林善明，李增棋，王 航，陳 昆，余 毅，王長連

華法林是一類含有4－羥基香豆素基本結(jié)構(gòu)的抗凝血藥，通過抑制維生素K依賴的相關(guān)凝血因子的合成而發(fā)揮作用，臨床上主要用于血栓栓塞的預(yù)防。但華法林治療安全范圍窄，個(gè)體用藥劑量差別大，用藥劑量很難掌握[1]。目前，臨床上主要通過定期監(jiān)測凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）、國際標(biāo)準(zhǔn)化比值（international normalized ratio，INR）來調(diào)整華法林的用藥劑量。心外科換瓣手術(shù)后患者以INR波動(dòng)于1.8～2.5時(shí)抗凝效果最佳，出血、栓塞等風(fēng)險(xiǎn)較低。近年來研究表明，華法林代謝相關(guān)的基因多態(tài)性如細(xì)胞色素氧化酶P450 2C9＊1／＊3（cytochrome P450 2C9＊1／＊3，CYP2C9＊1／＊3）、維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體亞單位1－1639A／G（VKORC1－1639A／G）與個(gè)體間華法林維持劑量差異具有重要關(guān)系[2－5]。

本研究擬通過PCR－雜交技術(shù)對患者進(jìn)行CYP2C9＊1／＊3、VKORC1－1639A／G 基因分型，評(píng)估年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)（bady mass index，BMI）、VKORC1－1639A／G和CYP2C9＊1／＊3基因型等變量與華法林抗凝劑量之間的關(guān)系，建立一個(gè)適合福建人群的基因組學(xué)的華法林給藥模型預(yù)測劑量公式，指導(dǎo)華法林個(gè)體化用藥。

1 對象與方法

1.1 對象 收集2013年11月—2015年2月就診筆者醫(yī)院的患者119例，男性50例，女性69例，年齡（54.7±17.7）歲（12～80歲）。納入標(biāo)準(zhǔn)：規(guī)律服用相同劑量華法林鈉片（商品名：瑪爾維，芬蘭奧立安公司）3月，并且連續(xù)監(jiān)測3次INR均波動(dòng)于1.8～2.5的福建籍漢族患者，其中心臟瓣膜置換術(shù)后患者86例，心房顫動(dòng)患者24例，血栓栓塞患者9例（表1）。

排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重肝功能不全[丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）＞8～10ULN或者ALT＞3ULN且血清總膽紅素＞2ULN]；嚴(yán)重腎功能不全（當(dāng)內(nèi)生肌酐清除率下降到20mL／min以下，血尿素氮水平17.9～21.4mmol／L，血肌酐≥442μmol／L）；甲狀腺功能異常；腫瘤患者；結(jié)締組織疾?。恍牧λソ呋颊撸孕墓δ懿蝗盒墓δ堍艏?jí)）；妊娠；同時(shí)服用與華法林藥效動(dòng)力學(xué)及藥物動(dòng)力學(xué)相互作用的藥物（詳見藥品說明書）。

1.2 試劑 血液基因組DNA提取試劑盒（DP333，北京天根生化公司）；PCR產(chǎn)物測序（上海生工生物工程有限公司）；PCR引物合成（上海百傲科技有限公司）；CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性檢測試劑盒（PCR－芯片雜交法）（注冊號(hào)：3401328，上海百傲科技有限公司）。

1.3 儀器 全自動(dòng)血凝分析儀（STA－R Evolution，北京思塔高診斷產(chǎn)品貿(mào)易有限責(zé)任公司）；雙光束紫外可見分光光度計(jì)（TU1901，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；基因芯片圖像分析軟件（V2.0，上海百傲科技有限公司）；生物芯片識(shí)讀儀（BE2.0，上海百傲科技有限公司）；e－Hyb全自動(dòng)雜交儀（BR－526－24型，上海百傲科技有限公司）；PCR儀（Thermal cycler T100，美國Bio－Rad公司）；高速離心機(jī)（Pico21，美國Thermo公司）；電熱恒溫振蕩水槽（DKZ－2型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.4 方法 采集靜脈血用于檢測INR、VKORC1及CYP2C9基因型。記錄患者信息：年齡、性別、身高、體質(zhì)量、肝腎功能及華法林穩(wěn)態(tài)劑量。

1.4.1 INR值測定 采集空腹枸櫞酸鈉抗凝靜脈血2mL，用全自動(dòng)血凝分析儀檢測PT（黏度法又稱磁珠法），自動(dòng)計(jì)算得出INR值。

1.4.2 基因型測定

1.4.2.1 采樣及DNA擴(kuò)增 入選患者采集全血于EDTA抗凝管中，24h內(nèi)用吸附柱法提取DNA，以紫外法檢測DNA純度及濃度。精密吸取符合條件的DNA模板10μL，加入擴(kuò)增液與反應(yīng)液，在25μL體系中擴(kuò)增：50℃預(yù)變性5min→94℃變性30s→72℃退火延伸30s→35次循環(huán)→72℃延伸5min。PCR反應(yīng)后產(chǎn)物于2～8℃保存。

1.4.2.2 雜交反應(yīng)和基因分型 以上PCR產(chǎn)物加入雜交緩沖液，與抗體和顯色劑交于基因芯片上進(jìn)行圖像掃描與數(shù)據(jù)分析，輸出檢測結(jié)果。根據(jù)檢測結(jié)果，CYP2C9可分為下列6種基因型：＊1／＊1（＊2CC／＊3AA）、＊1／＊2（＊2CT／＊3AA）、＊1／＊3（＊2CC／＊3AC）、＊2／＊2（＊2TT／＊3AA）、＊2／＊3（＊2CT／＊3AC）、＊3／＊3（＊2CC／＊3CC）；VKORC1可分為下列3種基因型 VKORC1－1639GG、VKORC1－1639GA、VKORC1－1639AA。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，結(jié)果以±s表示，不同性別、不同基因型之間華法林劑量比較用兩樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用Pearson相關(guān)系數(shù)來分析華法林劑量與年齡、BMI的相關(guān)關(guān)系。多元線性回歸用于分析華法林劑量與各變量之間的關(guān)系構(gòu)建華法林劑量給藥模型，P＜0.05為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 性別與華法林劑量的關(guān)系 采用兩樣本t檢驗(yàn)分析，男性華法林用量為（3.00±1.06）mg／d，女性為（2.80±0.96）mg／d，性別對華法林穩(wěn)態(tài)劑量影響差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝0.735，P＞0.05）。

2.2 年齡和BMI與華法林的劑量關(guān)系 采用Pearson線性相關(guān)初步分析，華法林劑量與年齡負(fù)相關(guān)（r＝－0.276，P＝0.030），而與 BMI正相關(guān)（r＝0.142，P＝0.029）。

2.3 CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性與華法林的劑量關(guān)系 在VKORC1基因型檢測結(jié)果中，GG基因型出現(xiàn)2例，華法林用量均為7.5mg／d，統(tǒng)計(jì)學(xué)上不能代表一個(gè)分組，所以剔除該值。由于在中國漢族人群的不存在CYP2C9＊2型突變，CYP2C9＊3型突變較少（1%～3%）[6－7]，筆者在基因檢測過程中也未檢測到＊3＊3基因型。因此，所建立的模型中CYP2C9基因只包含了＊1＊3和＊1＊1基因型，VORC1基因只包含了AA和GA基因型。采用兩樣本t檢驗(yàn)初步分析，尚不能認(rèn)為CYP2C9和VKORC1不同基因型與華法林劑量之間差別存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

表1 不同基因型間華法林劑量差異比較Tab 1 Differences in warfarin dose for each genotype

2.4 建立多元線性回歸分析模型 經(jīng)年齡、性別、BMI調(diào)整后的多變量模型，采用多元線性回歸分析，模型中包含年齡、BMI、CYP2C9和VKORC1基因型，多元線性回歸方程的建立采用逐步納入法，并進(jìn)行驗(yàn)證，可以將CYP2C9（P＝0.039）和 VKORC1（P＝0.023）基因型納入方程，納入后模型更穩(wěn)定，預(yù)測力更強(qiáng)，排除了性別（P＝0.254）與疾病種類（P＝0.465）因素，該模型能夠最好的估計(jì)華法林劑量（r2＝0.212，P＝0.013，表2），得出最終回歸方程為：

在方程中，年齡為歲數(shù)，BMI＝體質(zhì)量／身高＾2（體質(zhì)量為kg，身高為 m），CYP2C9基因型是＊1＊1為1，基因型是＊1＊3為0，VKORC1基因型是AA為1，基因型是GA為0。

表2 多元線性回歸方程的系數(shù)Tab 2 The coefficients of multivariante equation of linear regression

3 討 論

華法林抗凝治療（特別是在抗凝治療初期）經(jīng)常出現(xiàn)用藥過量導(dǎo)致出血的風(fēng)險(xiǎn)，并且很難預(yù)測給藥劑量。這項(xiàng)研究旨在結(jié)合患者年齡、BMI、CYP2C9和VKORC1基因型因素預(yù)測華法林穩(wěn)態(tài)時(shí)給藥劑量，用以有效指導(dǎo)臨床用藥。

筆者采用兩樣本t檢驗(yàn)，提示暫不能認(rèn)為CYP2C9和VKORC1不同基因型與華法林劑量之間存在顯著差異，但采用逐步納入法建立的多元線性回歸模型，并對其進(jìn)行驗(yàn)證得知納入基因型后模型更穩(wěn)定，預(yù)測力更強(qiáng)。在男性和女性患者中華法林穩(wěn)態(tài)劑量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，性別對多元線性回歸的統(tǒng)計(jì)學(xué)模型依舊沒有做出顯著貢獻(xiàn)。因此，所建立的多元線性回歸模型中包含了年齡、BMI、CYP2C9（＊1／＊3和＊1／＊1）和 VKORC1（AA和 GA）基因多態(tài)性，排除了性別因素，該模型能有效解釋了約21.2%的華法林個(gè)體間穩(wěn)態(tài)劑量差異。

對映體S－華法林約比R－華法林抗凝有效5倍，原因主要是在肝臟經(jīng)CYP2C9代謝。野生型CYP2C9＊1兩個(gè)主要突變CYP2C9＊2和CYP2C9＊3，導(dǎo)致酶活性降低，華法林代謝減慢，最終個(gè)體抗凝所需的華法林劑量偏低[8]，從建立的多元線性回歸方程可知，CYP2C9＊1＊3基因型的穩(wěn)態(tài)劑量會(huì)相對低于＊1＊1基因型。

華法林通過抑制VKOR，從而阻止維生素K的反復(fù)利用，致使維生素K依賴的凝血因子停留于無凝血活性的前體階段而發(fā)揮抗凝作用。VKORC1是編碼VKOR的一個(gè)重要亞單位基因，其啟動(dòng)子區(qū)的1639G＞A基因多態(tài)性可導(dǎo)致華法林個(gè)體劑量差異[9]。由于VKORC1GA基因型的啟動(dòng)子活性高于AA型，最終導(dǎo)致VKORC活性增高，表現(xiàn)為華法林抵抗，因此需要更大劑量的華法林來達(dá)到目標(biāo)INR，所以VKORC1－1639GA比AA基因型所需華法林劑量高，這與筆者建立的模型是一致的。

本研究發(fā)現(xiàn)，大約有78.8%的個(gè)體劑量差異不能通過此模型解釋。其他的伴隨疾病、藥物影響、飲食結(jié)構(gòu)、日常生活習(xí)慣（如吸煙、飲酒等）及超過30種與華法林代謝相關(guān)的基因等可能導(dǎo)致這種個(gè)體差異[10]。如編碼維生素K氧化酶CYP4F2的基因、編碼微粒體中維生素K環(huán)氧化物還原酶EPHX1的基因突變等，均能導(dǎo)致華法林用藥的個(gè)體差異[11－12]，需要更進(jìn)一步的研究。

由于心臟瓣膜術(shù)后患者較房顫、血栓栓塞等患者對華法林更為敏感[13]，不能單純依靠所建立的模型和相關(guān)算法來指導(dǎo)華法林用藥，因此術(shù)后仍需反復(fù)監(jiān)測PT及INR來幫助臨床醫(yī)生調(diào)整相應(yīng)華法林用量。

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