楊競霄，白寶寶，王海燕(第四軍醫(yī)大學附屬唐都醫(yī)院心內(nèi)科，西安 710038)

高血壓性心肌重構(gòu)主要表現(xiàn)為左心室肥厚(left ventricular hypertrophy，LVH)，心肌細胞的肥大和凋亡是其重要的細胞學基礎(chǔ)［1］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導的細胞凋亡途徑是近年研究熱點，應(yīng)激保護因子GRP78和促凋亡因子CHOP為ERS的標志性因子，兩者的表達水平對細胞的存亡至關(guān)重要［2］。研究表明，ERS可能參于了高血壓LVH的發(fā)生發(fā)展［3］，但國內(nèi)外相關(guān)報道仍較少。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)不僅有效阻滯RASS系統(tǒng)發(fā)揮降壓和逆轉(zhuǎn)心肌肥厚的作用，還可通過抗氧化應(yīng)激和ERS保護心肌細胞［4，5］。馬來酸依那普利為第二代 ACEI，其逆轉(zhuǎn)左室肥厚的效果如何以及是否有ERS參于，目前仍不清楚。本研究通過腹主動脈縮窄術(shù)建立高血壓大鼠模型，觀察了馬來酸依那普利對大鼠血壓、左室肥厚及心肌細胞 ERS相關(guān)因子GRP78和CHOP表達的影響，探討了GRP78和CHOP表達的變化與左室肥厚的關(guān)系，為馬來酸依那普利片防治心血管疾病提供新的依據(jù)。

1 材料及方法

1．1 實驗動物

成年雄性 SD大鼠40只，6－8周齡，體質(zhì)量(200±20)g(第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供)。馬來酸依那普利片(默克公司生產(chǎn))，兔抗大鼠GRP78抗體及兔抗大鼠CHOP抗體(美國Abcam公司)，堿性磷酸酶標記的羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，BP-100型大鼠無創(chuàng)尾動脈血壓測定分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)，顯微鏡數(shù)碼相機(日本尼康)，圖像分析軟件(美國Media Cybernetics公司)。

1．2 方法

1．2．1 高血壓大鼠模型制備及實驗分組 將30只SD大鼠行腹主動脈縮窄術(shù)建立高血壓大鼠模型。腹主動脈縮窄術(shù)按文獻報道方法［6］并作改進，具體步驟如下:大鼠1%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥固定，腹部脫毛，手術(shù)野消毒鋪洞巾，于腹中部沿正中線剪開皮膚，逐層進入腹腔，用小棉球?qū)⑽讣澳c管阻隔，以便充分暴露手術(shù)區(qū)，剝離手術(shù)段腹主動脈。以7號去尖端注射針頭折成L型，長柄平行置于此段腹主動脈上，5/0手術(shù)絲線結(jié)扎，抽出針頭，造成腹主動脈部分縮窄，置于清潔鼠籠喂養(yǎng)。術(shù)后2周使用無創(chuàng)鼠尾測壓系統(tǒng)測大鼠血壓，取SBP＞140 mmHg高血壓大鼠24只，隨機分為對照組和藥物干預(yù)組，每組12只;根據(jù)喂養(yǎng)時間的不同，又將各組大鼠分為4周、8周2個亞組，每亞組6只。對照組給予生理鹽水灌胃，藥物干預(yù)組給予馬來酸依那普利片粉劑10 mg(kg·d)灌胃。

1．2．2 各組大鼠血壓值的測量 分組后0周、4周和8周使用無創(chuàng)尾動脈血壓測定分析系統(tǒng)檢測各組大鼠血壓和心率。方法如下:輕取大鼠，選擇合適的筒形大鼠固定器將其固定，盡量選擇暗環(huán)境且避免嘈雜，待大鼠平靜約30 min后放入預(yù)熱槽中，將預(yù)熱溫度調(diào)至37℃，預(yù)熱30 min，可見鼠尾部微紅血管擴張，將充氣加壓袖套置于鼠尾根部，高敏脈搏換能器置于鼠尾中上1/3處，換能器緊貼鼠尾下側(cè)尾動脈所在處，打開記錄系統(tǒng)，可見脈搏波，待大鼠安靜及脈搏平緩后進行血壓測量，每只大鼠測量3次求其平均值，每次測量間隔5 min以上，記錄心率、收縮壓(SBP)及舒張壓(DBP)。

1．2．3 心肌肥厚指數(shù)HWI及LVWI的測定 將大鼠禁食禁水12 h，稱取體質(zhì)量(BW)，戊巴比妥鈉麻醉后開胸取其心臟，將心臟放入4℃ PBS中反復(fù)沖洗，置于冰上剪去心房、多余大血管及周圍結(jié)締組織，用濾紙將其中殘液吸干，稱取全心質(zhì)量(HW);再剪去右心室室壁組織，保留室間隔及左室室壁組織，稱取左心室質(zhì)量(LVW)，計算全心肥厚指數(shù)HWI(HW/BW)和左室肥厚指數(shù) LVWI(LVW/BW)。隨后，沿左心室長軸透壁剪開，一部分組織置于4 g/L多聚甲醛中固定，用于HE染色。一部分組織置于液氮缸中，用于蛋白電泳。

1．2．4 免疫組化檢測各組大鼠心肌組織中GRP78及CHOP的表達 將心肌組織的石蠟切片經(jīng)烤片、脫蠟、水化、PBS洗滌后，30 ml/L H2O2封閉15 min，高溫高壓連續(xù)噴氣3 min抗原修復(fù)，室溫下山羊血清封閉20 min，滴加1∶500稀釋兔抗大鼠GRP78一抗孵育(4℃過夜)。復(fù)溫20 min后PBS洗滌，滴加1∶500稀釋羊抗兔 IgG(37℃孵育25 min)，滴加DAB顯色，復(fù)染、脫水、透明、中性樹膠封片，鏡下觀察結(jié)果，測定平均光密度(OD)值，并進行定量分析。CHOP兔抗大鼠一抗及羊抗兔二抗稀釋比例及測定步驟同GRP78。

1．2．5 Western blot檢測各組大鼠心肌組織中GRP78及CHOP的表達 將稱重后切成小塊的心肌組織放入清潔的玻璃勻漿器中，加入RIPA蛋白裂解液，置于冰上用玻璃勻漿器勻漿，靜置30 min待其充分裂解，4℃ 10 000 r/min離心10 min，取上清BCA蛋白測定法蛋白定量，余上清煮沸后分裝，－80℃保存。取等量蛋白樣品于100 g/L SDSPAGE凝膠恒壓電泳分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜上。以50 g/L脫脂奶粉封閉1 h后，依次滴加1∶1 000兔抗大鼠GRP78、CHOP抗體，4℃振蕩孵育過夜，1∶500羊抗兔 IgG室溫振蕩孵育1 h，TBS洗膜30 min，用ECL試劑盒反應(yīng)，X-ray曝光顯影，凝膠成像分析系統(tǒng)進行灰度掃描分析，計算A值。

1．3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2．1 各組大鼠SBP的比較

分組后0周，對照組及藥物干預(yù)組大鼠SBP相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。分組后4周和8周，藥物干預(yù)組大鼠SBP均顯著低于對照組(P＜0．01，見表1)。

2．2 各組大鼠心肌肥厚指標的比較

隨著手術(shù)后喂養(yǎng)時間的增長，對照組HWI和LVWI明顯增高，8周亞組明顯高于4周亞組(P＜0．05);與對照組4周、8周亞組相比，藥物干預(yù)組相應(yīng)亞組 HWI和 LVWI明顯降低(P＜0．05，見表2)。

表1 各組大鼠不同時間點SBP的比較(n=6，±s，mmHg)Table 1 Comparison of SBP between two groups at different time points(n=6，±s，mmHg)

表1 各組大鼠不同時間點SBP的比較(n=6，±s，mmHg)Table 1 Comparison of SBP between two groups at different time points(n=6，±s，mmHg)

與對照組比較，#P ＜0．01

組別 0周 4周 8周153．69 ±5．32 165．73 ±9．64 176．34 ±11．92藥物干預(yù)組 151．28 ±7．47 127．08 ±7．57#123．62 ±8．41對照組#

表2 各組大鼠LVWI及HWI值的比較(n=6，±s)Table 2 Comparison of LVWI and HWI between two groups at different time points(n=6，±s)

表2 各組大鼠LVWI及HWI值的比較(n=6，±s)Table 2 Comparison of LVWI and HWI between two groups at different time points(n=6，±s)

與對照組比較，*P ＜0．05

組別LVWI 4周 8周HWI 4周 8周3．18 ±0．12 3．76 ±0．15 3．42 ±0．14 4．15 ±0．13藥物干預(yù)組 2．36 ±0．09*2．54 ±0．08*2．56 ±0．10*2．84 ±0．10對照組*

2．3 免疫組化檢測

GRP78、CHOP表達位于胞質(zhì)中，4周時，對照組大鼠心肌細胞GRP78和CHOP均有表達，可見棕黃色顆粒，GRP78呈強陽性表達，CHOP則呈少量表達(見圖1，2)。與對照組相比，藥物干預(yù)組大鼠心肌細胞GRP78和 CHOP表達均降低(P＜0．05)，以GRP78表達降低更為明顯(P＜0．01)。8周時，對照組大鼠心肌細胞CHOP表達明顯增高而GRP78表達降低;與對照組相比，藥物干預(yù)組大鼠心肌細胞GRP78和CHOP表達均降低(P＜0．05)，以 CHOP表達降低更為明顯(P＜0．01，見圖3)。

圖1 各組大鼠心肌組織中GRP78表達的免疫組化染色 (×400)Figure 1 The expression of GRP78 in myocardial tissues by immunohistochemistry(×400)

圖2 各組大鼠心肌組織中CHOP表達的免疫組化染色 (×400)Figure 2 The expression of CHOP in myocardial tissues by immunohistochemistry(×400)

圖3 各組大鼠心肌組織中GRP78和CHOP表達的定量分析Figure 3 Quantitative analysis of the expression of GRP78 and CHOP in myocardial tissues

2．4 Western blot檢測

4周時，對照組大鼠心肌細胞中GRP78蛋白為高表達，CHOP蛋白則少量表達;藥物干預(yù)組大鼠心肌細胞中GRP78蛋白表達顯著低于對照組(P＜0．01)，CHOP 表達明顯低于對照組(P ＜ 0．05)。8周時，對照組大鼠心肌組細胞中GRP78蛋白表達明顯降低，CHOP蛋白表達顯著升高。藥物干預(yù)組大鼠心肌細胞中GRP78明顯低于對照組(P＜0．05)，CHOP蛋白表達水平顯著低于對照組(P＜0．01，見圖4)。

圖4 GRP78和CHOP表達的Western blot結(jié)果及趨勢圖Figure 4 Western blot results of GRP78 and CHOP expression

3 討論

ERS誘導的細胞凋亡是目前國內(nèi)外研究的一個熱點。理化因素、藥物、細胞環(huán)境改變等多種原因均可導致細胞發(fā)生ERS。適度的ERS可使GRP78表達增多，增強對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中未折疊或錯誤折疊蛋白質(zhì)的處理，對細胞有保護作用;當應(yīng)激過強或持續(xù)過久時，應(yīng)激保護因子GRP78和促凋亡因子CHOP表達失衡，CHOP 表達增多，誘導細胞凋亡［7－9］。研究證實，在高血壓引起心肌重構(gòu)的病理過程中，除了血流動力學、體液和心肌細胞信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)等多種因素參與外，心肌細胞的凋亡是一個極為重要的因素［10］。那么，ERS是否參于高血壓所致心肌細胞凋亡，目前研究甚少。本研究采用腹主動脈縮窄術(shù)建立高血壓大鼠模型，隨著術(shù)后喂養(yǎng)時間的延長，大鼠血壓水平持續(xù)升高，左室肥厚程度逐漸加重，提示建立的高血壓大鼠模型成功且穩(wěn)定。通過觀察4周和8周大鼠心肌細胞GRP78和CHOP蛋白表達的變化，結(jié)果顯示隨著大鼠血壓升高，4周時心肌細胞GRP78表達明顯升高，CHOP表達輕度升高;表明在血壓升高初期心肌細胞已發(fā)生ERS，此時應(yīng)激保護因子GRP78表達占優(yōu)勢，增強心肌細胞對應(yīng)激的處理，對細胞起保護作用。隨著血壓持續(xù)升高，8周時GRP78表達降低，CHOP表達明顯升高;提示持久的應(yīng)激使促凋亡因子CHOP表達升高，對心肌細胞起損害作用，最終導致左室肥厚的發(fā)生發(fā)展。

馬來酸依那普利為二代血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑，口服后在體內(nèi)水解成依那普利，后者強烈抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶，降低血管緊張素Ⅱ含量，造成全身血管舒張，降低血壓。該藥具有確切的降壓作用，但其對高血壓左室肥厚的影響及作用機制研究甚少。本研究使用馬來酸依那普利灌胃4周及8周，大鼠血壓水平顯著降低，證實了其獨特的降壓效果。研究還發(fā)現(xiàn)，藥物干預(yù)4周和8周大鼠左室肥厚指數(shù)明顯低于對照組，表明該藥在降壓的同時還可有效保護心肌。通過觀察給藥后大鼠心肌細胞GRP78和CHOP表達的變化，結(jié)果顯示，4周末ERS保護因子GRP78呈少量表達，明顯低于對照組;表明該藥從早期即抑制了心肌細胞的ERS，避免了ERS誘導介導的心肌細胞損傷。8周末，促凋亡因子CHOP表達顯著低于對照組，間接反應(yīng)了心肌細胞受損程度較輕;表明該藥可持續(xù)抑制心肌細胞ERS，有效保護心肌細胞使其受損程度降低，最終延緩或逆轉(zhuǎn)左室肥厚的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，馬來酸依那普利可有效降低血壓水平，并可通過抑制心肌細胞ERS的途徑保護心肌，使左室肥厚程度明顯減輕。依那普利因其對心腦血管具有良好的保護作用目前已經(jīng)廣泛使用，我們從分子水平上進一步研究了該藥對心肌的可能保護機制，為更好地預(yù)防及臨床規(guī)范化治療高血壓相關(guān)心血管疾病提供新的理論依據(jù)。

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