周　曦　陳忠東　何　璐　(南華大學(xué)附一醫(yī)院婦產(chǎn)科，衡陽421001)

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抑制URG4表達(dá)對(duì)宮頸癌小鼠的治療作用及機(jī)制

周曦陳忠東何璐(南華大學(xué)附一醫(yī)院婦產(chǎn)科，衡陽421001)

［摘要］目的:分析上調(diào)基因-4(URG4)在宮頸癌中的表達(dá)，并觀察分析抑制URG4對(duì)宮頸癌的治療作用及機(jī)制。方法: Western blot法分析URG4在宮頸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)差異。選擇16只雄性BALB/c裸鼠，喂養(yǎng)至6周齡后隨機(jī)分為對(duì)照組(Control組)及觀察組(Observation組)，每組各8只。Control組小鼠于右側(cè)背部皮下接種宮頸癌細(xì)胞(SiHa cells)。Observation組小鼠背部皮下接種URG4-siRNA轉(zhuǎn)染的宮頸癌細(xì)胞(URG4-siRNA SiHa cells)。干預(yù)后4周處死小鼠，分析對(duì)比小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況及Wnt/β-catenin信號(hào)通路的改變。結(jié)果: URG4在人宮頸癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，顯著高于癌旁組織(P＜0.05)。干預(yù)結(jié)束后，觀察組小鼠腫瘤組織內(nèi)URG4表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P＜0.05) ;體重明顯高于對(duì)照組(P＜0.05) ;腫瘤組織重量顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。觀察組小鼠腫瘤組織內(nèi)Ki67表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。觀察組小鼠腫瘤組織內(nèi)CyclinD1、β-catenin及C-myc的表達(dá)均顯著低于對(duì)照組，相比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論: URG4在人宮頸癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，抑制URG4的表達(dá)可能通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。

［關(guān)鍵詞］宮頸癌;上調(diào)基因-4; Wnt/β-catenin信號(hào)通路

Analyze curative effect of suppression expression of URG4 on cervical cancer mice and possible mechanisms

ZHOU Xi，CHEN Zhong-Dong，HE Lu.Department of Gynaecology and Obstetrics，the First Affiliated Hospital of South China University，Hengyang 421001，China

［Abstract］Objective: To analyze the curative effect of suppression expression of URG4 on cervical cancer mice and the possible mechanisms.Methods: The expression of URG4 were analyzed in cervical cancer tissues and para-carcinoma tissues.16 male BALB/c nude mice were divided into Group A (inoculated with URG4-siRNA SiHa cells) and Group B (inoculated with SiHa cells)．After 4 weeks，mice were executed and analyzed.Results: The expression of URG4 were higher in human cervical cancer tissues than that in para-carcinoma tissues (P＜0.05) .After experiment，Group A had a lower tumor weight，but a higher body weight than these of Group B，the difference was statistically significant (P＜0.05) .Group A mice had a lower levels of URG4 in tumor than that of Group B mice (P＜0.05) .Group A mice had a lower levels of Ki67 in tumor than that of Group B mice，the difference was statistically significant (P＜0.05) .Group A mice had lower levels of CyclinD1，β-catenin and C-myc in tumor than these of Group B mice (P＜0.05)．Conclusion: The expression of URG4 in cervical cancer tissue is up-regulation.Suppression expression of URG4 can suppress tumor growth in vivo，which may though suppress the Wnt/β-catenin signaling pathway.

［Key words］Cervical cancer; Upregulated gene 4; Wnt/β-catenin signaling pathway

宮頸癌(Cervical cancer)是臨床常見的婦科腫瘤，其發(fā)病率呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，且具有年輕化傾向［1］。宮頸癌主要的病理類型為宮頸鱗癌，呈現(xiàn)為浸潤(rùn)性生長(zhǎng)?；颊咴缙谌狈μ禺愋缘呐R床表現(xiàn)，可僅表現(xiàn)為陰道接觸性出血或陰道排出血性、膿性分泌物。雖然以手術(shù)為主的綜合治療大大降低了該病的死亡率，但仍然有相當(dāng)患者由于延誤診斷或治療而預(yù)后不良。迄今為止宮頸癌的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前認(rèn)為與遺傳、環(huán)境污染、病毒感染及不健康的性生活有關(guān)［2］。上調(diào)基因-4(Upregulated gene 4，URG4)位于人染色體7p13，是新近發(fā)現(xiàn)的促癌相關(guān)基因。URG4被證實(shí)在胃癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤及淋巴細(xì)胞白血病等惡性腫瘤中表達(dá)升高，且與預(yù)后密切相關(guān)［3-5］。目前URG4與宮頸癌的關(guān)系尚無充分研究。本文嘗試分析URG4在人宮頸癌組織中的表達(dá)，并建立宮頸癌動(dòng)物模型，觀察抑制URG4表達(dá)對(duì)宮頸癌是否有治療作用。

1　材料與方法

1.1臨床標(biāo)本收集及檢測(cè)收集2014年1月至2015年1月我院收治的10例宮頸癌患者的手術(shù)標(biāo)本。共納入10例患者，均經(jīng)手術(shù)病理確診為宮頸鱗癌，平均年齡(49±3.9)歲。采集標(biāo)本包括癌組織及癌旁組織(正常宮頸組織)，分別凍存(－80℃)。采用Western blot法分別檢測(cè)宮頸癌組織(Cervical cancer)及癌旁組織(Para-carcinoma)內(nèi)URG4的表達(dá)。

1.2建立宮頸癌動(dòng)物模型及干預(yù)選擇16只4周齡雄性BALB/c背景的裸鼠，均飼養(yǎng)在無特定病原菌級(jí)(Specific pathogen Free，SPF)環(huán)境中。保持飼養(yǎng)環(huán)境中每日12 h光照，維持室溫在20℃～24℃;避免強(qiáng)噪音及光線刺激;小鼠自由飲水，普通飼料喂養(yǎng)。待小鼠喂養(yǎng)至6周齡后隨機(jī)分為對(duì)照組(Control組)及觀察組(Observation組)，每組各8只。

兩組小鼠分別接受如下4周干預(yù): Control組小鼠于右側(cè)背部皮下接種宮頸癌細(xì)胞(SiHa cells; 1× 107，0.2 ml; Ambion公司，USA) ; Observation組小鼠背部皮下接種URG4-siRNA轉(zhuǎn)染的宮頸癌細(xì)胞(URG4-siRNA SiHa cells; 1×107，0.2 ml)。URG4-siRNA SiHa cells由Ambion公司(USA)提供，URG4-siRNA轉(zhuǎn)染SiHa cells采用慢病毒載體，轉(zhuǎn)染效率75%，URG4-siRNA序列為: Sense: 5'-gatccgtagaccactcacatgtcctttcaagagaaggacatgtgagtggtctattttttggaaa-3'，Anti-sense: 5'-agcttttccaaaaaata-gaccactcacatgtccttctcttgaaaggacatgtgagtggtctacg-3'。細(xì)胞培養(yǎng)5代后開始用于實(shí)驗(yàn)。

1.3觀察指標(biāo)及檢測(cè)干預(yù)周期內(nèi)，每周稱量小鼠體重并記錄; 4周后處死小鼠，剝離背部腫瘤組織保存(福爾馬林固定、－80℃凍存)，行如下檢測(cè):采用Western blot法及免疫組化法檢測(cè)腫瘤組織內(nèi)URG4及細(xì)胞增殖抗原標(biāo)記物(Ki67)的表達(dá);采用Western blot法檢測(cè)腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞周期蛋白(CyclinD1)、β-鏈蛋白(β-catenin)及原癌基因(C-myc)的表達(dá)。所有抗體均訂購(gòu)于Abcam公司(Britain)。

Western blot方法簡(jiǎn)述為:研磨并提取組織蛋白，使用Bradford法行蛋白定量，然后在沸水中加熱10 min，吸取35 μg蛋白加入孔，后電泳、轉(zhuǎn)膜，封閉1小時(shí)后加入U(xiǎn)RG4、CyclinD1、C-myc、β-catenin、Ki67及β-actin(1∶800稀釋，鼠源性單抗，Abcam公司)一抗稀釋液，4℃下?lián)u床12 h，加入二抗后洗膜，滴加ECL顯影液，行灰度值分析(Image J軟件; USA)。免疫組化方法簡(jiǎn)述:常規(guī)石蠟切片(4微米)，60℃烤片約8 h，行抗原修復(fù)后滴加一抗(分別為URG4、Ki67; 1∶50稀釋，鼠源性單抗，Abcam公司)，室溫下孵育60 min后滴加二抗(羊抗兔IgG， Santa cruz，USA)，室溫孵育10 min后采用PBS沖洗3次，滴加DAB顯色劑，蘇木素復(fù)染，封片。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)分析基于SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。連續(xù)性變量以x ±s表示，比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05定義為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2　結(jié)果

2.1 URG4在宮頸癌組織中的表達(dá)如圖1所示，Western blot半定量分析顯示URG4在人宮頸癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，顯著高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2比較兩組小鼠腫瘤組織內(nèi)URG4的表達(dá)差異

如圖2A所示，免疫組化染色證實(shí):觀察組小鼠腫瘤組織內(nèi)URG4表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，相比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Western blot分析進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果(圖2B)。

2.3抑制URG4表達(dá)對(duì)宮頸癌小鼠體重及腫瘤生長(zhǎng)的影響圖3A所示，實(shí)驗(yàn)第3、4周，觀察組小鼠體重明顯高于對(duì)照組，相比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。如圖3B，觀察組小鼠腫瘤組織重量顯著低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.4抑制URG4表達(dá)對(duì)宮頸癌小鼠腫瘤內(nèi)Ki67表達(dá)的影響如圖4A所示，免疫組化分析顯示:觀察組小鼠腫瘤組織內(nèi)Ki67表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Western blot分析進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果(圖4B)。

Note: * .P＜0.05.

2.5抑制URG4對(duì)小鼠腫瘤組織內(nèi)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響Western blot分析顯示(圖5)，觀察組小鼠腫瘤組織內(nèi)CyclinD1、β-catenin及C-myc的表達(dá)均顯著低于對(duì)照組，相比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

Note: A.Immunohistochemical analysis show the expression of URG4 (Brown) in the two groups; B.The comparison of URG4 expression between the two group mice.

Note: A.Immunohistochemical analysis show the expression of Ki67 (Brown) in the two groups; B.The comparison of Ki67 expression between the two group mice.

圖3　兩組小鼠體重及腫瘤重量的比較Fig．3 Comparison of weight and tumor size between two groups

Note: The comparison of Cyclin D1，β-catenin，C-myc expression between two group，* .P＜0.05.

3　討論

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅患者生命健康。盡管近幾十年腫瘤學(xué)科有了長(zhǎng)足的發(fā)展與進(jìn)步，但仍然未能全面揭示其發(fā)病機(jī)制。目前認(rèn)為其是遺傳易感個(gè)體在環(huán)境因素作用下發(fā)病。URG4的基因位于人體第7號(hào)染色體，能夠編碼超過900余種氨基酸。URG4具有多種生物學(xué)功能，其可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移。目前發(fā)現(xiàn)URG4在多種惡性腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，包括子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌等［6-8］，說明其與生殖系統(tǒng)腫瘤的發(fā)展與發(fā)展密切相關(guān)。目前URG4在宮頸癌發(fā)生與發(fā)展過程中的作用尚不十分明確。本文嘗試首先分析宮頸癌腫瘤組織內(nèi)URG4的表達(dá)是否有改變。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步建立宮頸癌動(dòng)物模型，分析抑制URG4是否可以抑制腫瘤生長(zhǎng)，并分析可能的機(jī)制。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，URG4在宮頸癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，顯著高于癌旁組織，這提示URG4可能與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)。為了明確URG4對(duì)宮頸癌的發(fā)展是否有關(guān)，我們建立了宮頸癌小鼠模型。我們采用免疫組化及Western blot兩種方法均證實(shí)接種URG4-siRNA轉(zhuǎn)染的宮頸癌細(xì)胞的小鼠(觀察組)，其腫瘤組織內(nèi)URG4的表達(dá)顯著低于對(duì)照組。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)觀察組小鼠腫瘤重量顯著低于對(duì)照組，但平均體重顯著高于對(duì)照組。這提示抑制URG4表達(dá)顯著抑制了腫瘤生長(zhǎng)，并同時(shí)改善了小鼠全身狀況。我們進(jìn)一步分析了兩組小鼠腫瘤組織內(nèi)Ki67的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)觀察組小鼠腫瘤組織內(nèi)Ki67表達(dá)顯著低于對(duì)照組。Ki67是一種由MKI-67基因編碼的核蛋白質(zhì)，主要表達(dá)于增生活躍的細(xì)胞中，是常用的細(xì)胞增殖標(biāo)記物［9，10］。這提示抑制URG4表達(dá)，顯著抑制了腫瘤細(xì)胞增殖，發(fā)揮了抗腫瘤的作用。為了明確抑制URG4而達(dá)到抗腫瘤的機(jī)制，我們進(jìn)一步分析了小鼠腫瘤組織內(nèi)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的改變。我們發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白(CyclinD1、β-catenin及C-myc)在觀察組小鼠腫瘤組織內(nèi)表達(dá)均顯著低于對(duì)照組。CyclinD1是一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)具有嚴(yán)格的細(xì)胞周期順序性，主要表達(dá)于細(xì)胞周期的G1期與S期。CyclinD1的過度表達(dá)與多種人類原發(fā)惡性腫瘤相關(guān)，也是腫瘤診斷與預(yù)后判斷的重要指標(biāo)［11］。C-myc與多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)，是促使細(xì)胞無限增殖惡性化的主要調(diào)節(jié)基因［12］。β-catenin是Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵調(diào)控因子，其在多種腫瘤組織呈現(xiàn)高表達(dá)，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖［13，14］。此外，βcatenin還可上調(diào)C-myc及CyclinD1的表達(dá)［15］。我們的研究顯示抑制URG4的表達(dá)可以抑制Wnt/βcatenin信號(hào)通路，這可能是其發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制之一。

我們的研究顯示，URG4在人宮頸癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，抑制URG4的表達(dá)可能通過抑制Wnt/βcatenin信號(hào)通路而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。

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［收稿2015-06-20修回2015-07-07］

(編輯許四平)

doi:10．3969/j．issn．1000-484X．2015．10．023

作者簡(jiǎn)介:周曦(1973年－)，女，副主任醫(yī)師，副教授，主要從事婦科腫瘤方面研究。

文章編號(hào)1000-484X(2015) 10-1400-04

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

中圖分類號(hào)R737