葉繼輝 李超芬 丁群力

亞胺培南耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌醫(yī)院感染危險(xiǎn)因素分析

葉繼輝 李超芬 丁群力

目的 了解亞胺培南耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌（CRAB）醫(yī)院感染的危險(xiǎn)因素，并探討Ⅰ類整合子在鮑曼不動(dòng)桿菌亞胺培南耐藥中的作用。方法選取確診為CRAB醫(yī)院感染患者54例作為病例組，按1:3配對(duì)選擇162例亞胺培南敏感鮑曼不動(dòng)桿菌（CSAB）醫(yī)院感染患者作為對(duì)照組，采用單因素分析及多因素logistic回歸分析其危險(xiǎn)因素，PCR檢測(cè)Ⅰ類整合酶基因。結(jié)果單因素分析發(fā)現(xiàn)，與CRAB醫(yī)院感染相關(guān)的危險(xiǎn)因素有病情危重、入住ICU時(shí)間、住院時(shí)間≥14d、機(jī)械通氣/人工氣道、留置尿管、中心靜脈置管、免疫抑制劑的使用、抗生素使用時(shí)間≥7d、抗生素藥物種類≥3種。多因素logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，病情危重（OR:8．47; 95%CI:1．56～46．0）、入住ICU時(shí)間（OR:9．32;95%CI:1．83～47．43）、住院天數(shù)≥14d（OR:13．89;95%CI:3．07～62．85）、機(jī)械通氣/人工氣道（OR:18．86;95%CI:4．38～81．31）、抗生素使用種類≥3種（OR:6．16;95%CI:1．85～20．51）、抗生素使用時(shí)間≥7d（OR: 5．41;95%CI:1．36～21．58）是CRAB醫(yī)院感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；CRAB組中Ⅰ類整合酶基因檢出率（59．3%）顯著高于CSAB組（34．6%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．001）。結(jié)論病情危重、入住ICU時(shí)間、住院時(shí)間、機(jī)械通氣/人工氣道、抗生素使用種類≥3種、抗生素使用時(shí)間≥7d是CRAB醫(yī)院感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，Ⅰ類整合子在CRAB中普遍存在，需加強(qiáng)對(duì)相關(guān)危險(xiǎn)因素的控制及耐藥機(jī)制的研究，早期防治CRAB醫(yī)院感染的發(fā)生。

亞胺培南耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌 醫(yī)院感染 危險(xiǎn)因素 Ⅰ類整合子

近年來(lái)不動(dòng)桿菌已成為醫(yī)院感染的常見病原菌，其 臨床分離率逐年上升[1]，而且該菌多藥耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重[2-3]，自1991年美國(guó)首次分離出碳青霉烯類耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌[4]（CRAB）后，陸續(xù)在世界各地被分離出，并出現(xiàn)泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌、全耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌，為臨床治療帶來(lái)極大難度，因而早期發(fā)現(xiàn)其危險(xiǎn)因素、研究其耐藥及傳播機(jī)制顯得尤為重要。為掌握本地區(qū)亞胺培南耐藥鮑曼不動(dòng)菌（carbapenem resistant acinetobacter baumannii，CRAB）醫(yī)院感染的相關(guān)危險(xiǎn)因素，筆者對(duì)本地區(qū)3家醫(yī)院CRAB醫(yī)院感染患者進(jìn)行1∶3配對(duì)病例對(duì)照研究，尋找CRAB醫(yī)院感染的危險(xiǎn)因素；同時(shí)采用PCR技術(shù)，檢測(cè)本地區(qū)鮑曼不動(dòng)桿菌I類整合子的分布情況，探討其對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌亞胺培南耐藥性的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2012年1至12月寧波市第一醫(yī)院24例、寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院20例和寧波市第九醫(yī)院10例均經(jīng)確診為CRAB醫(yī)院感染患者，男30例，女24例，年齡48～76歲，平均（54.7±9.8）歲。按1∶3配對(duì)選擇與病例組同期住院的亞胺培南敏感鮑曼不動(dòng)桿菌（carbapenem susceptible acinetobacter baumannii，CSAB）醫(yī)院感染患者162例（寧波市第一醫(yī)院74例、寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院57例、寧波市第九醫(yī)院31例），男89例，女73例，年齡43～79歲，平均（56.1± 13.2）歲。兩組患者性別、年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 藥物敏感試驗(yàn) 所有菌株均由VITEK 2全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)鑒定，質(zhì)控菌株為大腸埃希菌株ATCC25922，銅綠假單胞菌ATCC27853，均購(gòu)自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。M-H培養(yǎng)基、亞胺培南紙片10μg、美羅培南紙片10μg購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司。藥物敏感性根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（CLIS2009）[5]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行抗生素藥物判讀，MIC值≥2μg/ml被認(rèn)為碳青酶烯類耐藥株，然后經(jīng)E-test實(shí)驗(yàn)確認(rèn)。

1.2.2 資料收集方法 調(diào)查內(nèi)容包括：（1）一般情況：姓名、性別、年齡、診斷、基礎(chǔ)疾病、病情、血清白蛋白濃度、住院時(shí)間、入住ICU時(shí)間；（2）介入性操作：手術(shù)、麻醉、引流、氣管插管、機(jī)械通氣、導(dǎo)尿管、動(dòng)靜脈置管以及其他介入操作等；（3）藥物治療情況：抗生素使用種類及時(shí)間、免疫抑制藥的應(yīng)用。

1.2.3 細(xì)菌DNA制備 采用細(xì)菌DNA提取試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明提取細(xì)菌DNA，試劑盒為廣州合達(dá)天根公司產(chǎn)品（試劑編號(hào)：DV810A）。

1.2.4 Ⅰ類整合子檢測(cè) Ⅰ類整合子檢測(cè)PCR引物參考文獻(xiàn)[6]，由上海英駿公司合成，上游引物序列為5′-CAGTGGACATAAGCCTGTTC-3′，下游引物序列為5′-CCCGAGGCATAGACTGTA-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段為160bp。擴(kuò)增體系：擴(kuò)增體系50μl，包括正反引物各1μl，模板1μl，緩沖液（×10）10μl，鎂離子（1.5mmol/L）3μl，Taq酶（5U）0.25μl，dNTP（2.5mmol/L）1μl，雙蒸水補(bǔ)足至50μl。反應(yīng)條件：95℃10min擴(kuò)增前預(yù)變性；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增后延伸：72℃10min。擴(kuò)增產(chǎn)物以1.2%瓊脂糖凝膠（加EB）電泳，電泳電壓為100V，電泳30min。電泳完畢后，放入凝膠成像系統(tǒng)機(jī)內(nèi)，觀察結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)變量進(jìn)行單因素分析；將單因素分析具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義及具有專業(yè)意義的因素進(jìn)行多因素條件logistic回歸分析，判斷獨(dú)立危險(xiǎn)因素。各因素賦值如表1。

表1 CRAB醫(yī)院感染影響因素賦值表

2 結(jié)果

2.1 感染部位及Ⅰ類整合子檢測(cè)電泳結(jié)果 所有患者均經(jīng)臨床送檢標(biāo)本證實(shí)，主要感染部位是呼吸道感染159例（73.6%），血流感染25例（11.6%），燒傷和創(chuàng)傷分泌物23例（10.6%），尿路感染5例（2.3%），其它4例（1.9%），所有標(biāo)本經(jīng)Ⅰ類整合子檢測(cè)電泳，電泳圖見圖1。2.2 CRAB醫(yī)院感染的單因素分析 病情危重、入住ICU時(shí)間、住院時(shí)間≥14d、機(jī)械通氣/人工氣道、留置尿管、中心靜脈置管、免疫抑制劑的使用、抗生素使用時(shí)間≥7d、抗生素使用種類≥3種是CRAB醫(yī)院感染的主要危險(xiǎn)因素，詳見表2。

2.3 多因素條件logistic分析 將單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的9個(gè)變量再進(jìn)行l(wèi)ogistic多因素回歸分析，結(jié)果顯示病情危重、入住ICU時(shí)間、住院天數(shù)≥14d、機(jī)械通氣/人工氣道、抗生素使用種類≥3種、抗生素使用時(shí)間≥7d是CRAB醫(yī)院感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，詳見表3。2.4 Ⅰ類整合子檢出率比較 在檢測(cè)的54株CRAB中發(fā)現(xiàn)32株整合子陽(yáng)性，陽(yáng)性率為59.3%，CSAB整合子陽(yáng)性56株（34.6%），兩組間整合子檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），詳見表4。

圖1 鮑曼不動(dòng)桿菌I類整合子PCR產(chǎn)物檢測(cè)（1：MARK；2：陽(yáng)性對(duì)照；3：陰性對(duì)照；4～8：整合子陽(yáng)性）

表2 CRAB醫(yī)院感染的單因素分析

表3 CRAB醫(yī)院感染的logistic多因素分析

表4 CRAB醫(yī)院感染的logistic多因素分析

3 討論

鮑曼不動(dòng)桿菌是條件致病菌，在自然界分布廣泛，正常人體口腔黏膜、呼吸道、消化道、泌尿生殖道及醫(yī)院環(huán)境中均可檢測(cè)到鮑曼不動(dòng)桿菌的存在，在機(jī)體抵抗力下降、免疫力缺損及抗生素的選擇壓力下，鮑曼不動(dòng)桿菌極易優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)，成為致病菌。隨著人口老齡化、廣譜抗生素的廣泛使用，鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性逐年增加，近年來(lái)CRAB在院內(nèi)感染的分離率也越來(lái)越高，并可引起局部大流行[7-8]，使患者的病情更為復(fù)雜難治，住院費(fèi)用大大增加，病死率高。因此，對(duì)CRAB醫(yī)院感染危險(xiǎn)因素、耐藥機(jī)制的探討，對(duì)早期防治具有重要的臨床意義。

本研究顯示，鮑曼不動(dòng)桿菌醫(yī)院感染的部位以呼吸道感染（73.6%）最多見，其次為血流感染（11.6%），與文獻(xiàn)報(bào)道相似[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，寧波地區(qū)3家醫(yī)院CRAB醫(yī)院感染危險(xiǎn)因素主要包括病情危重、人工氣道、霧化吸入、機(jī)械通氣、免疫抑制劑的使用、抗生素使用種類和天數(shù)、是否曾經(jīng)入住ICU以及侵入性操作，與國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)類似研究結(jié)論基本相同[10-12]。而通過(guò)logistic多因素分析發(fā)現(xiàn)，病情危重（OR：8.47，95%CI：1.56～46.0）、入住ICU時(shí)間（OR：9.32，95%CI：1.83～47.43）、住院時(shí)間≥14d（OR：13.89，95%CI：3.07～62.85）、機(jī)械通氣/人工氣道（OR：18.86，95%CI：4.38～81.31）、抗生素使用種類≥3種（OR：6.16，95%CI：1.85～20.51）、抗生素使用時(shí)間≥7d（OR：5.41，95%CI：1.36～21.58）是CRAB醫(yī)院感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

鮑曼不動(dòng)桿菌易于在自身免疫力減退患者體表及醫(yī)療設(shè)備上定植生長(zhǎng)，而基礎(chǔ)疾病多，危重病患者以及長(zhǎng)期大量使用免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素均會(huì)致機(jī)體免疫力低下，增加了CRAB感染的風(fēng)險(xiǎn)。CRAB醫(yī)院感染與長(zhǎng)期、大量使用多種強(qiáng)效廣譜抗生素有關(guān)。大劑量長(zhǎng)時(shí)間使用多種廣譜抗生素抑制了正常菌群生長(zhǎng)，導(dǎo)致機(jī)體菌群失調(diào)，鮑曼不動(dòng)桿菌等條件致病菌在抗生素的選擇壓力下出現(xiàn)耐藥，耐藥菌株優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致患者出現(xiàn)難以控制的嚴(yán)重感染。因此，抗生素的不合理使用可導(dǎo)致CRAB醫(yī)院感染風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，國(guó)外有研究顯示抗生素的不適當(dāng)使用是CRAB感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，人工氣道/機(jī)械通氣是導(dǎo)致CRAB院內(nèi)感染風(fēng)險(xiǎn)最高的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（OR=18.86），主要因?yàn)槿斯獾兰皺C(jī)械通氣導(dǎo)致氣道黏膜受損，破壞了氣道的正常防御功能，寄居于口咽部或外源性的CRAB可以直接進(jìn)入下呼吸道而引起感感染，且入住ICU的患者多病情危重，而ICU環(huán)境中CRAB或泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌甚至全耐藥鮑曼不動(dòng)菌均較普通病房發(fā)生率顯著升高[15]，使環(huán)境中CRAB或其它高耐藥細(xì)菌進(jìn)入下呼吸道繁殖生長(zhǎng)的風(fēng)險(xiǎn)顯著升高。有資料顯示霧化吸入也為CRAB院內(nèi)感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[16]，但本研究并未發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果，可能因?yàn)楸镜貐^(qū)醫(yī)院霧化裝置均已專人專用，而不是在不同患者之間交替使用，減少了耐藥菌在不同患者之間相互傳播的風(fēng)險(xiǎn)性。

本研究也檢測(cè)了入選菌株中Ⅰ類整合子的分布情況，以探討整合子在鮑曼不動(dòng)桿菌亞胺培南耐藥中的作用。整合子系統(tǒng)是一種天然的克隆和表達(dá)系統(tǒng)，能高效率促進(jìn)細(xì)菌間抗生素耐藥基因的擴(kuò)散，目前將已發(fā)現(xiàn)的整合子分為6類，其中Ⅰ類整合子最為常見，目前已在不動(dòng)桿菌中發(fā)現(xiàn)整合子結(jié)構(gòu)，并推測(cè)可能是導(dǎo)致不動(dòng)桿菌多重耐藥的重要機(jī)制。

本研究對(duì)所入選菌株均進(jìn)行了Ⅰ類整合酶的測(cè)定，以對(duì)比CRAB組和CSAB組Ⅰ類整合子攜帶率是否存在差別。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，54株CRAB組鮑曼不動(dòng)桿菌Ⅰ類整合酶基因擴(kuò)增陽(yáng)性，陽(yáng)性率為59.3%，對(duì)照組陽(yáng)性率34.6%，CRAB組Ⅰ類整合子陽(yáng)性率明顯高于CSAB組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；這也意味著CRAB組菌株存在著更加廣泛的耐藥譜，這與β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、磺胺類藥物耐藥基因是整合子中最常見的插入基因盒有關(guān)，也說(shuō)明了整合子對(duì)細(xì)菌多重耐藥起著重要作用。本地區(qū)鮑曼不動(dòng)桿菌Ⅰ類整合子檢出率較國(guó)內(nèi)其它地區(qū)增高，上海應(yīng)春妹等[17]檢測(cè)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌Ⅰ類整合子攜帶率63%，顧兵等[18]檢測(cè)南京地區(qū)鮑曼不動(dòng)桿菌整合子檢出率為52.8%，PCR-RFLP結(jié)果顯示均為I類整合子，原因可能與研究的時(shí)期、碳青酶烯類藥物應(yīng)用的普及率差異等因素有關(guān)[19]。

本研究分析了寧波地區(qū)3家醫(yī)院CRAB院內(nèi)感染的危險(xiǎn)因素，并對(duì)CRAB中Ⅰ類整合子做了初步的研究。結(jié)果表明，病情危重、入住ICU時(shí)間、住院時(shí)間、機(jī)械通氣/人工氣道、抗生素使用種類≥3種、抗生素使用時(shí)間≥7d是CRAB醫(yī)院感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。CRAB中Ⅰ類整合子檢出率明顯升高，意味著CRAB常同時(shí)攜帶有編碼對(duì)氨基糖甙類、氯霉素、甲氧芐氨嘧啶耐藥的其它耐藥基因，易產(chǎn)生多重耐藥菌、泛耐藥細(xì)菌甚至全耐藥菌，目前國(guó)際上還未出現(xiàn)治療該類細(xì)菌的有效藥物，因此加強(qiáng)對(duì)危險(xiǎn)因素的控制，提高CRAB的早期檢測(cè)技術(shù)并深入研究臨床菌株中CRAB耐藥的產(chǎn)生和傳播機(jī)制具有重要意義。

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ObjectiveTo investigate the risk factors for nosocomial infections caused by carbapenem-resistant Acinetobacter Baumanii(CRAB)．MethodsFifty-four patients with nosocomial infection by CRAB(cases)and 162 matched patients with nosocomial infection by carbapenem-susceptible Acinetobacter Baumanii(CSAB)as controls admitted in hospital from January 2012 to December 2012 were included in the study．Univariate analysis and multivariate logistic regression were used to analyze the risk factors for nosocomial infection by CSAB．ClassⅠintegron was detected by PCR．ResultsUnivariate analysis revealed that the risk factors for nosocomial infection by CRAB were pathogenetic condition,ICU stay,hospitalization≥14d,mechanical ventilation/artificial airway,urinary catheter,central venous catheter,administration of immunosuppressive agents,treatment with≥3 kinds of antibiotics and≥7d．Multivariate logistic regression analysis identified six independent risk factors:pathogenetic condition(OR 8．47;95%CI 1．56～46．0),ICU stay(OR 9．32;95%CI 1．83～47．43),hospitalization≥14d(OR 13．89;95%CI 3．07～62．85),mechanical ventilation/artificial airway(OR 18．86;95%CI4．38～81．31),treatment with≥3 kinds of antibiotics(OR 6．16;95%CI 1．85～20．51)and≥7d (OR 5．41;95%CI 1．36～21．58)．Detection rate of classⅠintegron among CRAB was significantly higher than that in CSAB(59．3% vs 34．6%,P＜0．001)．ConclusionPathogenetic condition,ICU stay,hospitalization≥14d,mechanical ventilation/artificial airway, treatment with more than 3 kinds of antibiotics,using antibiotics≥7d are likely to be risk factors for nosocomial infection by CRAB, and ClassⅠintegronare common in the CRAB．

Carbapenem-resistant acinetobacter baumaniiNosocomial infection Risk factors ClassⅠintegron

2014-08-27）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

315000 寧波市第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（葉繼輝）；寧波市第九醫(yī)院微生物實(shí)驗(yàn)室（李超芬）；寧波大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科（丁群力）

葉繼輝，E-mail：yjh-icu@qq.com