劉小賢 汪衛(wèi) 王圳 鄭紅霞 馬紀林 于健寧 張雯

●論 著

轉化生長因子-β1對大鼠腹膜間皮細胞炎癥因子及細胞外基質表達的影響

劉小賢 汪衛(wèi) 王圳 鄭紅霞 馬紀林 于健寧 張雯

目的 研究轉化生長因子-β1（TGF-β1）對大鼠腹膜間皮細胞炎癥因子表達和細胞外基質（ECM）積聚的影響。方法體外培養(yǎng)SD大鼠原代腹膜間皮細胞，靜止24h后，采用RT-PCR檢測TGF-β1（10ng/ml）刺激后0、3、6、12、24、48h單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、白介素-6（IL-6）、Ⅰ型膠原（CollagenⅠ）、纖溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1）mRNA的表達情況；Western blot檢測TGF-β1（10ng/ml）刺激后0、4、12、24、48h CollagenⅠ和PAI-1表達情況；ELISA法檢測MCP-1和IL-6表達情況。結果TGF-β1處理6h后MCP-1、IL-6和PAI-1mRNA即開始逐漸升高，與0h組的差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0．05），24h后顯著升高（均P＜0．01）；TGF-β1處理12h后CollagenⅠmRNA表達開始明顯升高，與0h比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），24h后有顯著升高（P＜0．01）；TGF-β1處理4h后IL-6表達水平升高（P＜0．05），24h后顯著升高（P＜0．01）；處理12h后MCP-1和PAI-1表達水平較0h明顯升高（P＜0．05），處理24h后CollagenⅠ表達水平顯著升高（P＜0．05）；TGF-β1顯著增加MCP-1、IL-6、CollagenⅠ、PAI-1及其mRNA的表達上調。結論TGF-β1可能通過誘導大鼠腹膜間皮細胞炎癥因子上調表達和ECM積聚導致腹膜纖維化。

腹膜間皮細胞 炎癥因子 細胞外基質 轉化生長因子-β1

長期腹膜透析患者常由于腹膜纖維化導致超濾功能喪失而退出透析治療。腹膜纖維化是一個復雜的過程，涉及炎性細胞的浸潤、細胞外基質（ECM）的積聚及腹膜間皮細胞的轉分化等。轉化生長因子-β1（TGF-β1）是公認的促纖維化因子，但其具體機制目前并未完全清楚。筆者之前研究已經證實，TGF-β1可以誘導腹膜間皮細胞的轉分化[1]；因此，筆者進一步觀察TGF-β1對大鼠腹膜間皮細胞炎性因子、ECM積聚的影響，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 清潔級雄性SD大鼠（體重150～180g，由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供），TGF-β1（美國R&D Systems公司），羊抗Ⅰ型膠原（CollagenⅠ）抗體（美國CST公司），兔抗大鼠纖溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1）抗體（美國Santa Cruz公司），小鼠抗β-actin抗體（美國CST公司），DPI（美國CST公司），胎牛血清、DMEM/F12（美國Gibco公司），羊抗兔IgG抗體（美國CST公司），RNA提純試劑盒（美國Invitrogen公司），大鼠單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、IL-6ELISA檢測試劑盒（美國Biosource公司），其余試劑為國產分析純。

1.2 原代大鼠腹膜間皮細胞的培養(yǎng)、分組及觀察指標

1.2.1 分離與培養(yǎng) 取大鼠，予肌肉注射10%水合氯醛 0.5～0.8ml。麻醉后向大鼠腹腔內注射 20～30ml 0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）消化液。1h后斷頸處死大鼠，75%乙醇全身浸泡消毒10min。將大鼠仰面放置于超凈工作臺上，沿腹白線依次剪開腹壁皮膚及肌肉，吸出腹腔內的消化液，移入15ml離心管中。1 500r/min離心15min，棄上清液，加入含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，輕輕用吸管吹打使之成為細胞混懸液，分裝于25cm2的細胞培養(yǎng)瓶中。再加入培養(yǎng)基使之總體積達到4～5ml，放入37℃5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3d更換1次完全培養(yǎng)基。常規(guī)傳代，取第2代細胞進行實驗。

1.2.2 實驗分組及觀察指標 靜止24h后，將細胞隨機分成對照組（即0h組）和TGF-β1（10ng/ml）刺激組，采用半定量RT-PCR法觀察記錄TGF-β1處理0、3、6、12、24、48h后大鼠腹膜間皮細胞MCP-1、IL-6、PAI-1和CollagenⅠmRNA表達情況，分別采用ELISA和Western blot法觀察記錄TGF-β1處理0、4、12、24、48h后MCP-1、IL-6、CollagenⅠ和PAI-1表達情況。

1.3 半定量RT-PCR提取細胞總RNA 按照Trizol Reagent說明書進行操作。Biophotometry核酸測定儀（美國Eppenddorf公司）測定總RNA濃度，貯存于-80℃冰箱。按照RevertAidTM First Strand cDNA反轉錄試劑盒（美國MBI公司）說明書進行反轉錄。取約5μg的RNA樣本，以多聚寡核苷酸[Oligo（dT）18]為引物，在RevertAidTM M-MuLV反轉錄酶作用下合成cDNA。條件為70℃變性5min，37℃退火5min，42℃延伸60min，70℃孵育10min。合成的cDNA保存于-20℃冰箱備用。采用MBI公司PCR反應試劑盒進行PCR擴增。反應條件為94℃預變性5min，94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s，72℃孵育10min（退火溫度及循環(huán)周期依據引物和PCR產物而定）。引物設計按文獻[2]或自行設計，所有引物由上海生工合成，合成序列見表1。PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳，用Fluor ChemTM8900凝膠成像系統(tǒng)（美國Alpha Innotech公司）進行信號吸光度分析。結果由電泳圖的灰度值與內參灰度值的比值表示。

表1 PCR引物序列

1.4 Western blot檢測 參考文獻[3]，取各組細胞，棄上清液，PBS洗3遍，加入細胞裂解液，收取蛋白質，4℃12 000r/min離心15min，BCA法測定濃度。取30μg的蛋白標本，10%聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠上電泳，電壓90V 30min，140V 60min。室溫100V轉膜90min。5%脫脂奶粉封閉1h，TBST洗3次，加入一抗（羊抗大鼠CollagenⅠ抗體、兔抗大鼠PAI-1抗體），4℃過夜。TBST洗3次，10min/次，HRP標記的二抗（小鼠抗羊IgG抗體、羊抗兔IgG抗體）室溫孵育1h，TBST洗3次，顯色并曝光成像。掃描圖像并用圖像分析軟件進行信號吸光度分析。

1.5 ELISA檢測 將試劑盒室溫下放置20min以上，按說明書方法對標準品進行倍比稀釋。取出相應標本的上清液，離心，15min內加完全部的樣品。配制不同濃度的標準品，10倍稀釋鏈酶抗生物素蛋白，5倍稀釋洗板液，每孔加50μl孵育稀釋液，留1個孔作為顯色劑空白，將各濃度標準品依次加入相應各孔。另1個孔標準品稀釋液100μl作為零對照孔，其他孔加標準品稀釋液50μl繼之加樣品50μl（需復孔），輕輕敲打反應板邊緣混勻，除顯色劑空白，每孔加50μl生物素結合的MCP-1或IL-6抗體，輕輕敲打反應板邊緣混勻，覆蓋反應板膜，室溫下孵育90min，甩去板內液體，除顯色劑空白，每孔加鏈酶抗生物素蛋白100μl，室溫下孵育30min，甩去板內液體，，每孔加顯色劑100μl，室溫下孵育30min，每孔加100μl終止液，用酶標儀在450nm測定OD值，做標準曲線，計算MCP-1、IL-6水平。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS11.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間比較采用方差分析。

2 結果

2.1 TGF-β1處理后各時點大鼠腹膜間皮細胞MCP-1、IL-6、PAI-1和CollagenⅠmRNA表達情況的比較見圖1。

圖1 TGF-β1誘導腹膜間皮細胞MCP-1、IL-6、Collagen I及PAI-1mRNA表達的情況（M：Marker；與0h比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

由圖1可見，TGF-β1處理6、12、24、48h后MCP-1、IL-6和PAI-1mRNA均較0h明顯升高（P＜0.05或0.01），處理12、24、48h后CollagenⅠmRNA表達也較0h明顯升高（P＜0.05或0.01）。

2.2 TGF-β1處理后各時點MCP-1、IL-6、CollagenⅠ和PAI-1表達情況的比較 見圖2、表3。

表3 TGF-β1處理后各時點MCP-1、IL-6水平的比較（pg/ml）

由圖2、表3可見，TGF-β1處理4、12h后IL-6水平較0h升高（P＜0.05），24、48h后顯著升高（P＜0.01）；處理12、24、48h后MCP-1和PAI-1水平較0h明顯升高（P＜0.05或0.01），處理24、48h后CollagenⅠ表達水平較0h明顯升高（P＜0.05或0.01）。

3 討論

TGF-β1是目前公認的最強致纖維化因子，可以導致肝、肺、心臟及腎臟等諸多器官發(fā)生纖維化[4-7]，主要通過下列幾方面參與纖維化的病理過程：（1）促進上皮、間皮細胞向肌成纖維母細胞轉分化（EMT），TGF-β1可誘導腹膜間皮細胞表型改變，向肌成纖維細胞轉化，肌成纖維細胞絕對數量的增加是細胞外基質過度積聚的重要原因；（2）上調細胞外基質的合成，TGF-β1可上調CollagenⅠ、CollagenⅣ型膠原、纖連蛋白和層連蛋白的表達[8]；（3）抑制降解基質蛋白酶的活性，TGF-β1能抑制基質金屬蛋白酶、凝血酶原激活物和膠原酶等的活性[9]；（4）活化上述蛋白酶的抑制劑，如基質蛋白酶抑制劑（TIMPs）和PAI-1[9]；（5）作用于臟器固有細胞和浸潤細胞，產生多種活性細胞因子包括MCP-1、IL-6、IGF、PDGF等。TGF-β1還是重要的免疫調節(jié)因子，在T細胞和其他非淋巴細胞中起抗炎因子的作用。

細胞浸潤在腹膜纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起了重要作用。MCP-1是一種對單核/巨噬細胞有強烈趨化作用的細胞因子，可在多種細胞中產生，其中包括單核細胞、內皮細胞、平滑肌細胞、上皮細胞、纖維母細胞、星形膠質細胞、腎組織細胞和某些腫瘤細胞，參與炎癥和組織纖維化的形成[2,10]。IL-6是一種可由多種細胞包括單核-巨噬細胞、T細胞、系膜細胞、內皮細胞、上皮細胞分泌的具有多種功能的細胞因子，其功能包括調節(jié)免疫及炎癥反應、調節(jié)急性期蛋白的產生、參與骨代謝及造血。IL-6在炎癥的發(fā)生、發(fā)展中也起著重要作用。研究顯示TGF-β1在多種細胞包括腎小管上皮細胞、人單核細胞、角質形成細胞、人肺成纖維細胞等細胞中均可上調IL-6的表達[11-14]。

本研究結果顯示，TGF-β1可上調大鼠腹膜間皮細胞MCP-1、IL-6及其mRNA的表達，提示TGF-β1是重要的促炎癥細胞因子，但TGF-β1促進MCP-1及IL-6表達的信號通路并不十分明確。Cheng等[14]報道TGF-β1通過激活ERK、p38和ROS，刺激系膜細胞表達MCP-1，但沒發(fā)現NF-κB的激活。還有研究認為TGF-β1可能通過MAPK通路，激動蛋白-1（AP-1）和JunD同源二聚體使人的肺成纖維細胞生成IL-6增多[15]。纖維化除了炎癥細胞和因子的參與，另外一個特點即是過量的ECM如膠原Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型、纖維連接蛋白和層連蛋白，在腹膜間皮細胞積聚及成纖維細胞增生。細胞外基質蛋白的沉積依賴于ECM合成與分解代謝的平衡。

TGF-β1促進ECM合成的作用體現于多個環(huán)節(jié)，一方面上調基質成分基因的轉錄、翻譯等步驟，如上調膠原和纖維粘連蛋白的基因表達，加強膠原和纖維粘連蛋白的合成，促進胞外基質受體的轉錄、翻譯和蛋白形成等，促進ECM的沉積；另一方面通過減少基質降解蛋白酶的合成和分泌，增加降解酶阻制劑的合成和分泌抑制基質的降解。調節(jié)ECM代謝的ECM降解酶類纖溶酶原激活物/纖溶酶原激活物抑制物（PAs/PAIs）的表達與活性異常在ECM積聚中發(fā)揮重要的作用。PAs/PAIs是調節(jié)纖溶系統(tǒng)活性的重要物質，不僅起著維持血液中凝血與纖溶平衡的作用，而且參與維持ECM降解的動態(tài)平衡。PAs可由多種細胞生成和分泌，如T淋巴細胞、內皮細胞、腎小管上皮細胞等都可生成和分泌PAs。PAs分為組織型（tPA）和尿激酶型（uPA）兩種。目前認為tPA的生理功能主要是作為纖溶的生理性激活劑，維持纖溶內環(huán)境的穩(wěn)定，其在ECM降解和重塑過程中所起的作用還需進行探討。uPA主要參與ECM降解和重塑，能夠降解層粘連蛋白、纖維連接蛋白、IV膠原等多種糖蛋白。PAIs是PAs的生理性特異抑制物，現已發(fā)現4種不同類型的PAIs（PAI-1、PAI-2、PAI-3、PAI-4），均有抑制PAs的作用，其中PAI-1既是PAI的主要形式，也是PAs最重要的抑制劑，所以目前對PAIs的表達調控的研究也主要集中在PAI-1。近年來研究表明，地塞米松、LPS、IL-1、IL-6、AngⅡ、TNF-α、EGF等對PAI-1均具有上調作用，而多肽類激素如促卵細胞激素（FSH）和黃體生長素（LH）對PAI-1表達則有下調作用[16-20]。許多腎臟疾?。ㄈ缒I小球腎炎、IgA腎病、狼瘡性腎炎等），腎組織局部PAI-1的變化失調，表現為uPA或tPA表達下調，而PAI-1表達上調。本研究顯示，TGF-β1可上調大鼠腹膜間皮細胞CollagenⅠ和PAI-1及其mRNA的表達，從而使ECM沉積增加和降解減少，證實PAs/PAI-1在腹膜纖維化的發(fā)生中也起著重要的作用。

目前已知TGF-β1可上調多種細胞PAI-1的表達，但尚不清楚TGF-β1通過怎樣的信號傳遞途徑調節(jié)PAI-1的表達。有研究顯示，TGF-β1可誘導上皮細胞產生ROS，生成的ROS介導了由TGF-β1誘導的細胞PAI-1及其mRNA表達上調和活性的增強，長期給予抗氧化劑牛磺酸可有效抑制腎小球PAI-1及其mRNA表達的上升[21]。

綜上所述，TGF-β1促進組織和器官纖維化的作用是多方面的，除誘導細胞轉分化外，上調炎癥因子表達，以及促進ECM蛋白的合成和減少ECM的降解，使ECM增多和異常沉積也發(fā)揮了作用，其具體機制尚待進一步深入研究。

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ObjectiveTo investigate the effect of TGF-β1 on expression of inflammatory factors and accumulation of extracellular matrix in rat peritoneal mesothelial cells(RPMCs)．MethodsAfter growth arrest and synchronization for 24 h,primarily cultured RPMCs were treated with TGF-β1(10ng/ml)for 0,4,12,24 and 48h．The mRNA and protein expression levels of MCP-1, IL-6,CollagenⅠand PAI-1 were measured by RT-PCR and ELISA/Western blotting,respectively．ResultsCompared to 0h group, the expression of MCP-1,IL-6 and PAI-1 mRNA after 6h stimulation and the expression of CollagenⅠmRNA after 12h stimulation was up-regulated (P＜0．05)．TGF-β1 also significantly up-regulated the expression of MCP-1,IL-6 and PAI-1 proteins after 4h and 12h stimulation,and up-regulated expression of CollagenⅠprotein after 24h stimulation(P＜0．05)．TGF-β1 up-regulated mRNA and protein expression levels of MCP-1,IL-6,CollagenⅠand PAI-1 in a time-dependent manner in RPMCs．ConclusionTGF-β1 induced inflammatory factors upregulation and accumulation of extracellular matrix in RPMCs,which may be associated with peritoneal fibrosis．

Peritoneal mesothelial cells Inflammatory factors Extracellular matrix TGF-β1

2014-08-20）

（本文編輯：嚴瑋雯）

浙江省自然科學基金項目(Y2101241)

310003 杭州，浙江省中西醫(yī)結合醫(yī)院腎內科

張雯，E-mail：zhangwenta@hotmail.com