劉遠(yuǎn)成　張勁遠(yuǎn)　王健　彭西蘭　葉偉明

(安徽醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院　安徽)

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肛周尖銳濕疣高頻電刀電灼后應(yīng)用祛疣湯外洗降低復(fù)發(fā)率的研究

劉遠(yuǎn)成張勁遠(yuǎn)王健彭西蘭葉偉明

(安徽醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院安徽)

[摘要]目的觀察肛周尖銳濕疣高頻電刀電灼后應(yīng)用祛疣湯外洗后的復(fù)發(fā)率，及其對皮損區(qū)CDla朗格爾漢斯細(xì)胞和P53基因表達(dá)的影響。方法將59例肛周尖銳濕疣患者隨機(jī)分為治療組(30例)，術(shù)后應(yīng)用祛疣湯外洗,對照組(29例)，術(shù)后應(yīng)用高錳酸鉀液外洗。3個(gè)月后采用免疫組化等病理分析技術(shù)觀察肛周尖銳濕疣的復(fù)發(fā)率及皮損區(qū)CDlaLC數(shù)量和P53調(diào)控基因的變化。結(jié)果治療組復(fù)發(fā)3例(10.00%),對照組復(fù)發(fā)8例(27.59%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后3個(gè)月皮損區(qū)CDlaLC細(xì)胞的數(shù)量，治療組增加明顯，優(yōu)于對照組; 治療組皮損區(qū)術(shù)后3個(gè)月組織中P53基因表達(dá)降低明顯，高于對照組(P<0.05)。結(jié)論肛周尖銳濕疣高頻電刀電灼后應(yīng)用祛疣湯外洗可顯著降低復(fù)發(fā)率；通過增加皮損區(qū)CDlaLC細(xì)胞數(shù)量及降低P53基因的表達(dá)來降低其治療后的復(fù)發(fā)率。

[關(guān)鍵詞]肛周尖銳濕疣；祛疣湯；朗格罕氏細(xì)胞；P53基因

尖銳濕疣[1](Condyloma Acuminata,CA)是由人乳頭瘤病毒(Human Papilloma Virus,HPV)感染所致的皮膚黏膜良性增生性疾病,是最常見的性傳播疾病之一。不僅好發(fā)于外生殖器，更亦累及肛周，形成肛周尖銳濕疣(perianal condylomaacuminata,PCA),在臨床上易復(fù)發(fā)甚至惡變，其原因除了患者全身免疫功能下降外，更多學(xué)者認(rèn)為，局部免疫功能的異常是致病的重要因素。郎格爾漢斯細(xì)胞[2](Langerhans cells，LC)是啟動(dòng)免疫應(yīng)答的關(guān)鍵細(xì)胞，在抗HPV感染中作用非常重要。CDla分子是LC的標(biāo)記分子，與LC的抗原提呈功能有關(guān)，野生型基因P53[3]是細(xì)胞內(nèi)重要的腫瘤抑制基因和凋亡調(diào)節(jié)基因， 也是迄今為止發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤相關(guān)性極高的基因， 其參與細(xì)胞周期的調(diào)控、 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和激活DNA修復(fù)，本研究采用免疫組化方法對肛周尖銳濕疣電灼術(shù)后應(yīng)用祛疣湯熏洗對皮損區(qū)CDlaLC的數(shù)量、形態(tài)及皮損區(qū)P53調(diào)控基因影響的觀察，探討祛疣湯降低肛周尖銳濕疣復(fù)發(fā)率的可能機(jī)制，其報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1病例資料59例尖銳濕疣標(biāo)本來源于安徽醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院我科就診患者，符合《性病診療與預(yù)防》的CA診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，皮損均取自肛門周圍原發(fā)部位及附近，診斷明確。所有患者均經(jīng)電灼手術(shù)治療后，其中治療組30例，男19例，女11例，年齡28.4±1.6歲。對照組29例，男19例，女11例，年齡31.2±2.0歲，各組患者在病程、疣體、性別、年齡等方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2標(biāo)本的制備和免疫組化染色

1.2.1標(biāo)本的制備治療組術(shù)后應(yīng)用祛疣湯熏洗，對照組術(shù)后應(yīng)用高錳酸鉀液清洗。設(shè)定3個(gè)月為1個(gè)療程，觀察祛疣湯熏洗治療肛周尖銳濕疣的臨床療效及安全性，通過皮損區(qū)活檢取材固定后并通過免疫組化的方法，分別觀察術(shù)后3個(gè)月的療效及復(fù)發(fā)率。

藥物使用方法，治療組:單用祛疣湯熏洗液1000 mL，每天兩次，每次20 min。對照組:采用應(yīng)用高錳酸鉀液1/1000濃度1000 mL浸泡，每天2次，記錄復(fù)發(fā)情況及不良反應(yīng)，并定期取材標(biāo)本行免疫組化檢查。

1.2.2免疫組化染色所有標(biāo)本均經(jīng) 10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，5 um厚度連續(xù)切片，CDla鼠抗人單克隆抗體, 兔抗人單克隆抗體工作液、濃縮型DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。免疫組化操作均嚴(yán)格按照說明書步驟進(jìn)行。用已知陽性標(biāo)本做陽性對照， PBS代替一抗做陰性對照。

1.3結(jié)果判定將染色后的切片置于光學(xué)顯微鏡下觀察 ，光鏡下觀察，細(xì)胞膜或細(xì)胞漿呈黃褐色樹枝狀突起的細(xì)胞為CDla陽性LC。每張切片任意取LC分布最密集的5個(gè)區(qū)域，在高倍視野下計(jì)數(shù)CD1a陽性細(xì)胞數(shù)目。以5個(gè)高倍視野下CDla 陽性細(xì)胞平均值記為LC數(shù)目。P53蛋白陽性染色定位于細(xì)胞核。細(xì)胞陽性表達(dá)強(qiáng)度按照以下方法進(jìn)行半定量分析：①按細(xì)胞著色強(qiáng)度：淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；②按陽性細(xì)胞百分比：≤5%為0分,6%～25%為1分,26%～50%為2分， 51%～75%為3分,≥76%為4分，兩者分值的乘積即為細(xì)胞陽性表達(dá)強(qiáng)度，其分級方法為：O分為陰性(-),1～4分為弱陽性(+)，5～8分為陽性(++),9～12分為強(qiáng)陽性(+++)。采用單盲法,每張切片任選兩個(gè)皮片,每個(gè)皮片隨機(jī)選取表皮層5個(gè)高倍(400 倍)視野進(jìn)行評分，取其得分的平均數(shù)作為該標(biāo)本分值。將(+)～(+++)歸為陽性表達(dá)組計(jì)算陽性率。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，率的比較用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1治療組復(fù)發(fā)3例，占10.00%,對照組復(fù)發(fā)8例，占27.59%,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，觀察兩組治療藥物對皮膚和破損皮膚的刺激性患者均能耐受。

2.2治療組患者3個(gè)月后CDlaLc與對照組比較，數(shù)量明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)數(shù)字意義(P<0.05)。

表1　治療組和對照組CDlaLC數(shù)(±s，%)

表1　治療組和對照組CDlaLC數(shù)(±s，%)

組別治療前治療后治療組12.0±1.526.0±1.4*#對照組11.4±1.416.7±2.3*

注：治療前與治療后比較*P<0.05；治療組與對照組比較#P<0.05

2.3治療組和對照組3個(gè)月后CDla朗格漢斯細(xì)胞免疫組化圖見圖1a，圖1b。

2.4P53基因蛋白在治療組與對照組的表達(dá)情況見表2。

2.4P53基因蛋白在治療者和對照組術(shù)后3個(gè)月表達(dá)的免疫組化圖見圖2a，圖2b。

圖1a　治療組CDla朗格漢斯細(xì)胞(×400)

圖1b對照組CDla朗格漢斯細(xì)胞(×400)

表2　治療者和對照組術(shù)后3個(gè)月皮損區(qū)基因蛋白表達(dá)(±s,n)

表2　治療者和對照組術(shù)后3個(gè)月皮損區(qū)基因蛋白表達(dá)(±s,n)

組別-++++++陽性率治療組(n=30)2711110.0%*對照組(n=29)2053131.0%

注：治療組與對照組比較*P<0.05

圖2a　治療組基因蛋白表達(dá)(×400)

圖2b對照組基因蛋白表達(dá)(×400)

3討論

LC是骨髓衍生來的樹突狀細(xì)胞[5]，主要存在表皮內(nèi)，是免疫系統(tǒng)的重要成員，主要通過識別 、捕獲 、處理及提呈抗原 ，輔助 T細(xì)胞分化增殖 ，從而啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答[6]，發(fā)揮局部免疫監(jiān)視作用。在病毒感染性皮膚病中 ，LC起著傳遞病毒抗原的重要作用，CA皮損局部 LC數(shù)量減少 ，形態(tài)改變，難以將表皮內(nèi)的病毒抗原遞呈給真皮內(nèi)的免疫活性細(xì)胞，不能形成針對 HPV[7]的特異性細(xì)胞及體液免疫反應(yīng)，造成皮損持續(xù)存在或治療后容易復(fù)發(fā)。

祛疣湯為我院院內(nèi)制劑，藥物組成：鴉膽子15 g(壓碎后下)、土茯苓30、苦參30、薏苡仁15 g、枯礬15 g。現(xiàn)代藥理證實(shí)鴉膽子仁或油對正常皮膚或黏膜面有刺激作用,系一種細(xì)胞毒,臨床上治疣或乳頭狀瘤有效，土茯苓是歷代醫(yī)家治療陰瘡之要藥，藥理實(shí)驗(yàn)也證實(shí)該藥有抑制病毒作用。該方經(jīng)我科臨床使用，療效確切，且使用安全。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)肛周CA電灼后通過祛疣湯外洗，其復(fù)發(fā)率明顯降低，與對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

我們選擇檢測祛疣湯治療CA前后局部皮損處LC膜表面CDla抗原分子的表達(dá)和術(shù)后3個(gè)月的表達(dá)變化來闡述其祛疣的可能作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)通過祛疣湯外洗后發(fā)現(xiàn)皮損區(qū)CDlaLC的數(shù)量較對照組增加明顯(P>0.05)，且經(jīng)祛疣湯治療后病理切片可見取材區(qū)LC胞體變大，樹突狀突起明顯延長或增多，分布較均勻，表皮全層均可見細(xì)胞漿和細(xì)胞膜呈明顯的黃褐色；而對照組中皮損區(qū)CDla朗格漢斯細(xì)胞數(shù)量較治療前也有明顯改善，但其CDlaLC數(shù)量明顯少于治療組，且部分樹突結(jié)構(gòu)不完整，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明祛疣湯外洗可能通過增強(qiáng)患者局部LC的免疫功能，從而有效地防止其復(fù)發(fā)。

此外在正常細(xì)胞中野生型P53半衰期短，不易檢出，而在尖銳濕疣組織[8]中，P53基因與HPV病毒結(jié)合,導(dǎo)致其半衰期延長和穩(wěn)定性增強(qiáng)， 可用免疫組織化學(xué)的方法檢測出來， 此時(shí)的P53蛋白是突變和失活的[9]， 它不僅失去了正常野生型 P53蛋白的生長抑制作用，還具有癌基因的功能，可直接轉(zhuǎn)化細(xì)胞、促進(jìn)腫瘤的發(fā)生或贅生物的形成。本實(shí)驗(yàn)中治療組的P53蛋白的表達(dá)率較對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),提示祛疣湯可能通過降低CA組織中突變的P53基因蛋白的表達(dá)，從而降低其組織的增生，提高了治療的敏感性，降低肛周CA復(fù)發(fā)的可能。

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Study on the recurrence rates of perianal condyloma acuminata washed by Quyou soup after surgical treatment with the high-frequency electrosurgical generator

Liu Yuancheng,Zhang Jinyuan,Wang Jian,et al.(Department of Coloproctology,the Third Afflliated Hospital of Anhui Medical University,Hefei,230061,China)

[Abstract]Objective To observe the recurrence rates of perianal condyloma acuminata washed by Quyou soup after surgical treatment with the high-frequency electrosurgical generator, and the effects on the numbers of CDla langerhans cells and the expressions of P53 gene in skin lesion area. Methods 59 subjects of perianal condyloma acuminata were randomly assigned to the treatment group (N=30) and the control group (N=29). The perianal areas of the treatment group and the control group were respectively washed by Quyou soup and potassium permanganate solution after surgical treatment with the high-frequency electrosurgical generator. The recurrence rates of perianal condyloma acuminata, the effects of the numbers of CDla langerhans cells and the regulation of P53 gene in skin lesion area were observed by immunohistochemical inspection. Results There are 3 cases of recurrence (10.00%) in the treatment group and 8 cases of recurrence (27.59%) in the control group, which has a significant difference by statistics analysis. Compared with the control group, the numbers of langerhans cells were significantly increased, and the expressions of P53 genein were significantly decreased in the treatment group(P<0.05). Conclusion The Quyou soup may inhibit the recurrence rates of perianal condyloma acuminata after surgical treatment with the high-frequency electrosurgical generator, and increased the numbers of CDla langerhans cells and decreased the expression of P53 gene in skin lesion area.

[Key words]Perianal condyloma acuminata；Quyou soup；Langerhans cells；P53 gene

[收稿日期：2015-03-10]

[中圖分類號]R657.1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]1009-8771(2015)03-0186-04