潘鋼 徐驍誠 張煜 彭友 張臥 丁金旺 羅定存

多梳基因Bmi-1在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及意義

潘鋼 徐驍誠 張煜 彭友 張臥 丁金旺 羅定存

目的 研究多梳基因Bmi-1在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達及臨床意義。方法分別采用免疫組化法、Western blot法和RT-PCR法檢測30例甲狀腺乳頭狀癌組織、30例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織及30例正常甲狀腺組織中多梳基因Bmi-1及其mRNA的表達情況，并分析Bmi-1與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征的關系。結(jié)果免疫組化法檢測發(fā)現(xiàn)Bmi-1在甲狀腺乳頭狀癌組織中陽性表達率73．3%，與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫（36．7%）及與正常組織（16．7%）的陽性表達率相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。Western blot法檢測甲狀腺乳頭狀癌中Bmi-1表達量與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織及正常組織相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。RT-PCR法檢測甲狀腺乳頭狀癌中Bmi-1mRNA表達量與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織及正常組織相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。Bmi-1陽性表達在甲狀腺乳頭狀癌有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），在年齡、性別、腫瘤大小、分期等差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)論Bmi-1在甲狀腺乳頭狀癌中表達升高，可能在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，并可望作為甲狀腺乳頭狀癌臨床診斷的標記物之一。

Bmi-1 甲狀腺乳頭狀癌 RT-PCR Western blot免疫組化法

近年來，甲狀腺結(jié)節(jié)的發(fā)生率呈明顯上升趨勢，其中5%～15%的甲狀腺結(jié)節(jié)為惡性腫瘤[1]。甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常見的甲狀腺惡性腫瘤，其好發(fā)于女性和青少年，多起病隱匿，早期診斷困難。臨床上亟需尋找新的方法幫助篩查及早期診斷PTC，以進一步提高PTC的診治水平。Bmi-1基因（B cell-specific MLV inte-gration site-1，Bmi-1）為多梳基因（polycomb group genes，PcG）家族成員之一，它首次被提出是1991年在轉(zhuǎn)基因鼠的淋巴瘤細胞傳代中，作為一種原癌基因與另一種癌基因c-myc協(xié)同作用引起細胞轉(zhuǎn)化和腫瘤形成[2]，目前Bmi-1在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲及判斷預后等方面的作用已越來越引起大家的重視。筆者采用免疫組化法、Western blot和RTPCR技術(shù)，檢測PTC組織中Bmi-1及其mRNA表達水平，以及與PTC臨床病理特征的關系，進而探討其是否能成為PTC早期診斷及判斷預后的重要分子標記物，現(xiàn)報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2012年8月至2013年2月在我科手術(shù)、并有完整臨床資料的甲狀腺乳頭狀癌組織30例、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織30例及正常甲狀腺組織30例，正常甲狀腺組織來自單側(cè)甲狀腺乳頭狀癌行甲狀腺雙側(cè)葉切除的健側(cè)組織。所有患者在接受手術(shù)獲取標本前未接受過碘131等治療，病理結(jié)果均由病理科醫(yī)師診斷。甲狀腺正常組織、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織和乳頭狀癌組織在術(shù)中離體后馬上收集放入液氮速凍過夜，然后移至-80℃冰箱保存直至使用。在30例甲狀腺乳頭狀癌中，男12例，女18例，年齡＜45歲13例，≥45歲17例；根據(jù)（AJCC/UICC）對分化型甲狀腺癌進行臨床分期，Ⅰ～Ⅱ期18例（60.00%），Ⅲ～Ⅳ期12例（40.00%）；術(shù)后病理結(jié)果顯示有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例（63.33%），未見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例（36.67%）。

1.2 主要試劑 RT-PCR試劑盒購于Takara生物制劑公司，總RNA提取試劑Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，Bmi-1、GAPDH引物均由上海生工公司合成，Anti-Bmi-1一抗購自英國Abcam公司，Anti-GAPDH一抗購自美國Santa公司。

1.3 免疫組織化學法檢測Bmi-1表達 常規(guī)石蠟包埋組織，切片脫蠟，水化，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，抗原修復后，滴加兔抗人Bmi-1單克隆抗體（1∶200）及二抗（酶標記抗兔IgG）后37℃孵育2h。DAB顯色，蘇木素復染，脫水，封片，同時以PBS替代一抗（兔抗人Bmi-1單克隆抗體）作為陰性對照。陽性結(jié)果為細胞核或細胞質(zhì)染成棕黃色。隨機取5個不同的200倍視野，計數(shù)細胞總數(shù)以及細胞核和細胞質(zhì)陽性細胞數(shù)。按陽性細胞占細胞總數(shù)的百分比計分：陽性細胞率≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；根據(jù)染色的強弱程度計分：陰性染色1分，弱染色2分，中等強度染色3分，強染色4分。根據(jù)兩者的乘積判斷結(jié)果：≤4分為陰性；＞4分且≤8分為弱陽性；＞8分且≤12分為陽性；＞12分且≤16分為強陽性。統(tǒng)計分析時陰性和弱陽性合計為低表達，陽性和強陽性合計為高表達。以上結(jié)果均至少由2位病理科醫(yī)師以盲法觀察確定。

1.4 Western blot法檢測Bmi-1表達 分別提取甲狀腺乳頭狀癌組織、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織、正常甲狀腺組織的總蛋白，應用BCA法測定蛋白濃度。上樣量均為50μg/孔，行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后，兔抗人Bmi-1單

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，不同組織中Bmi-1 mRNA表達水平RTPCR及免疫組織化學檢測結(jié)果比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，Western blot檢測結(jié)果經(jīng)正態(tài)性檢測后采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗。不同臨床病理因素與Bmi-1在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測不同甲狀腺組織中Bmi-1的表達情況 免疫組化檢測正常甲狀腺組織、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織、甲狀腺乳頭狀癌組織中Bmi-1在細胞核內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色或者棕褐色顆粒，也有少量為細胞質(zhì)內(nèi)呈棕黃色（圖1）。甲狀腺乳頭狀癌組織中Bmi-1陽性表達率73.3%（22例），與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織陽性表達率36.7%（11例）及與正常甲狀腺組織陽性表達率16.7%（5例）的比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組及正常組中Bmi-1陽性表達率的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 Western blot檢測不同甲狀腺組織中Bmi-1的表達情況 Western blot檢測結(jié)果顯示甲狀腺正常組織、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織、甲狀腺乳頭狀癌組織中Bmi-1的相對表達量分別為0.26±0.23、0.98±0.33、1.43±0.46，克隆抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜，HRP標記的二抗（辣根標記抗兔IgG）室溫孵育2h后使用ECL試劑發(fā)光，顯影、定影，膠片掃描后應用Westem blot圖像分析軟件，以測定的Bmi-1蛋白條帶的積分光密度與內(nèi)參蛋白條帶的光密度的比值表示組織內(nèi)目的蛋白的相對表達量。每個樣品設2個復孔，取平均值以減小誤差。

1.5 RT-PCR法檢測Bmi-1表達 按照Trizol試劑盒說明書提取組織總RNA，測定RNA濃度后各取5μgRNA進行逆轉(zhuǎn)錄。PCR反應條件：[95℃×5s+60℃×30s]× 40個循環(huán)。反應體系為20μl，獲得相應的cDNA。然后進行RT-PCR，反應體系：2×SYBR Premix TaqTM10μl，Rox reference Dye I 0.4μl，F(xiàn)orward primer 0.4μl，Reverse primer 0.4μl，dH2O 6.8μl，cDNA 2μl。Bmi-1引物序列為5′-ATTAGTTCCAGGGCTTTTCA-3′和5′-TCATTCACCTCCTCCTTAGATT-3′；GAPDH為內(nèi)參，引物序列為5′-GACAGTCAGCCGCATCTTCT-3′和5′-TTAAAAGCAGCCCTGGTGAC-3′。反應條件：[95℃×5s+60℃× 30s]×40個循環(huán)。對所用標本進行上述RT-PCR反應，GAPDH作為內(nèi)參，根據(jù)2-ΔCT計算Bmi-1相對表達量。與甲狀腺正常組織及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組相比，甲狀腺乳頭狀癌組織中Bmi-1表達水平明顯升高，且甲狀腺結(jié)節(jié)組織中的Bmi-1水平也明顯高于正常組織中的水平，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）（圖2）。

圖1 不同甲狀腺組織中Bmi-1的表達情況（N:正常甲狀腺組織；NG：結(jié)節(jié)性甲狀腺腫；C：甲狀腺乳頭狀癌；SP染色，×200）

圖2 不同甲狀腺組織中Bmi-1表達情況（N：正常甲狀腺；NG：結(jié)節(jié)性甲狀腺腫；C：甲狀腺乳頭狀癌）

2.3 RT-PCR法檢測不同甲狀腺組織中Bmi-1mRNA的表達情況 RT-PCR法檢測發(fā)現(xiàn)在甲狀腺乳頭狀癌組、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組和正常甲狀腺組中的表達量分別為5.836±0.498、3.236±0.301和1.521±0.211，甲狀腺乳頭狀癌組高于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組和正常甲狀腺組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），詳見圖3。

圖3 不同甲狀腺組織中Bmi-1 mRNA的表達情況（N：正常甲狀腺；NG：結(jié)節(jié)性甲狀腺腫；C：甲狀腺乳頭狀癌）

2.4 Bmi-1表達與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理參數(shù)的關系 在I～II期和Ⅲ～Ⅳ期中Bmi-1陽性率分別為55.6%（10/18）和66.7%（8/12），Bmi-1的表達與腫瘤臨床分期的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；在男性和女性患者中Bmi-1陽性率分別為41.7%（5/12）和44.4%（8/18），差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；在＜45歲和≥45歲患者中Bmi-1陽性率分別為46.2%（6/13）和58.8%（10/17），差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明Bmi-1的表達與男女性別及年齡均無關。在22例Bmi-1陽性表達的甲狀腺乳頭狀癌患者中，術(shù)后病理證明有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有81.8%（18/22），而術(shù)后病理未發(fā)現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有18.2%（4/22），經(jīng)Fisher確切概率法統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，Bmi-1的陽性表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討論

近年來，全球甲狀腺癌的發(fā)病率增長迅速，引起了社會的廣泛關注。美國最新資料顯示，1989-2012年甲狀腺癌的發(fā)病率上升了5倍，其中男性以每年5.5%、女性以每年6.6%的速度持續(xù)增長，現(xiàn)已成為美國增長速度最快的惡性腫瘤[3]。我國2012年衛(wèi)生部報告也指出“甲狀腺癌已成為中國女性第3位的常見惡性腫瘤，尤其在沿海地區(qū)更為高發(fā)”。2013年浙江省杭州市疾控中心公布的最新“癌譜”指出，甲狀腺癌已位居該市居民惡性腫瘤第2位，對女性而言則是首次超過乳腺癌躍居發(fā)病首位的惡性腫瘤。由此可見，甲狀腺癌不僅威脅著人們的健康，而且極大增加了政府、社會和家庭的負擔，因此如何獲取積極有效的甲狀腺癌早期診斷及判斷預后的標志物是目前研究的熱點。

Bmi-1是多梳基因PcG家族成員之一，在多種人類多種惡性腫瘤如肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、結(jié)腸癌及泌尿系腫瘤中的表達普遍上調(diào)[4-11]。Bmi-1可以通過調(diào)控INK4a-ARF、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）和HOX基因家族等下游基因，啟動DNA復制相關基因的轉(zhuǎn)錄，推動細胞周期進入S期，從而促進細胞的生長和增殖；并且在染色體末端合成端粒重復片段，以補償細胞分裂時的端?？s短，維持端粒長度，使細胞獲得無限增殖能力而逃避衰亡，從而在細胞的惡性轉(zhuǎn)化中起重要作用。目前Bmi-1在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲及判斷預后等方面的作用已越來越引起大家的重視[12-13]。有研究顯示，Bmi-1在甲狀腺髓樣癌中也有高表達，對診斷甲狀腺髓樣癌有指導意義[14]。而PTC是最常見的甲狀腺癌組織學亞型，近20年甲狀腺癌發(fā)病率不斷飆升[15]，因此針對PTC的相關研究日益成為腫瘤學界關注的焦點。

本研究發(fā)現(xiàn)Bmi-1在PTC組織中存在高表達，而在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫和正常甲狀腺組織中低表達或基本不表達（P＜0.05）。Bmi-1高表達率與PTC患者年齡、腫瘤分期、性別無關（P＞0.05），而與有無頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關，即Bmi-1在伴有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC患者中的陽性表達明顯高于頸淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移者（P＜0.05），提示Bmi-1可能在PTC的轉(zhuǎn)移機制中起重要作用。已知腫瘤的轉(zhuǎn)移機制之一是腫瘤細胞突破細胞外基質(zhì)，其中整合素是比較重要的細胞外基質(zhì)之一。甲狀腺癌可隨著Bmi-1的表達逐漸釋放整合素受體，再通過與整合素結(jié)合增強細胞外基質(zhì)與癌細胞的粘連，使腫瘤突破細胞基底膜，成淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，這與整合素受體的生成有密切關系[16]，Bmi-1也可以通過誘導癌細胞中端粒酶的活性促進其擴增，與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移密切相關[17]。此外，Bmi-1作為c-myc癌基因的協(xié)同基因，在細胞的中心體擴增調(diào)節(jié)中起著重要作用，異常的中心體可以導致染色體的異常分裂，干擾細胞正常活動而發(fā)生癌變。由此可見，Bmi-1高表達與PTC的發(fā)生、發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移密切相關。雖然PTC的生物學行為相對惰性，預后較好，但據(jù)統(tǒng)計仍有30%～80%的PTC患者在確診時就伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，即便是甲狀腺微小乳頭狀癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率也可高達47.6%[18-19]，且頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是判斷PTC預后的重要因素，有一些研究已經(jīng)證實區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移會增加PTC復發(fā)轉(zhuǎn)移的概率，并且可能會增加病死率[20-23]。Nam等[24]和Takada等[25]研究認為，頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是腫瘤復發(fā)的顯著影響因素，完整切除原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)是降低局部復發(fā)率和避免再次手術(shù)的關鍵。因此，如何進行淋巴結(jié)清掃對降低PTC局部復發(fā)率和病死率均具有重要意義。本研究證實Bmi-1在PTC中高表達，且與PTC頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關，故其可能成為PTC早期診斷及判斷預后的候選分子標志物。由于Bmi-1的檢測有助于判斷PTC患者的預后，使臨床上在術(shù)前判斷甲狀腺癌的生物學行為成為可能，對于Bmi-1高表達的患者，由于其易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，在結(jié)合影像學檢查的基礎上，可選擇更積極的頸淋巴結(jié)清掃手術(shù)治療，手術(shù)后更需注意其高復發(fā)風險。

惡性腫瘤的發(fā)展是一個多階段、多步驟、多因素參與的過程，隨著醫(yī)學的進一步發(fā)展，甲狀腺癌的診斷方法雖較多，但早期診斷及侵襲轉(zhuǎn)移性的判斷在臨床尤為重要，以便客觀判斷患者的預后。本研究提示Bmi-1可能在PTC轉(zhuǎn)移中起重要作用，在鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)良、惡性以及判斷PTC侵襲性特征，尤其是頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中也體現(xiàn)出較好的價值，并有可能使之成為一個新的早期診斷和判斷PTC預后的重要分子標記物，并為進一步探討其可能的細胞內(nèi)信號分子傳導途徑及提供新的基因治療靶點打下基礎。

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ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of Bmi-1 in papillary thyroid carcinoma．MethodsThe expression of Bmi-1 mRNA and protein was detected by RT-PCR,Western blot and immunohistochemistry in 30 samples of papillary thyroid carcinomas,30 samples of nodular goiters and 30 samples of normal thyroid tissue,respectively．The correlation of Bmi-1 expression with clinicopathological features of patients was also analyzed．ResultsThe results of immunohistochemistry showed that the positive rates of Bmi-1 protein in papillary thyroid carcinomas，nodular goiters，normal thyroid tissues were 73．3%,36．7%and 16．7%,respectively(P＜0．05)．Western blot showed that the expression of Bmi-1 protein in papillary thyroid carcinomas was significantly higher than those in nodular goiter tissue and normal tissue(P＜0．05)．The expression of Bmi-1mRNA in papillary thyroid carcinomas was significantly higher than those in nodular goiters and normal thyroid tissues (P＜0．05)．Bmi-1 expression was closely relevant to lymph node metastasis(P＜0．05),but not to gender,age and differentiation degree．ConclusionThe expression of Bmi-1 gene is up-regulated in papillary thyroid carcinomas,indicating that Bmi-1 may be involved in the development of papillary thyroid carcinoma and may serve as a marker for clinical diagnosis．

Bmi-1 Papillary thyroid carcinoma RT-PCR Western blotImmunohistochemistry

2014-11-12）

（本文編輯：嚴瑋雯）

杭州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（2012A008）；杭州市重大科技創(chuàng)新專項項目（20131813A08）

310003 杭州市第一人民醫(yī)院腫瘤外科

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