高迎春，張傳領(lǐng)，牛麗麗，溫建勛，程國強(qiáng)，肖 瑞(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 00059;內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院;共同第一作者;通訊作者，E-mail:xiaorui79@hotmail．com)

SNAPIN 蛋白(SNAP-associated protein，SNAPAP;BLOC1S7)又稱突觸小體相關(guān)蛋白，最初是在神經(jīng)細(xì)胞中作為與可溶性NSF附著蛋白受體(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor，SNARE)復(fù)合物中的SNAP-25蛋白結(jié)合被發(fā)現(xiàn)的，在神經(jīng)元中表達(dá)量豐富，主要分布在突觸囊泡膜上［1］，參與囊泡融合以及神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。后有研究發(fā)現(xiàn)SNAPIN在神經(jīng)細(xì)胞和非神經(jīng)細(xì)胞的胞質(zhì)中均有表達(dá)。

SNAPIN是由136個氨基酸組成的相對分子質(zhì)量約為15 000的蛋白，其二級結(jié)構(gòu)大部分為α螺旋［2］，N末端有一個疏水區(qū)(1-20aa)，C末端有由兩個螺旋區(qū)H1和H2形成的卷曲螺旋(coiled-coil)，該螺旋結(jié)構(gòu)域在許多囊泡融合蛋白中保守存在。研究發(fā)現(xiàn)SNAPIN蛋白功能的發(fā)揮主要通過卷曲螺旋與其他蛋白相互作用來實(shí)現(xiàn)。SNAPIN是一種廣泛表達(dá)的蛋白，在心臟、肝臟、腎臟中均有表達(dá)［3］，提示該蛋白可能在不同組織中發(fā)揮不同的作用。SNAPIN除與SNAP25結(jié)合之外，還與雌激素受體結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)抗原 9(EBAG9)［4］，cypin［5］，casein kinase 1-delta［6］，a subunit of Exo70［7］，經(jīng)典瞬時受體電位 6(TRPC6)［8］，膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控蛋白 1(EHD1)［9］，腺苷酸環(huán)化酶Ⅵ(type Ⅳ adenylyl cyclase)［10］，ryanodine receptor［11］，受體酪氨酸激酶 c-MET［12］，UT-A1 urea transporter［13］等蛋白相互作用。其中 c-MET酪氨酸激酶受體主要在上皮細(xì)胞中表達(dá)，參與胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷恢復(fù)、組織重生和形態(tài)分化等;在病理狀態(tài)下，c-MET和肝細(xì)胞因子(hepatocyte growth factor，HGF)可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖、細(xì)胞擴(kuò)散、血管形成、細(xì)胞黏附、細(xì)胞侵襲、細(xì)胞運(yùn)動和抗凋亡等作用。

本實(shí)驗(yàn)通過實(shí)時定量PCR的方法在轉(zhuǎn)錄水平上來研究SNAPIN基因沉默和過表達(dá)后，其相互作用蛋白c-MET的表達(dá)，觀察SNAPIN蛋白的表達(dá)及其對相關(guān)蛋白c-MET表達(dá)是否具有調(diào)控作用。

1 材料和方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料

HEK 293T細(xì)胞(人胚腎上皮細(xì)胞系)購置于上海中科院細(xì)胞庫，質(zhì)粒pEGFP-C1(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)師永紅饋贈)，大腸桿菌DH5a(內(nèi)蒙古自治區(qū)分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存)，限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和EcoRⅠ(Takara，Japan)，分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品(DL3000，天根生物)，Stealth siRNA sets(Cat．1299001，Invitrogen，USA)，Trizol(上海生工)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，Japan)，SYBR green熒光定量PCR試劑盒(Takara，Japan)，質(zhì)粒提取試劑盒(天根生物)，膠回收試劑盒(Qiagen，USA)，PCR引物合成及重組質(zhì)粒測序(上海生工)，DMEM培養(yǎng)基(Gibco，USA)，胎牛血清(杭州四季青)，LipofectamineTM2 000(Invitrogen，USA)。

1．2 方法

1．2．1 重組載體構(gòu)建 以Trizol法提取HEK 293T細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴(kuò)增獲取全長產(chǎn)物，上游引物:5'-ATC TCG AGC AGG ACA ATT CGT GAT GG-3'(含XhoI酶切位點(diǎn));下游引物:5'-GAA TTC TCA TCT GTT ATT TGC CTG GG-3'(含EcoRⅠ酶切位點(diǎn))。PCR產(chǎn)物大小約431 bp。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5 min，94℃ 30 s，59℃30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)35 次，72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酶切純化后與相同酶切處理的載體pEGFP-C1連接。通過電穿孔轉(zhuǎn)化到E．coli DH5α中，接種培養(yǎng)后，隨機(jī)挑選單克隆通過PCR，酶切反應(yīng)和測序鑒定。

1．2．2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 HEK 293T細(xì)胞用含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，按2×105個細(xì)胞/孔接種于無菌6孔板中，次日待細(xì)胞生長至60%-70%融合度時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明，將pEGFP-SNAPIN(過表達(dá)重組質(zhì)粒)或Stealth siRNA(RNA干擾片段)分別轉(zhuǎn)染至HEK 293T細(xì)胞中培養(yǎng)24-48 h，收集細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)檢測。同時設(shè)立未轉(zhuǎn)染細(xì)胞對照組。以上各細(xì)胞為同代細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)和培養(yǎng)條件等均保持一致，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．2．3 RNA提取和實(shí)時定量PCR Trizol法提取總RNA，以2 μg總RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以表1引物、SYBR Green熒光染料(Takara，Japan)相對定量PCR檢測，以GAPDH為內(nèi)參。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性15 s，95℃變性15 s，退火15 s(退火溫度見表1)，72℃延伸20 s，共40個循環(huán)。引物設(shè)計采用primer 5．0軟件，委托上海生工公司合成(見表1)。

表1 實(shí)時定量PCR實(shí)驗(yàn)的引物序列和相應(yīng)的退火溫度Table 1 Primer sequences and corresponding annealing temperature for real-time PCR

1．3 數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計處理

實(shí)時定量 PCR結(jié)果采用2-ΔΔCt法，其中 ΔΔCt=(Ct目標(biāo)基因-Ct內(nèi)參基因)樣本-(Ct目標(biāo)基因-Ct內(nèi)參基因)對照。數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 10．0統(tǒng)計軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。各組間樣本均數(shù)進(jìn)行單因素方差分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增SNAPIN全長基因

通過PCR擴(kuò)增獲得人的SNAPIN全長基因(431 bp，見圖 1)。

圖1 PCR擴(kuò)增獲得人全長SNAPIN基因Figure 1 The amplification of SNAPIN mRNA by PCR

2．2 pEGFP-SNAPIN熒光蛋白表達(dá)重組載體的構(gòu)建

隨機(jī)挑選6個轉(zhuǎn)化質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗(yàn)證，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示6個質(zhì)粒中均可擴(kuò)增出全長SNAPIN基因，提示重組載體構(gòu)建成功(見圖2)。針對其中兩個轉(zhuǎn)化質(zhì)粒進(jìn)行XhoⅠ和EcoRⅠ酶切反應(yīng)，驗(yàn)證重組載體構(gòu)建成功(見圖3)。將上述方法驗(yàn)證過的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙向測序，測序結(jié)果(見圖4)經(jīng)BLAST比對后證實(shí)SNAPIN成功插入PEGFP載體中。以上三種驗(yàn)證方法證明成功構(gòu)建pEGFP-SNAPIN熒光蛋白表達(dá)重組載體。

圖2 PCR反應(yīng)擴(kuò)增SNAPIN驗(yàn)證重組質(zhì)粒Figure 2 The recombinant plasmids confirmed by PCR

2．3 HEK 293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染48 h后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率(見圖5)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染效率較高，可用于后續(xù)分析。

圖3 酶切反應(yīng)驗(yàn)證重組質(zhì)粒Figure 3 The identification of recombinant plasmids by double enzyme digestion

圖4 pEGFP-SNAPIN重組質(zhì)粒測序結(jié)果原始圖譜Figure 4 The partial sequencing result of pEGFP-SNAPIN

圖5 轉(zhuǎn)染pEGFP-SNAPIN后的HEK 293T細(xì)胞Figure 5 The pEGFP-SNAPIN transfected HEK 293T cells

2．4 實(shí)時定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后SNAPIN、c-MET的表達(dá)

分別用構(gòu)建好的pEGFP-SNAPIN表達(dá)載體和合成的siRNA SNAPIN干擾片段轉(zhuǎn)染到HEK 293T細(xì)胞后用ABI的7500fast熒光定量PCR儀進(jìn)行定量PCR實(shí)驗(yàn)，檢測 SNAPIN表達(dá)的改變。SNAPIN、c-MET和GAPDH的擴(kuò)增曲線良好，說明反應(yīng)正常進(jìn)行。融解曲線呈單峰，說明引物擴(kuò)增特異性強(qiáng)(見圖6)。

圖6 SNAPIN，GAPDH，c-MET的融解曲線Figure 6 The melting curves of SNAPIN，GAPDH and c-MET gene

實(shí)時定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-SNAPIN后的HEK 293T細(xì)胞中SNAPIN的表達(dá)量顯著上調(diào)(P＜0．05，見表2)，在siRNA沉默SNAPIN基因后，轉(zhuǎn)錄水平上SNAPIN的表達(dá)下調(diào)(P＜0．05)。在 SNAPIN過表達(dá)的細(xì)胞中，c-MET的表達(dá)隨之顯著上調(diào) 1．75倍(P＜0．05);反之SNAPIN基因沉默后，分析發(fā)現(xiàn)c-MET的表達(dá)也隨之下調(diào)，是正常細(xì)胞表達(dá)水平的 0．73倍(P＜0．05)。

表2 SNAPIN、c-MET和GAPDH實(shí)時定量PCR中相對表達(dá)結(jié)果Table 2 The relative expression of SNAPIN，c-MET and GAPDH by real-time quantitative PCR

3 討論

SNAPIN蛋白在神經(jīng)細(xì)胞和非神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)，在人全身各組織中均有表達(dá)，提示該蛋白具有廣泛的生物學(xué)功能。由Kunt＆AliceWallenberg基金支持近期開展的Human Protein Atlas項(xiàng)目中發(fā)現(xiàn)SNAPIN除了在正常組織中表達(dá)外，還在多種腫瘤組織中表達(dá)，尤其是結(jié)直腸癌、乳腺癌、甲狀腺癌、卵巢癌、惡性黑色素瘤、子宮內(nèi)膜癌等中高表達(dá)(http://www．proteinatlas．org/ENSG00000143553-SNAPIN/cancer)。SNAPIN也可以與很多不同生理過程中的蛋白相互作用，說明SNAPIN是一個多功能蛋白，最新研究發(fā)現(xiàn)，SNAPIN和體外放射治療緩解期的非轉(zhuǎn)移性前列腺癌男性的疲勞惡化相關(guān)［14］。

在Christian等［15］2004年的研究中發(fā)現(xiàn)SNAPIN可與原癌基因編碼的蛋白產(chǎn)物c-MET相互作用，該蛋白是肝細(xì)胞生長因子受體酪氨酸激酶，其與多種癌基因產(chǎn)物和調(diào)節(jié)蛋白相互作用，參與細(xì)胞信息傳導(dǎo)、胚胎發(fā)育、細(xì)胞骨架重排的調(diào)控以及腫瘤發(fā)生過程，是細(xì)胞增殖和分化重要因素。c-MET在多種腫瘤中，如胃腫瘤、彌散型星形細(xì)胞瘤、乳腺癌、前列腺癌高表達(dá)，可增加蛋白轉(zhuǎn)錄而減少基因擴(kuò)增，且c-MET的高表達(dá)與耐藥性相關(guān)［16］。

SNAPIN是c-MET的相互作用蛋白，而SNAPIN的另一個相互作用蛋白SNAP-25可以與肝細(xì)胞生長因子調(diào)控的酪氨酸激酶作用底物HRS發(fā)生作用，該蛋白通過將c-MET定位至溶酶體而參與c-MET的降解過程。而本研究發(fā)現(xiàn)c-MET在HEK 293T細(xì)胞的表達(dá)受到SNAPIN的調(diào)控，提示在HEK 293T細(xì)胞中SNAPIN可能通過與c-MET結(jié)合來調(diào)控c-MET的表達(dá)，提示SNAPIN很可能與這些蛋白做為一個蛋白復(fù)合體而存在，或者參與調(diào)控該生理過程。由于在不同細(xì)胞、不同分化階段作用的底物不同，c-MET在不同的條件下表現(xiàn)出多種不同的功能，如促進(jìn)肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和黑色素細(xì)胞的分裂;引起上皮細(xì)胞的分散，在胚胎發(fā)育過程中控制細(xì)胞的移動;誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)變化等。以上研究提示我們，SNAPIN可能調(diào)節(jié)c-MET參與細(xì)胞生理過程，但具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究，本研究對于揭示SNAPIN蛋白在其他生理途徑中的功能是非常有意義的。

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