余建軍 車曉航 陶金 葉小磊 陳軼塵 陳曉東

[摘要] 目的 觀察天然藥物血竭素高氯酸鹽（Dracorhodin perchlorate，Dp）對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251和神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y抑制作用，并探討其作用機(jī)制。 方法 于2013年12月～2014年12月期間采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法檢測(cè)不同濃度Dp（0～100 μM）z作用后細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率；DAPI染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化；流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)Dp作用后細(xì)胞周期分布情況；Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白以及增殖相關(guān)通路，并用小分子抑制劑確認(rèn)通路靶點(diǎn)活化情況。 結(jié)果 血竭素高氯酸鹽可以顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251和神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的增殖（P<0.05），并使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1和CDK4的表達(dá)隨Dp濃度增加而減少，與0 μM組比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。增殖相關(guān)通路研究顯示，血竭素高氯酸鹽作用細(xì)胞24 h后Bax的表達(dá)明顯增加，Bcl-2表達(dá)減少。p53蛋白的表達(dá)隨藥物作用濃度增加而上調(diào)，Caspase-3和Caspase-9活化形式表達(dá)隨藥物作用濃度增加而上調(diào)。下游信號(hào)通路顯示，加入Dp后，MAPK通路中JNK和p38的磷酸化增強(qiáng)，加入對(duì)應(yīng)的抑制劑SP600125（JNK抑制劑）和SB203580（p38 MAPK抑制劑）后，可以減少由Dp所引起的凋亡。加入不同的凋亡抑制劑后，z-DEVD-fmk和z-LEHD-fmk對(duì)Dp誘導(dǎo)凋亡的拮抗作用最明顯（P<0.05）。 結(jié)論 血竭素可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251和神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的增殖，阻滯細(xì)胞于G0/G1期。血竭素高氯酸鹽可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生內(nèi)源性凋亡，并且通過活化Caspase-3以及Caspase-9誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，加入凋亡抑制劑z-DEVD-fmk和z-LEHD-fmk可在一定程度上減少凋亡細(xì)胞比例。研究機(jī)制表明Dp可能通過活化MAPK通路中的JNK和p38發(fā)揮促進(jìn)凋亡的作用，加入對(duì)應(yīng)抑制劑后會(huì)顯著降低Dp所誘導(dǎo)的凋亡。

[關(guān)鍵詞] 血竭素；膠質(zhì)瘤；凋亡；MAPK通路；JNK通路

[中圖分類號(hào)] R739.41 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）31-0011-05

Dracorhodin inhibit proliferation and induce apoptosis to glioma cells by influencing MAPK pathway

YU Jianjun1 CHE Xiaohang2 TAO Jin2 YE Xiaolei2 CHEN Yichen2 CHEN Xiaodong2

1.Department of Cerebral Surgery， the Affiliated Hospital of Ningbo University， Ningbo 315000，China；2.Medicine and Pharmacology Laboratory， Ningbo Institute of Medical Sciences， Ningbo 315020，China

[Abstract] Objective To clarify the role and mechanism of a natural medicine dracorhodin perchlorate（Dp） on the proliferation of U251 cells and neuroblastoma SH-SY5Y cells. Methods The whole experiment was carried out during December 2013 to December 2014. The inhibition rate of of Dp with different concentration （0-100 μM） was determined by methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide（MTT） assay. Cell morphology changes were observed after DAPI staining. Distribution of the cell cycle was analysised by Flow cytometry （FCM）. Changes of the apoptotic-related protein and the activation of downstream signaling pathway were determined by Western blot. Furthermore， the related inhibitors of downstream pathway were also added to confirm the influence of Dp. Results After treated with Dp， the proliferation of U251 cells and SH-SY5Y cells were significantly inhibited in a dose dependent manner （P<0.05）， with G0/G1 phase cell arresting. And both of the cell cycle-related proteins， Cyclin D1 and CDK4， were significantly downregulated in Dp treated group compared with the control group. However， after treatment with Dp for 24 h， the expression of Bax and p53 were significantly upregulated， while the expression of Bcl-2 was downregulated. The activated form of Caspase-3 and Caspase-9 were both upregulated. For mechanism research， we found reinforced phosphorylation of JNK and p38MAPK after Dp treatment， and on the other hand， the related protein inhibitor SP600125 （JNK inhibitor） and SB203580 （p38MAPK inhibitor） could significantly reduce the cell apoptosis which was induced by different concentration of Dp. Furthermore， z-DEVD-fmk and z-LEHD-fmk were demonstrated to have the most significant effect on reversing the pro-apoptotic effect of Dp（P<0.05）. Conclusion Dracorhodin can inhibit the proliferation of glioma cells U251 and neuroblastoma SH-SY5Y cells by blocking the cells in G0/G1 phase. Moreover， Dp induced cell apoptosis may be related to the activation of Caspase3/9， which is demonstrated by adding the related inhibitor z-DEVD-fmk and z-LEHD-fmk. The mechanism may be related to the activition of JNK and p38 MAPK pathway， which is embodied by a decreased apoptosis ratio after adding the related inhibitor of JNK and p38MAPK.

[Key words] Dracorhodinperchlorate； Glioma cells； Apoptosis； MAPK pathway； JNK pathway

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是起源于神經(jīng)外胚層的腫瘤，約占成人顱內(nèi)腫瘤的30%～50%。惡性膠質(zhì)瘤生存期短，死亡率高，容易復(fù)發(fā)，治療困難[1]。膠質(zhì)瘤術(shù)后易復(fù)發(fā)，長(zhǎng)期以來，單純手術(shù)治療惡性腦膠質(zhì)瘤的5年存活率小于25%[2]。近年來手術(shù)配合放化療取得了一定成效，但是化學(xué)藥治療過程中往往難以透過血腦屏障，長(zhǎng)期應(yīng)用后存在耐藥等問題[1]，離徹底根治尚有較大距離，且放化療所帶來的不良反應(yīng)嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。中醫(yī)藥在腦瘤治療方面，能夠在一定程度上保護(hù)健康腦組織，使大腦免受進(jìn)一步損傷，在減少并發(fā)癥和后遺癥，預(yù)防和治療腦瘤復(fù)發(fā)方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[3]。

血竭（Dracorhodin）為傳統(tǒng)中藥材，屬于棕櫚科植物麒麟竭果實(shí)及樹干中的樹脂。作為傳統(tǒng)中藥使用已經(jīng)有1500多年的歷史，1971年成功開發(fā)國(guó)產(chǎn)血竭后，在心腦血管系統(tǒng)疾病的治療中取得了較好的療效。其主要成分有血竭素、血竭紅素等黃酮類化合物，此外還含有皂苷類、甾醇類、萜類和其他化合物?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究表明，血竭有抗炎止痛、抗真菌及抗血栓等藥理作用[4，5]。近年來，不同的研究均顯示血竭素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有顯著的抑制效應(yīng)。血竭素高氯酸鹽可以誘導(dǎo)人宮頸癌Hela細(xì)胞[6]、胃癌SGC-7901[7]、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞[8]、早幼粒細(xì)胞白血病[9]、前列腺癌PC-3[10]和人惡性黑色素瘤A375-S2細(xì)胞產(chǎn)生凋亡[11，12]，引起細(xì)胞的凋亡與線粒體途徑以及MAPK的抑制等相關(guān)。但是目前尚未有血竭素對(duì)于腦瘤細(xì)胞作用的任何相關(guān)研究，因此，本次實(shí)驗(yàn)中采用人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251和神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y為研究對(duì)象，探討血竭素高氯酸鹽對(duì)于上述細(xì)胞的細(xì)胞增殖、凋亡及周期的作用，并對(duì)相關(guān)作用機(jī)制進(jìn)行探討，為血竭素的進(jìn)一步開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

血竭素高氯酸鹽（dracorhodin perchlorate，Dp）購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，含量以99.2%計(jì)。人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251和神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y購(gòu)于上海生化細(xì)胞所細(xì)胞庫(kù)（上海），DMEM培養(yǎng)基（GIBCO，USA），胎牛血清（biological industries，Israel），Caspase抑制劑Z-VAD-FMK等（Merck Millipore，Germany），Caspase-3以及Caspase-9的活化形式，Bcl-2，p53，Cyclin D1，CDK4等抗體（Santa Cruz，USA）。Phospho-p38 MAPK （Thr180/Tyr182），Phospho-p44/42 MAPK （Erk1/2）（Thr202/Tyr204），Phospho-SAPK/JNK（Thr183/Tyr185）以及抗兔二抗為CST公司試劑盒（Phospho-MAPK Family Antibody Sampler Kit，#9910，Cell Signaling Technology， Inc.，USA）。96孔板（Corning Incoperated，USA），倒置顯微鏡（Leica，Germany），熒光顯微鏡（Leica，Germany）。Annexin V/PI雙染試劑盒（BD Biosciences，USA）。

1.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

分別將人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251和神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y在DMEM中培養(yǎng)，以1×105細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度接種于96孔板中，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。用完全培養(yǎng)液稀釋血竭素高氯酸鹽儲(chǔ)液（10 mM），加入到細(xì)胞中，使終濃度分別為0、20、40、60、80、100 μM，每個(gè)濃度均設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，設(shè)置不加藥物只加溶劑的對(duì)照組，放回培養(yǎng)箱，孵育48 h后，每孔加入MTT液（5 mg/mL）20 μL，4 h后測(cè)定560 nm處細(xì)胞吸光度值（OD），利用下述公式計(jì)算抑制率（%）=（對(duì)照組OD-加藥組OD）/對(duì)照組OD×100%，得到細(xì)胞抑制率。

1.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及DAPI染色

將神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y以1×105細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度接種于放有滅菌蓋玻片的6 cm dish中，培養(yǎng)24 h后加入血竭素高氯酸鹽，終濃度為0和80 μM，分別于0、12、24、48 h用倒置顯微鏡觀察。48 h取出蓋玻片，使用4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞30 min，PBS洗3次，加入DPAI染色液（50 μg/mL），室溫20 s，PBS洗3遍，取出玻片，倒扣到載玻片上，于熒光顯微鏡下觀察。

1.4 細(xì)胞周期

將SH-SY5Y細(xì)胞以1×105細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度接種于10 cm dish中，分別加入血竭素高氯酸鹽，使得終濃度為0、20、40、80 μM，12 h后用胰酶消化細(xì)胞，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定后，加入PI（100 μg/mL）4℃染色30 min。500目尼龍網(wǎng)過濾后，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，分析數(shù)據(jù)并觀察細(xì)胞周期分布情況。

1.5 凋亡檢測(cè)以及凋亡抑制劑干預(yù)

為了解Caspase蛋白酶抑制劑和MAPK激酶抑制劑等對(duì)血竭素高氯酸鹽誘導(dǎo)U251和SH-SY5Y細(xì)胞死亡的影響，將SH-SY5Y細(xì)胞以1×105/mL的細(xì)胞密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h。加入一定濃度的caspase抑制劑：z-VAD-fmk（Caspase家族抑制劑），Ac-YVAD-cmk（Caspase-1抑制劑），z-DEVD-fmk（Caspase-3抑制劑），z-IETD-fmk（Caspase-8抑制劑），z-LEHD-fmk（Caspase-9抑制劑），z-AEVD-fmk（Caspase-10抑制劑），以上抑制劑終濃度為20 μM。SB203580、PD98059、SP600125上述抑制劑終濃度均為10 μM，培養(yǎng)1 h后再加入80 μM血竭素高氯酸鹽繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用Annexin V/PI雙染后，上流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡比例，并設(shè)置單染Annexin V或PI組用于設(shè)“門”。以右上和右下象限細(xì)胞比例為凋亡細(xì)胞比例，以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后取平均值用于統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 免疫印跡

將SH-SY5Y細(xì)胞以1×105/mL的細(xì)胞密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，加入血竭素高氯酸鹽，終濃度為0、20、40、80 μM，24 h后棄去上清，冷PBS漂洗1次，用細(xì)胞裂解液RIPA冰上裂解細(xì)胞后提取蛋白，1 mL一次性注射器吹打斷裂DNA，收獲蛋白后，15 000 g離心5 min，取上清加入Loading Buffer 100℃煮沸5 min后-40℃?zhèn)溆?，同時(shí)取2 μL上清用于蛋白BCA試劑盒定量，根據(jù)蛋白定量結(jié)果，每個(gè)泳道加入25 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，加入Caspase活化形式，p53，bcl-2，MAPK，以及周期相關(guān)蛋白等一抗4℃過夜。TBS-T漂洗3次，對(duì)應(yīng)二抗室溫1 h，TBS-T漂洗3次后，加入ECL發(fā)光液顯色，拍照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量資料數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊性的表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（means±SD），獨(dú)立兩組間數(shù)據(jù)采用配對(duì)設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，多組間比較使用單因素方差分析（one way ANOVA），如果方差不齊，采用Dunnetts T3方法；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血竭素高氯酸鹽對(duì)U251和SH-SY5Y細(xì)胞增殖的影響

U251和SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，加入不同濃度的血竭素高氯酸鹽，觀察其對(duì)細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果表明，血竭素高氯酸鹽可以明顯抑制U251和SH-SY5Y細(xì)胞增殖。在80 μM時(shí)候抑制效應(yīng)達(dá)到最大，繼續(xù)增加濃度達(dá)到320 μM后對(duì)抑制效率的提升不大。從細(xì)胞敏感性角度來看，SH-SY5Y對(duì)血竭素更為敏感，在80 μM作用下抑制率可達(dá)到71±6%，因此，后續(xù)試驗(yàn)主要以SH-SY5Y為考察對(duì)象。見封三圖1。

2.2 血竭素高氯酸鹽對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

光學(xué)顯微鏡下觀察80 μM血竭素高氯酸鹽作用于SH-SY5Y細(xì)胞24 h后，細(xì)胞變圓，膜皺縮，產(chǎn)生凋亡小體（封三圖2）。通過DAPI染色進(jìn)一步觀察藥物處理后細(xì)胞核的形態(tài)變化。正常細(xì)胞核表面光滑，發(fā)出的熒光均勻，藥物處理后細(xì)胞核皺縮，核膜附近產(chǎn)生空泡。且顏色較亮，說明出現(xiàn)核濃縮顯現(xiàn)，而對(duì)照組中藍(lán)色熒光分布均勻，細(xì)胞核大小相對(duì)均勻。

2.3 血竭素高氯酸鹽對(duì)細(xì)胞周期的影響

血竭素高氯酸鹽作用于SH-SY5Y細(xì)胞24 h后，流式檢測(cè)細(xì)胞周期變化情況，結(jié)果顯示，細(xì)胞主要阻滯在G0/G1期。周期相關(guān)蛋白Cyclin D1和CDK4蛋白隨藥物濃度增加表達(dá)減少，同樣表明細(xì)胞大部分被阻滯在G0/G1期，說明血竭素對(duì)細(xì)胞周期的作用，主要為阻滯SH-SY5Y細(xì)胞在G0/G1期。見封三圖3。

2.4 血竭素高氯酸鹽對(duì)細(xì)胞凋亡的影響以及相關(guān)通路分析

對(duì)于Bcl-2和Bax的表達(dá)，0、20、40、80 μM血竭素高氯酸鹽作用SH-SY5Y細(xì)胞24 h后，western blot檢測(cè)抗凋亡蛋白（Bcl-2）和促凋亡蛋白（Bax），結(jié)果顯示，60 μM血竭素高氯酸鹽作用細(xì)胞24 h后Bax的表達(dá)明顯增加，Bcl-2表達(dá)減少。此結(jié)果表明，血竭素高氯酸鹽誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡時(shí)改變了Bax/Bcl-2比例，提示可能激活線粒體途徑（封三圖4A）。對(duì)于p53的表達(dá)，0、20、40、80 μM血竭素高氯酸鹽作用SH-SY5Y細(xì)胞24 h后，western blot檢測(cè)p53的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，p53表達(dá)隨Dp作用濃度增加，表達(dá)量也增加。

利用不同的Caspase特異性抑制劑探討血竭素高氯酸鹽誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的具體途徑，在SH-SY5Y細(xì)胞預(yù)處理1 h后，各種抑制劑在不同程度上抑制了80 μM血竭素高氯酸鹽誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（封三圖4B）。加入不同的凋亡抑制劑的結(jié)果顯示，特異性Caspase-3抑制劑z-DEVD-fmk和Caspase-9 抑制劑z-LEHD-fmk能夠極為顯著的干預(yù)血竭素所引起的細(xì)胞凋亡效應(yīng)（P<0.01），提示血竭素可能主要通過Caspase-3/9途徑誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

2.5 MAPK信號(hào)通路在血竭素高氯酸鹽誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡中的作用

Western blot法進(jìn)一步檢測(cè)0、20、40、80 μM血竭素高氯酸鹽作用細(xì)胞24 h后細(xì)胞裂解液中ERK，JNK和p38等蛋白表達(dá)及活化情況，結(jié)果表明，血竭素高氯酸鹽能夠引起p38和JNK的磷酸化水平的增加，而對(duì)ERK的磷酸化水平上調(diào)不明顯（封三圖4C）。

為了進(jìn)一步確定Dp是否通過活化MAPK引起細(xì)胞凋亡，選擇MAPK家族的特異性抑制劑，SB203580（p38 MAPK抑制劑）、PD98059（ERK MAPK抑制劑）、SP600125（JNK MAPK抑制劑）加入到SH-SY5Y細(xì)胞中，預(yù)處理1 h后，加入Dp并使終濃度為80 μM。收獲細(xì)胞并進(jìn)行Annexin V/PI雙染，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞比例，結(jié)果顯示，3種抑制劑在不同程度上削弱由80 μM血竭素高氯酸鹽誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（封三圖4D），尤其以SB203580最為顯著（P<0.01），提示血竭素可能主要通過影響p38 MAPK途徑發(fā)揮作用。

3 討論

目前癌癥的治療仍然以化療放療以及手術(shù)治療為主，在此之中，化療仍然是腫瘤治療的主力軍。隨著研究的深入以及一系列臨床實(shí)驗(yàn)的開展，過去單純地進(jìn)行新藥研發(fā)已逐漸發(fā)展為新藥研發(fā)合并治療方案的革新以及老藥新用。而另一方面，分子藥理學(xué)與腫瘤藥理學(xué)研究證明多靶點(diǎn)小分子藥物可能對(duì)惡性腫瘤的控制具有更好的效果。中國(guó)作為以植物用藥最早的國(guó)家，其傳統(tǒng)的中藥成分已逐漸被現(xiàn)代藥理學(xué)所證明。中藥具有取材天然、作用平和、毒副作用小等西藥無法比擬的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。而且中藥中往往含有不少具有藥理活性的天然大分子結(jié)構(gòu)，不少在臨床上廣泛應(yīng)用的天然化合物如紫杉醇、萬古霉素等均無法通過人工手段合成，必須依賴生物發(fā)酵或提取等手段獲得，因此，對(duì)于我國(guó)傳統(tǒng)中藥中具有活性價(jià)值的天然產(chǎn)物的藥理活性的探索，將使得中醫(yī)藥進(jìn)一步煥發(fā)新生。

近年來的研究顯示，有50%～90%惡性腫瘤患者[13]常合并凝血功能的異常，患者的內(nèi)皮系統(tǒng)損傷，凝血、抗凝系統(tǒng)失調(diào)，導(dǎo)致血液凝固性增高，出現(xiàn)血栓風(fēng)險(xiǎn)增加，這一狀態(tài)也被稱為血液的高凝狀態(tài)，也稱為血栓前狀態(tài)[14]。血液高凝狀態(tài)不僅是導(dǎo)致患者死亡的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，而且可以通過多種機(jī)制引起腫瘤的轉(zhuǎn)移而影響預(yù)后。多種傳統(tǒng)中藥常有活血化瘀成分，本研究中的血竭主要成分中含有較多而黃酮類化合物，已有研究證明其具有明顯的抑制癌癥患者血小板聚集、抗血栓、增強(qiáng)纖溶活性[15]。因此，在本研究中，我們探討了血竭素對(duì)腦瘤細(xì)胞的藥理作用，旨在明確血竭素本身是否具有一定的抗腫瘤作用，從而為血竭作為腦瘤的臨床輔助治療提供新的思路。我們的研究顯示，血竭素能夠抑制腦瘤細(xì)胞的增殖，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。此外，流式細(xì)胞術(shù)證明血竭素可以阻滯膠質(zhì)瘤細(xì)胞于G0/G1期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮其抗腫瘤作用。

誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是抗腫瘤藥物發(fā)揮治療作用的重要途徑。細(xì)胞凋亡也稱為細(xì)胞程序性死亡，區(qū)別于壞死的主要特點(diǎn)在于不引起機(jī)體的炎癥反應(yīng)，通過形成凋亡小體，解構(gòu)細(xì)胞，最后被人體的免疫系統(tǒng)清除。其發(fā)生主要通過2條途徑實(shí)現(xiàn)，外源性途徑：Caspase家族成員中位于上游的Caspase-8及-10由死亡受體Fas、TNFα受體激活。而另一種內(nèi)源性途徑也叫線粒體途徑，則是首先Bax 活化后使線粒體外膜通透性升高，引起細(xì)胞色素C釋放到胞漿中，細(xì)胞色素C與Apaf-1結(jié)合激活Caspase-9前體后然后激活下游的Caspase-3等[16]。內(nèi)外源性途徑最終都通過順次活化下游的caspase-3、-6和-7，引起Caspase的底物被降解，最終完成細(xì)胞凋亡的過程[17，18]。本研究中發(fā)現(xiàn)，血竭素高氯酸鹽在高濃度作用下，可以引起腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生，對(duì)其凋亡途徑的研究顯示，主要通過內(nèi)源性途徑實(shí)現(xiàn)，這體現(xiàn)在凋亡蛋白Bax以及活化形式的Caspase3/9均在Dp處理后顯著上調(diào)，而抗凋亡蛋白Bcl-2則有下調(diào)趨勢(shì)。此外，在另一方面，特異性Caspase-3抑制劑z-DEVD-fmk和Caspase-9 抑制劑z-LEHD-fmk也能夠較為顯著地干預(yù)血竭素所引起的細(xì)胞凋亡效應(yīng)，這也同樣證明Dp引發(fā)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡主要通過線粒體途徑發(fā)生。但是也有一部分的凋亡效應(yīng)無法通過抑制劑加以逆轉(zhuǎn)，這同時(shí)說明Dp可能還存在其他引起細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。為了更深入的研究Dp所引發(fā)的信號(hào)通路變化，我們還檢測(cè)了p53蛋白在Dp作用后的表達(dá)。p53在細(xì)胞周期阻滯及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，可以通過調(diào)節(jié)p21及Bax來實(shí)現(xiàn)不同的作用，DNA損傷后激活野生型p53基因，當(dāng)上調(diào)了p21蛋白時(shí)，使細(xì)胞阻滯在G1期；如果p21被其他因素破壞后，細(xì)胞就會(huì)通過凋亡途徑死亡[19]。我們的研究表明，Dp處理后p53表達(dá)顯著上調(diào)，這說明Dp能夠激活p53通路而引發(fā)后續(xù)的凋亡信號(hào)。此外，MAPK家族成員在凋亡的調(diào)控中起到了重要作用。在順鉑等化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中，p38和JNK的激活后可啟動(dòng)凋亡途徑，活化后的JNK和p38通過促進(jìn)細(xì)胞色素C等線粒體內(nèi)促凋亡因子的釋放，激活下游的Caspase家族[20-22]。我們的研究最終提示，MAPK信號(hào)通路JNK與p38 MAPK的激活是引發(fā)后續(xù)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的重要誘因，繼而上調(diào)p53并開啟腫瘤細(xì)胞凋亡通路，最終發(fā)揮抗膠質(zhì)瘤的作用。

本次研究中Dp引起細(xì)胞增殖抑制和凋亡的作用濃度較高，但是Dp的毒副作用相對(duì)較小，安全性高，對(duì)于小鼠的最大耐受量研究顯示，以最大負(fù)荷給予小鼠灌胃，日劑量達(dá)到24g/kg，未見有任何毒副作用，3個(gè)月內(nèi)無長(zhǎng)期毒性反應(yīng)[23]。

綜上，我們認(rèn)為血竭素在未來的腦膠質(zhì)瘤研究中其臨床應(yīng)用價(jià)值有進(jìn)一步挖掘的空間，不僅可以通過建立裸鼠移植瘤，考慮其在體內(nèi)抗腫瘤的效果，而且可以探討Dp聯(lián)合臨床常見化療藥物后，對(duì)于化療藥“增效減毒”方面是否存在有益的價(jià)值，傳統(tǒng)中藥在這個(gè)領(lǐng)域中發(fā)現(xiàn)很多有益的案例。血竭素作為中國(guó)傳統(tǒng)中藥中的一個(gè)案例，在腦科方面臨床應(yīng)用探索還只是開始，期待將來會(huì)有更多臨床具體應(yīng)用的報(bào)道。

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（收稿日期：2015-06-25）