件的適應(yīng)性更強(qiáng)，抗旱、抗寒能力也進(jìn)一步提高。也可以將多倍體作為基因轉(zhuǎn)移的載體和基因漸滲的媒介作用，將野生種中的抗病基因轉(zhuǎn)移到栽培種。

4 存在問(wèn)題

蘭花雜交育種是一個(gè)系統(tǒng)的過(guò)程，周期長(zhǎng)達(dá)7～8年，在制定育種目標(biāo)時(shí)要判斷在7～8年后是否能得到消費(fèi)市場(chǎng)的認(rèn)可;雜交后代性狀分離，分離的后代中雜種類型較多，要注意篩選;雜交種子的無(wú)菌萌發(fā)是進(jìn)行雜交育種的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，要選擇合適的培養(yǎng)基，同時(shí)注意激素的配比。在多倍體誘導(dǎo)過(guò)程中，往往會(huì)出現(xiàn)大量的嵌合體，由于蘭花生長(zhǎng)緩慢，對(duì)嵌合體的純化非常困難;多倍體植株染色體數(shù)目增多，細(xì)胞分裂速度慢［18－19］，而且多倍體植株還存在組織培養(yǎng)中增殖率極低和花期延遲等問(wèn)題需要解決;誘導(dǎo)蘭花多倍體使用的秋水仙素等化學(xué)誘變劑對(duì)蘭花都有不同程度毒害作用，處理濃度和時(shí)間不適宜會(huì)抑制植株生長(zhǎng)，甚至?xí)?dǎo)致植株死亡。在自然界中的異源多倍體能較好地保持性狀生存下來(lái)，而人工誘導(dǎo)的異源多倍體通常競(jìng)爭(zhēng)不過(guò)正常二倍體或者又變回二倍體，因此異源多倍體的遺傳機(jī)制還有待深入研究。

5 展望

經(jīng)過(guò)2個(gè)或2個(gè)以上物種的染色體經(jīng)過(guò)重組后而形成的遺傳穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的個(gè)體叫做異源多倍體［20］。開(kāi)展種屬間雜交結(jié)合染色體加倍而形成的異源多倍體不僅可以克服遠(yuǎn)緣雜交的育種障礙，而且合成了一個(gè)新物種，在蘭花新品種培育方面具有廣闊的前景［21］。在異源多倍體中，雜合子往往還具有潛在的雜種優(yōu)勢(shì)。在水稻的研究中，遠(yuǎn)緣雜交和多倍體化相結(jié)合的育種技術(shù)不僅理論上已經(jīng)完善，以野生稻為重點(diǎn)的稻屬11個(gè)基因組圖譜也在研究中［22－23］。然而，我國(guó)對(duì)蘭花異源多倍體的系統(tǒng)研究尚未有報(bào)道。異源多倍體的基因表達(dá)的變化豐富了生物的多樣性，常出現(xiàn)不同于其二倍體且不能用孟德?tīng)柖山忉尩男卤硇停?4－26］，這些變異為育種工作提供了豐富的資源，對(duì)品種改良具有重要意義。此外，異源多倍體在形成早期，基因組會(huì)經(jīng)歷一個(gè)較長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定性進(jìn)化過(guò)程，親本染色體間存在部分同源性會(huì)引起親本染色體組間發(fā)生廣泛的重組交換［27］，從而使異源多倍體不同世代產(chǎn)生的配子間出現(xiàn)差異。因此，在利用遠(yuǎn)緣雜交與多倍體育種時(shí)還應(yīng)充分考慮和研究不同世代的利用效果。我國(guó)目前雖有育成異源多倍體蘭花植株，但關(guān)于異源多倍體蘭花的性狀、基因表達(dá)模式及其原因還未見(jiàn)報(bào)道，這將是今后在進(jìn)行蘭花新品種選育過(guò)程中的主要研究方向之一。

在保護(hù)的前提下，充分利用野生蘭花資源，克服蘭花雜交育種過(guò)程中遇到的種種技術(shù)難題，將蘭花遠(yuǎn)緣雜交與多倍體育種相結(jié)合將是今后蘭花育種的熱點(diǎn)之一。將蘭花常規(guī)雜交育種方法和誘變育種、基因工程相結(jié)合，以組織培養(yǎng)為手段，培育出觀賞性好、抗性強(qiáng)的蘭花新品種，滿足市場(chǎng)的需求，必將使我國(guó)蘭花在競(jìng)爭(zhēng)激烈的國(guó)際市場(chǎng)中立于不敗之地。

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