孟 蕊，王亞杰，張伯虎，武月妮,2，楊亞州，趙政陽,*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省白水縣園藝站，陜西 白水 715600）

‘澳洲青蘋’果實解袋后果皮花青苷合成的變化

孟 蕊1，王亞杰1，張伯虎1，武月妮1,2，楊亞州1，趙政陽1,*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省白水縣園藝站，陜西 白水 715600）

以‘澳洲青蘋’為材料，測定套袋果實（對照組）與解袋后（處理組）果實果皮色澤參數(shù)、花青苷含量、多酚類物質(zhì)含量以及與花青苷合成相關(guān)的調(diào)控基因（MdMYB1、MdbHLH3、MdbHLH33、MdTTG1）和結(jié)構(gòu)基因（MdCHS、MdDFR、MdANS、MdUFGT）表達水平的變化。結(jié)果顯示：光是影響果實著色的重要因素，套袋遮光抑制了果實著色，套袋果實解袋后果皮L*、b*值逐漸降低，a*值逐漸升高，果實紅色加深；套袋抑制了果皮花青苷和黃酮醇合成，套袋果實解袋后果皮中矢車菊素-3-O-半乳糖苷、槲皮素-3-半乳糖苷和槲皮素-3-蘆丁糖苷的含量逐漸升高，而套袋對其他的酚類物質(zhì)影響不顯著；套袋抑制了與花青苷合成相關(guān)基因的表達，套袋果實解袋曝光后，果皮中與花青苷相關(guān)調(diào)控基因和結(jié)構(gòu)基因的表達水平均存在不同程度的升高，并且與果皮中花青苷含量變化的趨勢基本一致，表明‘澳洲青蘋’果實解袋后，果皮中與花青苷合成相關(guān)的基因迅速表達，從而促進了果皮中花青苷合成，而套袋抑制了果皮中與花青苷合成的相關(guān)基因的表達，從而抑制了花青苷合成。

澳洲青蘋；花青苷；多酚；基因表達；套袋

蘋果是中國第一大水果，中國也是世界第一大蘋果生產(chǎn)國。色澤是蘋果果實最重要的外觀品質(zhì)，果實的著色程度主要取決于果皮中花青苷含量的高低。花青苷是一種重要的類黃酮化合物，不僅能夠使植物的花、果實等呈現(xiàn)豐富的色彩，還具有抗癌、抗氧化、延緩衰老等多種功效，其對人體的保健功能近年來也引起了廣泛的關(guān)注[1-4]。研究花青苷合成的機理，對提高蘋果果實商品價值具有重要意義。

前人研究[5-6]表明，蘋果果皮中含有的最主要花青苷組分為矢車菊素-3-O-半乳糖苷。植物花青苷是在苯丙烷類代謝的基礎(chǔ)上，與綠原酸、槲皮素、原花青素等物質(zhì)一起，經(jīng)類黃酮途徑合成。蘋果果皮中花青苷的生物合成途徑已經(jīng)確立[7]，涉及了由苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）、查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS）、查爾酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase，CHI）、二氫黃酮醇還原酶（dihydroflavonol 4-reductase，DFR）、花青苷合成酶（anthocyanidin synthase，ANS）和類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP glycose: flavonoid 3-O-glucosyl transferase，UFGT）等參與的一系列酶促反應(yīng)。植物體內(nèi)的花青苷的合成除受到參與花青苷合成的酶影響外，在轉(zhuǎn)錄水平上主要受MYB、bHLH和WD40三類轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。關(guān)于花青苷合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在玉米、擬南芥和矮牽牛等模式植物中研究較多，近年來在肉質(zhì)果實中，如葡萄、番茄、蘋果等，也取得了重要進展[8-11]。目前，在蘋果果實中也已經(jīng)過克隆得到了MdMYB1、MdMYB10、MdMYBA等多個基因，其中MdMYB1被證實是控制蘋果果皮色澤的重要基因[8-9]。但是，植物體內(nèi)花青苷合成的機理極為復(fù)雜，受多種因素的影響，仍有許多問題亟待進一步研究。

‘澳洲青蘋’是一個古老的蘋果品種，果實呈典型的綠色。套袋是一項重要的栽培技術(shù)，能夠影響果實的色澤、風(fēng)味等，在中國蘋果產(chǎn)區(qū)中應(yīng)用極為廣泛。在中國渭北黃土高原，‘澳洲青蘋’套袋果實解袋后也能著鮮艷的紅色，為研究果實花青苷調(diào)控機理提供了重要的材料。本研究以‘澳洲青蘋’為試材，利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）以及實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)，測定其果實解袋后果皮色澤、矢車菊素-3-O-半乳糖苷含量、多酚類物質(zhì)含量以及與花青苷合成相關(guān)的調(diào)節(jié)基因、結(jié)構(gòu)基因相對表達量，旨在探究非紅色果實的花青苷合成、調(diào)控機制，為進一步研究蘋果果實花青苷合成機理提供參考。此外，果皮也是蘋果果實中類黃酮物質(zhì)含量較高的部位[12]，研究果皮中類黃酮的合成調(diào)控機理，也有助于提高果實的食用價值。

1 材料與方法

1.1 材料及套袋處理

材料為蘋果品種‘澳洲青蘋’，樹齡8 a生，基砧為新疆野蘋果，中間砧為M26。實驗于2013年在西北農(nóng)林科技大學(xué)白水蘋果試驗站進行，選取樹勢一致、生長勢強勁的植株8 株，于盛花期后 40 d采用‘鴻泰’雙層紙袋對果實進行套袋處理，于盛花期后175 d解袋，解袋時先解除外層紙袋，3 d后解除內(nèi)層紙袋。在解除內(nèi)層紙袋后 0、2、4、6、8、10 d進行采樣，以解袋的果實為處理組，以一直未解袋（內(nèi)外層紙袋均不解除）的果實作為對照組。采樣時選取樹冠外圍同一高度同一部位的果實，每次采樣時在每棵樹隨機選取不同方向的4 個果實，混合樣品，刮取果實胴部果皮（約1 cm寬），液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與儀器

矢車菊素-3-O-半乳糖苷標準品、綠原酸、根皮苷、表兒茶素、原花青素B2、槲皮素-3-半乳糖苷和槲皮素-3-蘆丁糖苷標準品 美國Sigma公司。

柱式RNAout 2.0 Kit 北京天恩澤公司；PrimeScriptR RT reagent Kit With gDNA Eraser、SYBR GreenⅠMaster 日本Takara公司；Minolta CR-400型色差計 日本柯尼卡-美達能公司；高效液相色譜儀（1525型高精度二元高壓梯度泵、2707型自動進樣器、2998光電二極管陣列檢測器、C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）） 美國Waters公司；IQ5實時定量PCR儀 美國伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1 指標測定

1.3.1.1 果皮色澤參數(shù)測定

在果皮赤道部位選5 個點，使用Minolta CR-400型色差計，采用國際照明委員會頒布的CIELAB評價體系測定果皮L*、a*、b*值。其中，L*值表示亮度，絕對值越大表示亮度越高；a*值表示紅綠色度，a*值為正代表紅色，為負代表綠色，絕對值越大表示顏色越深；b*值表示黃藍色度，b*值為正代表黃色，為負代表藍色，絕對值越大表示顏色越深。

1.3.1.2 果皮花青苷含量測定

樣品預(yù)處理：取0.5 g果皮液氮研磨成粉末，加入10 mL 0.5%的鹽酸-甲醇溶液，4 ℃避光浸提24 h后，12 000×g離心10 min，取1.5 mL上清液，經(jīng)0.45 μm微孔過濾器過濾后，轉(zhuǎn)移至自動進樣瓶備用。每個樣品設(shè)4 次重復(fù)。

高效液相色譜分析：洗脫條件參考劉玉蓮等[5]的方法，略有改動：進樣量10 μL，柱溫40 ℃，檢測波520 nm，流速1.0 mL/min；流動相為溶液A（甲醇）和溶液B（10%甲酸），利用溶液A進行梯度洗脫：0 min，17%；1 min，17%；15 min，35%；20 min，37%；25 min，100%。

1.3.1.3 果皮多酚類物質(zhì)含量測定

樣品預(yù)處理：取1.0 g果皮液氮研磨成粉末，加入30 mL 70%的甲醇溶液，30 ℃超聲提取 30 min后，12 000×g離心10 min，取1.5 mL上清液，經(jīng) 0.45 μm微孔過濾器過濾后，轉(zhuǎn)移至自動進樣瓶備用。每個樣品設(shè)4 次重復(fù)。

高效液相色譜分析：洗脫條件：進樣量10 μL，柱溫30 ℃，檢測波長280、320 nm，流速1.0 mL/min；流動相為溶液A（甲醇）和溶液B（1%乙酸溶液），利用溶液A進行梯度洗脫：0 min，5% A；25 min，30% A； 30 min，60% A；40 min，5% A。

1.3.2 實時定量PCR

利用柱式RNAout 2.0 Kit提取及純化樣品總RNA。利用PrimeScriptR RT reagent Kit With gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒，進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。根據(jù)基因序列設(shè)計特異性引物（表1）進行實時定量PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為：SYBR GreenⅠMaster 10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，cDNA模板2 μL，滅菌蒸餾水6.4 μL。PCR 反應(yīng)程序為：95 ℃、3 min；95 ℃、10 s，58℃、30 s，72 ℃、15 s，40 個循環(huán)；72 ℃、7 min。以Actin（GenBank序列號為 AB638619）為內(nèi)參基因，每個反應(yīng)設(shè)3 次重復(fù)。實驗結(jié)果用2?ΔΔCt法對數(shù)據(jù)進行定量分析。

表1 實時定量PCR引物序列Table1 Sequences of the primer pairs for real-time PCR

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 18.0軟件對色澤參數(shù)、花青苷含量、多酚類物質(zhì)含量和基因相對表達量的均值和方差進行分析，顯著性差異分析采用鄧肯極差法，不同字母表示在P = 0.05水平上差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘澳洲青蘋’果實解袋后果皮色澤的變化

圖1 ‘澳洲青蘋’果實解袋后果皮顏色的變化Fig.1 Color development in apple skin of ‘Granny Smith’ after bag removal

如圖1所示，解袋0 d的‘澳洲青蘋’果實不著色，隨著解袋時間的延長，果實紅色加深（未顯示）。如圖2所示，對照組‘澳洲青蘋’果實L*、a*、b*值基本保持不變，且L*值一直維持在較高水平，a*值一直為負，說明套袋提高了果面亮度，抑制了果實著色；處理組‘澳洲青蘋’果實解袋后，L*、b*值下降，a*值升高，表現(xiàn)出亮度下降、紅色加深的趨勢。果皮色澤參數(shù)在解袋后2 d到解袋后8 d變化最為明顯，其中a*值的變化趨勢與果實紅色變化趨勢一致（圖1）。

圖2 ‘澳洲青蘋’果實解袋后果皮L*（A）、a**（BB）和b*（C）值的變化Fig.2 Changes in L*, a* and b* in the skin of ‘Granny Smith’after bag removal

2.2 ‘澳洲青蘋’果實解袋后果皮中矢車菊素-3-O-半乳糖苷含量的變化

矢車菊素-3-O-半乳糖苷是蘋果果皮中最主要的花青苷組分，也是‘澳洲青蘋’果實著色后，果皮含有的主要花青苷組分[5]，可以說明果皮中花青苷含量變化的趨勢。處理組‘澳洲青蘋’果實在解袋后果皮中矢車菊素-3-O-半乳糖苷含量迅速上升，而對照組果實果皮中則一直未檢測到矢車菊素-3-O-半乳糖苷合成（圖3）。如圖3所示，‘澳洲青蘋’果實在解袋后第2～10天花青苷合成最為迅速，矢車菊素-3-O-半乳糖苷含量也由第2天的0.37 mg/100 g上升到第10天的10.34 mg/100 g。‘澳洲青蘋’果皮中矢車菊素-3-O-半乳糖苷含量的變化趨勢與a*值的變化趨勢以及果實紅色加深趨勢基本一致。

圖3 ‘澳洲青蘋’果實解袋后果皮矢車菊素--33--O-半乳糖苷含量的變化Fig.3 Changes in Cy 3-O-gal concentration in the skin of ‘Granny Smith’ after bag removal

2.3 ‘澳洲青蘋’果實解袋后果皮中多酚類物質(zhì)含量的變化

表2 ‘澳洲青蘋’果實解袋后果皮中多酚物質(zhì)含量的變化Table2 Changes in concentrations of phenolic compounds in the skin ooff ‘Granny Smiitthh’ after bag removalmg/g

如表2所示，處理組‘澳洲青蘋’果實解袋后，果皮中各酚類物質(zhì)含量的變化趨勢不一致。果皮中綠原酸含量，在果實解袋后略有降低。由表2可知，對照組和處理組果實果皮中根皮苷含量在解袋后的前6 d都呈現(xiàn)降低趨勢，但處理組果實果皮中根皮苷含量在解袋后6 d后又開始上升，同時對照組果皮中根皮苷含量繼續(xù)下降，最終處理組果實果皮中根皮苷含量要顯著高于對照組（P＜0.05）。果皮中主要的黃酮醇類物質(zhì)——槲皮素-3-半乳糖苷和槲皮素-3-蘆丁糖苷的含量，在果實解袋后迅速上升，在解袋后8 d達到峰值，其中槲皮素-3-半乳糖苷含量最高（表2）。處理組果皮中主要原花青素類物質(zhì)——表兒茶素和原花青素B2的含量，在解袋后4 d升至最高，且顯著高于對照組（P＜0.05），隨后又略有下降；而對照組中原花青素類物質(zhì)含量與處理組變化趨勢基本一致（表2）。

2.4 ‘澳洲青蘋’果實解袋后果皮中與花青苷合成相關(guān)調(diào)控基因表達分析

圖4 ‘澳洲青蘋’果實解袋后與花青苷合成相關(guān)調(diào)控基因表達水平的變化Fig.4 Changes in expression levels of genes involved in the regulation of anthocyanin biosynthesis in the skin of ‘Granny Smith’after bag removal

如圖4所示，與對照組相比，處理組‘澳洲青蘋’果實解袋后，果皮中與花青苷合成相關(guān)的調(diào)控基因的表達水平都有所上升。MdMYB1的相對表達量在果實解袋后明顯上調(diào)，且顯著高于對照組（P＜0.05）。MdMYB1的表達水平呈波動式上升，在解袋后0、4、8 d處于較高水平，在解袋后4 d達到峰值。除MdMYB1外，其他3 個轉(zhuǎn)錄因子基因——MdbHLH3、MdbHLH33和MdTTG1的表達水平在果實解袋后0 d立即上調(diào)，其中MdbHLH3、MdbHLH33的相對表達量較對照組上調(diào)了10 倍以上，在解袋后2、4 d，MdbHLH3、MdbHLH33和MdTTG1的表達水平有所下降，從解袋后6 d又開始上升，在解袋后8 d達到高峰后，又開始下降。與處理組相比，未解袋的‘澳洲青蘋’果實果皮中各基因表達水平變化較小，且一直處于較低水平。在解袋后2 d，對照組與處理組果皮中與花青苷合成相關(guān)的調(diào)控基因的表達水平都較低。

2.5 ‘澳洲青蘋’果實解袋后果皮中與花青苷合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因表達分析

圖5 ‘澳洲青蘋’果實解袋后與花青苷合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因表達水平的變化Fig.5 Changes in expression levels of anthocyanin-related structural genes in the skin of ‘Granny Smith’ after bag removal

如圖5所示，與解袋果實相比，對照組‘澳洲青蘋’果皮中相關(guān)結(jié)構(gòu)基因——MdCHS、MdDFR、MdANS和MdUFGT的表達水平變化較小，并且一直維持在較低水平。處理組‘澳洲青蘋’果實在解袋后，果皮中與花青苷合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因的表達水平持續(xù)上升，其中MdCHS、MdDFR、MdANS的表達水平在解袋后8 d達到峰值后略有下降，MdUFGT的表達水平在解袋后10 d達到峰值。

3 討 論

套袋是一項重要的栽培措施，能夠改善蘋果果實色澤，影響果實的品質(zhì)，在中國蘋果產(chǎn)區(qū)應(yīng)用廣泛[13-14]。在對紅色蘋果品種的研究中發(fā)現(xiàn)，套袋能夠顯著抑制蘋果果實花青苷的合成，而套袋后的解袋過程能夠促進花青苷的迅速合成[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，在渭北黃土高原地區(qū)，綠色蘋果品種‘澳洲青蘋’果實經(jīng)套袋處理后，也能夠著鮮艷的紅色。并且‘澳洲青蘋’果皮色澤的變化與矢車菊素-3-O-半乳糖苷含量變化趨勢一致，‘澳洲青蘋’套袋果實不著色，果皮中也未檢測到花青苷合成，而套袋果實解除內(nèi)袋后果皮中矢車菊素-3-O-半乳糖苷迅速積累，a*值不斷升高，紅色加深，這一現(xiàn)象與前人[15-16]在紅色品種中的研究結(jié)果基本一致。

植物體內(nèi)含有的其他多酚類物質(zhì)，諸如酚酸、二氫查爾酮、黃酮醇、原花青素，與花青苷一樣，都經(jīng)由類黃酮代謝途徑產(chǎn)生。近年來，蘋果多酚的抗氧化等功能也引起了廣泛關(guān)注，關(guān)于花青苷合成與其他酚類物質(zhì)代謝的關(guān)系也成為了研究熱點，但前人的結(jié)論并不一致。許多研究者認為蘋果中花青苷合成與其他酚類物質(zhì)代謝沒有明顯的聯(lián)系，二者的合成調(diào)控機制可能是彼此獨立的[7-8,17]。本研究中也發(fā)現(xiàn)，果皮中原花青素、綠原酸和根皮苷的含量在果實解袋后，與對照組相比，沒有顯著的差異，與花青苷合成沒有明顯的相關(guān)性，但是果皮中黃酮醇，即槲皮素-3-半乳糖苷和槲皮素-3-蘆丁糖苷的含量變化在解袋后迅速上升，與花青苷合成趨勢相似。Ju Zhigao等[17]發(fā)現(xiàn)套袋抑制了花青苷合成，但卻對簡單酚類物質(zhì)、類黃酮物質(zhì)含量沒有影響，而Feng Fengguo等[18]發(fā)現(xiàn)套袋降低了‘喬納金’果皮中多酚類物質(zhì)的含量，但解袋曝光后，酚類物質(zhì)含量會有所上升。本研究中發(fā)現(xiàn)‘澳洲青蘋’果實解袋后，僅黃酮醇的含量會有所上升，與前人的研究結(jié)果并不完全一致，關(guān)于多酚類物質(zhì)代謝與花青苷合成之間的關(guān)系，還需要進一步研究。

影響蘋果花青苷合成的調(diào)控基因，即編碼相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的基因，主要包括MYB、bHLH和WD40 3 類：其中MYB轉(zhuǎn)錄因子是目前研究最多的一類轉(zhuǎn)錄因子，已有多人的研究結(jié)果表明MdMYB1基因是誘導(dǎo)紅色蘋果品種果實中花青苷合成的關(guān)鍵基因[8,11,19]；bHLH類轉(zhuǎn)錄因子、WD40類轉(zhuǎn)錄因子對于蘋果花青苷合成也具有直接或者間接的促進作用[11]。本研究中發(fā)現(xiàn)，‘澳洲青蘋’套袋果實未解袋時果皮中各調(diào)控基因的表達一直處于較低水平；果實解袋后，各調(diào)控基因表達水平都存在不同程度的上調(diào)，可見綠色蘋果品種‘澳洲青蘋’著色過程也與MYB、bHLH、WD40三類轉(zhuǎn)錄因子密切相關(guān)。但是，‘澳洲青蘋’在解袋后，果皮中各調(diào)控基因的表達水平變化趨勢略有不同，其中MdTTG1、MdbHLH3表達水平變化趨勢較為一致，且與果皮花青苷含量變化正相關(guān)，而MdMYB1的表達水平的升高要早于花青苷合成的開始。因此推斷，在‘澳洲青蘋’果實解袋后的著色過程中，MdMYB1可能與MdTTG1和MdbHLH基因相互作用，共同調(diào)控花青苷合成。在對蘋果愈傷組織進行研究時，研究者發(fā)現(xiàn)MdTTG1能夠與bHLH轉(zhuǎn)錄因子互作，MdbHLH3可以與MdMYB1互作，促進蘋果果實花青苷合成[10,20]。

參與蘋果果實花青苷代謝途徑的酶，目前研究較多的包括PAL、CHS、CHI、DFR、ANS、UFGT：其中UFGT被多個研究者認為是控制紅色蘋果果實著色的關(guān)鍵酶[21-22]，UFGT活性和MdUFGT基因表達的缺失是導(dǎo)致‘Malay’蘋果白色突變體不著色的主要原因[23]；而其他幾種酶雖被認為對蘋果花青苷合成具有較為重要的作用，但研究者的看法并不統(tǒng)一[16,21,24]。Ubi等[25]發(fā)現(xiàn)CHS、DFR、ANS、UFGT基因在紅色蘋果品種著色過程中表達水平與花青苷積累相關(guān)，這些基因的共同表達促進了花青苷的合成，而在綠色品種中這些基因不表達。本研究中也發(fā)現(xiàn)，處理組‘澳洲青蘋’果實在解袋后，果皮中相關(guān)結(jié)構(gòu)基因——MdCHS、MdDFR、MdANS和MdUFGT的表達水同步上調(diào)，與果皮花青苷含量升高密切相關(guān)，由此推測綠色蘋果品種‘澳洲青蘋’果皮花青苷合成過程中，可能不存在關(guān)鍵酶，結(jié)構(gòu)基因受到了轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，同步上調(diào)，促進了花青苷合成，這一結(jié)果也與前人在紅色品種中研究結(jié)果一致[6,8]。此外，這些結(jié)構(gòu)基因的表達高峰出現(xiàn)在調(diào)控基因之后，這可能是結(jié)構(gòu)基因受到調(diào)控基因的誘導(dǎo)后表達的結(jié)果。Xie Xingbin等[20]也發(fā)現(xiàn)MdbHLH3可以與MdUFGT、MdDFR啟動子結(jié)合，啟動這些基因的表達，促進蘋果果實花青苷合成。

通過本研究發(fā)現(xiàn)，套袋抑制了‘澳洲青蘋’果皮中與花青苷合成相關(guān)基因的表達，從而抑制了果皮花青苷的合成，套袋后的解袋過程又通過促進果皮中相關(guān)基因的表達，誘導(dǎo)了果皮花青苷的合成，綠色蘋果品種‘澳洲青蘋’果皮花青苷合成的機制與紅色蘋果品種相似。此外，套袋對果皮多酚類物質(zhì)（除槲皮素外）含量并沒有顯著的影響，但果皮中黃酮醇的含量變化與花青苷含量變化一致，其與花青苷是否受到共同調(diào)控還需進一步研究。

[1] COOPER-DRIVER G A. Contributions of Jeffrey Harborne and coworkers to the study of anthocyanins[J]. Phytochemistry, 2001, 56(3): 229-236.

[2] MARTIN C, GERATS T. Control of pigment biosynthesis genes during petal development[J]. Plant Cell, 1993, 5(10): 1253-1264.

[3] SARKAR F H. Nutraceuticals and cancer[M]. Netherlands: Springer Netherlands, 2012: 201-229.

[4] PENG T, SATIO T, HONDA C, et al. Screening of UV-B-induced genes from apple peels by SSH: possible involvement of MdCOP1-mediated signaling cascade genes in anthocyanin accumulation[J]. Physiologia Plantarum, 2013, 148(3): 432-444.

[5] 劉玉蓮, 車飛, 郭延平, 等. 蘋果著色期花青苷和糖組分含量變化及關(guān)聯(lián)性[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(17): 47-52.doi: 10.7506/spkx1002-6630-201317011.

[6] HONDA C, KOTODA N, WADA M, et al. Anthocyanin biosynthetic genes are coordinately expressed during red coloration in apple skin[J]. Plant Physiology and Biochemistry, 2002, 40(11): 955-962.

[7] TAKOS A M, UBI B E, ROBINSON S P, et al. Condensed tannin biosynthesis genes are regulated separately from other flavonoid biosynthesis genes in apple fruit skin[J]. Plant Science, 2006, 170(3): 487-499.

[8] TAKOS A M, JAFFE F W, JACOB S R, et al. Light-induced expression of a MYB gene regulates anthocyanin biosynthesis in red apples[J]. Plant Physiology, 2006, 142(3): 1216-1232.

[9] 劉曉芬, 李方, 殷學(xué)仁, 等. 花青苷生物合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究進展[J].園藝學(xué)報, 2013, 40(11): 2295-2306.

[10] AN Xiuhong, TIAN Yi, CHEN Keqin, et al. The apple WD40 protein MdTTG1 interacts with bHLH but not MYB proteins to regulate anthocyanin accumulation[J]. Journal of Plant Physiology, 2012, 169(7): 710-717.

[11] PENG T, MORIGUCHI T. The molecular network regulating the coloration in apple[J]. Scientia Horticulturae, 2013, 163: 1-9.

[12] 聶繼云, 呂德國, 李靜, 等. 蘋果果實中類黃酮化合物的研究進展[J].園藝學(xué)報, 2009, 36(9): 1390-1397.

[13] 王少敏, 高華君, 張驍兵. 套袋對紅富士蘋果色素及糖、酸含量的影響[J]. 園藝學(xué)報, 2002, 29(3): 263-265.

[14] 高華君, 王少敏, 王江勇. 套袋對蘋果果皮花青苷合成及著色的影響[J]. 果樹學(xué)報, 2006, 23(5): 750-755.

[15] JU Zhiguo. Fruit bagging, a useful method for studying anthocyanin synthesis and gene expression in apples[J]. Scientia Horticulturae, 1998, 77(3): 155-164.

[16] JU Zhiguo, YUAN Yongbing, LIOU Chenglian, et al. Relationships among phenylalanine ammonia-lyase activity, simple phenol concentrations and anthocyanin accumulation in apple[J]. Scientia Horticulturae, 1995, 61(3/4): 215-226.

[17] JU Zhiguo, YUAN Yongbing, LIU Chenglian, et al. Relationships among simple phenol, flavonoid and anthocyanin in apple fruit peel at harvest and scald susceptibility[J]. Postharvest Biology and Technology, 1996, 8(2): 83-93.

[18] FENG Fengjuan, LI Mingjun, MA Fengwang, et al. The effects of bagging and debagging on external fruit quality, metabolites, and the expression of anthocyanin biosynthetic genes in ‘Jonagold’ apple (Malus domestica Borkh.)[J]. Scientia Horticulturae, 2014, 165: 123-131.

[19] ESPLEY R V, HELLENS R P, PUTTERILL J, et al. Red colouration in apple fruit is due to the activity of the MYB transcription factor, MdMYB10[J]. Plant Journal, 2007, 49(3): 414-427.

[20] XIE Xingbin, LI Shen, ZHANG Ruifen, et al. The bHLH transcription factor MdbHLH3 promotes anthocyanin accumulation and fruit colouration in response to low temperature in apples[J]. Plant Cell Environment, 2012, 35(11): 1884-1897.

[21] LIU Yulian, CHE Fei, WANG Lixin, et al. Fruit coloration and anthocyanin biosynthesis after bag removal in non-red and red apples (Malus×domestica Borkh.)[J]. Molecules, 2013, 18(2): 1549-1563.

[22] JU Zhiguo, LIU Chenglian, YUAN Yongbing. Activities of chalcone synthase and UDPGal: fl avonoid-3-O-glycosyltransferase in relation to anthocyanin synthesis in apple[J]. Scientia Horticulturae, 1995, 63(3): 175-185.

[23] KOTEPONG P, KETSA S, DOOM W G. A white mutant of Malay apple fruit (Syzygium malaccense) lacks transcript expression and activity for the last enzyme of anthocyanin synthesis, and the normal expression of a MYB transcription factor[J]. Functional Plant Biology, 2011, 38(1): 75-86.

[24] JU Zhiguo, YUAN Yongbing, LΙU Chengliang, et al. Dihydrofl avonol reductase activity and anthocyanin accumulation in ‘Delicious’,‘Golden Delicious’ and ‘Ιndo’ apples[J]. Scientia Horticulturae, 1997, 70(1): 31-43.

[25] UBI B E, HONDA C, BESSHO H, et al. Expression analysis of anthocyanin biosynthetic genes in apple skin: effect of UV-B and temperature[J]. Plant Science, 2006, 170(3): 571-578.

Anthocyanin Biosynthesis in the Apple Skin of ‘Granny Smith’ after Bag Removal

MENG Rui1, WANG Yajie1, ZHANG Bohu1, WU Yueni1,2, YANG Yazhou1, ZHAO Zhengyang1,*
(1. College of Horticulture, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2. Baishui Horticultural Station of Shaanxi Province, Baishui 715600, China)

Changes in fruit color, anthocyanins and phenolic compounds concentrations and the relative expression of MdMYB1, MdbHLH3, MdbHLH33, MdTTG1, MdCHS, MdDFR, MdANS and MdUFGT were determined in apple skin of bagged and bag-removed ‘Granny Smith’ fruits. Light is a key factor for fruit coloration. Red color development, fl avonol accumulation and anthocyanin biosynthesis in apple fruit skin were depressed by fruit bagging, while the values of L* and b* dropped, a* value and the concentrations of cyaniding-3-galactose, quercetin-3-galactoside and quercetin-3-rhamnosyl glucoside were increased radically in apple skin of ‘Granny Smith’ after bag removal, indicating the deepening of red color in the skin; fruit debagging had no signifi cant effects on chlorogenic acid, phlorizin and procyanidine accumulation. Similar to anthocyanins, transcript levels of MdMYB1, MdbHLH3, MdbHLH33, MdTTG1, MdCHS, MdDFR, MdANS and MdUFGT, the genes involved in anthocyanin biosynthesis were also depressed by fruit bagging. All the genes were induced by light after bag removal. It is demonstrated that fruit bagging inhibits anthocyanin biosynthesis by supressing the expression of genes involved in anthocyanin biosynthesis, and these genes could be induced by bag removal, leading to anthocyanin accumulation in apple skin.

Granny Smith; anthocyanin; polyphenol; gene expression; bagging

S661.1

A

1002-6630（2015）22-0216-06

10.7506/spkx1002-6630-201522041

2015-02-04

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-28）；“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃項目（2013BAD02B01-2）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2014BAD16B06）

孟蕊（1989—），女，博士研究生，研究方向為果樹育種與生物技術(shù)、蘋果果實品質(zhì)改良。E-mail：yiran4114@163.com

*通信作者：趙政陽（1964—），男，教授，博士，研究方向為果樹育種與生物技術(shù)、蘋果果實品質(zhì)改良。E-mail：zhaozy@nwsuaf.edu.cn