周 芹，王 晞，王 龍(武漢大學(xué)人民醫(yī)院麻醉科，武漢 430060;武漢大學(xué)心血管病研究所;通訊作者，E-mail:wanglongwhu@63．com)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是心力衰竭的重要原因之一。AMI早期給予有效的藥物治療不僅能改善心功能，延緩心力衰竭，抑制心肌重構(gòu)，還可明顯降低死亡率。因而改善AMI后心功能和心室重構(gòu)的研究越來(lái)越受到研究者們的關(guān)注。

近年的研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(neuregulin-1，NRG-1)有多種心血管生物學(xué)效應(yīng)［1］，包括抑制炎癥，調(diào)節(jié)細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能、增殖與凋亡等。TLR4(toll like receptor 4，TLR4)是引發(fā)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵跨膜蛋白，廣泛分布于心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等，研究發(fā)現(xiàn)TLR4基因缺陷型小鼠心肌損傷相關(guān)的炎癥反應(yīng)較輕［2，3］，抑制 TLR4 的表達(dá)能產(chǎn)生保護(hù)性的結(jié)果［4］。目前NRG-1抑制炎癥介質(zhì)，對(duì)心肌梗死大鼠的心肌保護(hù)作用是否與TLR4相關(guān)未見(jiàn)研究報(bào)道，故本研究通過(guò)建立大鼠急性心肌梗死模型，探討神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1對(duì)大鼠缺血心肌的保護(hù)及對(duì)梗死心肌TLR4 mRNA表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康成年SD雄性大鼠30只，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，體重250－300 g，隨機(jī)分為心梗模型組(MI組，n=12)、NRG-1預(yù)處理組(NRG組，n=12)及假手術(shù)組(sham組，n=6)。NRG組結(jié)扎左前降支建立心梗模型，于建模前30 min按0．01 μg/g經(jīng)鼠尾靜脈注射重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(rh-NRG-1，sigma公司，RD5897-NR-050);MI組結(jié)扎左前降支建立心梗模型;sham組于建模時(shí)僅開(kāi)胸暴露冠脈而不結(jié)扎，后兩組均于手術(shù)前30 min給予等量生理鹽水尾靜脈干預(yù)。各組均于術(shù)后24 h取左心室。

1．2 心肌梗死模型的建立

成年SD雄性大鼠，體重250－300 g，術(shù)前禁食12 h，自由飲水。給予腹腔注射1．5%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉。將大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)，分別將4個(gè)針形電極置于四肢皮下，采用BIOPAC16導(dǎo)生理記錄儀記錄Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、aVL、aVR、aVF導(dǎo)聯(lián)心電圖。行氣管插管，使用小動(dòng)物呼吸機(jī)調(diào)整呼吸參數(shù)(呼吸頻率:70次/min，呼吸比1∶1)維持大鼠呼吸。于大鼠左側(cè)胸部碘伏消毒，鋪無(wú)菌洞巾。胸壁左旁正中切開(kāi)皮膚，鈍性分離筋膜和肌肉，鉗夾斷開(kāi)左側(cè)3、4肋骨，開(kāi)胸器撐開(kāi)肋骨以利于手術(shù)視野充分暴露。以眼科剪縱行剪開(kāi)心包，充分暴露心臟后，于左心耳下緣與肺動(dòng)脈圓錐間的冠狀動(dòng)脈處(約在左心耳下緣3－4 mm)，用5－0縫線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支。結(jié)扎部位以下心肌顏色變暗，搏動(dòng)幅度減弱，心電圖顯示肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖ST段抬高大于2 mm(以心電圖Ⅰ、Ⅱ、aVL導(dǎo)聯(lián)ST段抬高0．2 mv作為手術(shù)成功標(biāo)志)，表明心肌梗死模型成功。最后逐層關(guān)胸。

1．3 記錄心率及心肌梗死面積測(cè)定

術(shù)后24 h，再次經(jīng)腹腔麻醉大鼠，接呼吸機(jī)并記錄各組大鼠心率后，模型組與預(yù)處理組隨機(jī)取6只大鼠開(kāi)胸摘取心臟，在冰鹽水內(nèi)清洗殘血，除去心房及右心室。－80℃冰凍心室5 min，沿結(jié)扎水平至心尖縱向?qū)⒆笮氖揖鶆蚯谐?－5片(厚度為1 mm)后，浸入1%TTC(2，3，5－氯化三苯基四氮唑)溶液中，37℃避光孵育30 min，未梗死心肌顯紅色，梗死區(qū)心肌未著色。應(yīng)用Image-Pro Plus 6．0圖像分析軟件測(cè)量心肌梗死面積百分比(心肌梗死面積之和/心肌總面積之和×100%)。

1．4 心肌Toll樣受體4 mRNA表達(dá)檢測(cè)

以real time-PCR方法檢測(cè)術(shù)后24 h三組大鼠(各6只)梗死區(qū)心肌標(biāo)本。采用Invitrogen Biotechnology Co．LTD中國(guó)公司合成的心肌Toll樣受體4 mRNA引物，序列為 5'－GCTCTGGCATCATCTTCATTGT－3'，片段長(zhǎng)度為215 bp。內(nèi)參基因β-actin引物序列為5'－TGCTATGTTGCCCTAGACTTCG－3'，片段長(zhǎng)度為240 bp。以Trizol試劑抽提心肌組織總RNA，對(duì)其進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，95℃預(yù)變性10 min，95℃延伸15 s，60℃延伸60 s，循環(huán)40次，溶解曲線從75℃至90℃，每20 s升高1℃。以β-actin進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，由隨機(jī)軟件計(jì)算出Ct值與拷貝數(shù)。以假手術(shù)組為對(duì)照，比較各組大鼠梗死區(qū)心肌TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2．1 各組大鼠心肌梗死模型建立及心率的監(jiān)測(cè)

如圖1所示，心電圖Ⅰ、Ⅱ、aVL導(dǎo)聯(lián)ST段抬高＞0．2 mV，表示心梗模型建立成功。模型建立24 h后各組大鼠心率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05，見(jiàn)表1)。

圖1 建立心梗模型時(shí)大鼠心電圖Figure 1 The ECG of rats during myocardium ischemic model establishment

表1 各組大鼠心梗后24 h心率與心梗面積百分比結(jié)果(n=6，±s)Table 1 The heart rate and infarct size percentage of rats after 24 h myocardial ischemia in each group(n=6，±s)

表1 各組大鼠心梗后24 h心率與心梗面積百分比結(jié)果(n=6，±s)Table 1 The heart rate and infarct size percentage of rats after 24 h myocardial ischemia in each group(n=6，±s)

與心梗模型組比較，*P＜0．05

分組 心率(次/min) 梗死面積百分比(%)339．50 ±12．63 －心梗模型組 351．33 ±13．29 21．52 ±5．89 NRG-1 預(yù)處理組 344．83 ±13．88 15．18 ±3．98假手術(shù)組*

2．2 心肌梗死面積

心梗后24 h，心梗模型組及NRG-1預(yù)處理組大鼠心肌梗死面積百分比分別為(21．52±5．89)%和(15．18 ±3．98)%，與心梗模型組比較，NRG-1 預(yù)處理組大鼠心梗面積明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05，見(jiàn)表1)。兩組大鼠心肌TTC染色見(jiàn)圖2。

圖2 心梗模型組及NRG-1預(yù)處理組大鼠梗死面積TTC染色圖Figure 2 The infarct size of rats in MI group and NRG group by TTC staining

2．3 各組梗死區(qū)心肌TLR4 mRNA表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

Real-time PCR結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，心梗模型組Toll樣受體4 mRNA的表達(dá)顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01);與模型組相比，NRG-1預(yù)處理組Toll樣受體4 mRNA的表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01，見(jiàn)圖3)。

圖3 各組大鼠梗死區(qū)心肌TLR4 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果(n=6)Figure 3 TLR4 mRNA expression level of myocardial infarction area in each group(n=6)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)大鼠建立急性心肌梗死模型24 h后，梗死區(qū)心肌Toll樣受體4 mRNA表達(dá)水平增加，這與其他研究者的結(jié)果一致［5，6］。心肌梗死后，機(jī)體啟動(dòng)修復(fù)與炎癥反應(yīng)密不可分，然而炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間又會(huì)對(duì)已受損心肌造成損傷。Toll樣受體(TLR)是固有免疫系統(tǒng)中特異的Ⅰ型跨膜受體及病原模式識(shí)別受體。經(jīng)研究證實(shí)TLR2、TLR4及TLR6表達(dá)于人類心臟，其中TLR4是人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)TLR相關(guān)蛋白，廣泛分布于淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等［7］。TLR4激活后可引起NF-κB活化轉(zhuǎn)位進(jìn)核，激活絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路，進(jìn)一步引起下游炎性因子的過(guò)度釋放，如IL-1、IL-6、IL-8和腫瘤壞死因子－α等，促進(jìn)炎癥的發(fā)展［8］，促使心肌細(xì)胞凋亡。有學(xué)者報(bào)道了TLR4突變鼠心肌梗死后更少發(fā)生左心室重塑，從而保護(hù)左心室功能，而且非梗死區(qū)間質(zhì)纖維化和心肌肥厚也較少發(fā)生［9］。另有研究報(bào)道，經(jīng)左前降支動(dòng)脈短暫阻塞后TLR4突變鼠梗死面積降低，同時(shí)心肌中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和補(bǔ)體沉積均有減少［3］，可見(jiàn)阻斷TLR4的表達(dá)可能抑制下游炎性因子的過(guò)度釋放從而保護(hù)受損心肌。

Neuregulin-1(NRG-1)神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白，也稱為神經(jīng)膠質(zhì)生長(zhǎng)因子(glial growth factor，GGF)或乙酰膽堿受體活性誘導(dǎo)蛋白(acetylcholine receptor inducing activity protein，ARIA)，是一類表皮生長(zhǎng)因子類蛋白［10］，通過(guò)誘導(dǎo)ErbB受體構(gòu)象改變，使ErbB蛋白形成二聚體，繼而激活酪氨酸激酶，從而激活下游一系列信號(hào)通路，參與多種生理病理過(guò)程。2000年部分接受抗ErbB2單克隆抗體Trastuzumab(赫賽汀)治療的乳腺癌患者被發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)心功能不全［11，12］，于是Neuregulin-1及其受體在心血管系統(tǒng)的作用逐漸受到關(guān)注。研究者發(fā)現(xiàn)在缺氧復(fù)氧條件下，心臟內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)并釋放NRG可減少離體成年小鼠心室肌細(xì)胞的凋亡，而心臟內(nèi)皮細(xì)胞NRG基因敲除或沉默則取消了這種保護(hù)作用，證實(shí)了NRG對(duì)心肌局部缺血性損傷具有重要保護(hù)作用［13］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Neuregulin-1與受體結(jié)合激活酪氨酸激酶，活化其下游信號(hào)通路可發(fā)揮多種心血管生物學(xué)效應(yīng)，包括調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)功能及增殖凋亡，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)血管新生等［1，14］。此外還有研究表明，給心肌梗死大鼠靜脈注射重組NRG-1能改善心功能，上調(diào)心臟肌球蛋白輕鏈激酶(cMLCK)表達(dá)，保護(hù)受損心肌［15］。NRG-1的抗炎作用起初是在神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)研究中被發(fā)現(xiàn)。在缺血性腦損傷后給予外源性NRG-1干預(yù)，通過(guò)腦組織中DNA片段化分析，發(fā)現(xiàn)NRG-1保護(hù)作用與IL-1β的mRNA水平抑制相關(guān)，即NRG-1可抑制炎性因子IL-1β的表達(dá)［16］。通過(guò)檢測(cè)炎癥因子相關(guān)基因證明了在缺血性腦損傷大鼠模型中NRG-1的抗炎作用［17］。在小鼠實(shí)驗(yàn)性腦型瘧疾模型中NRG-1的干預(yù)可以減少腦組織前炎因子 TNF-α、IL-6、IL-1β 的水平［18］。

本研究結(jié)果顯示造模前給予rhNRG-1對(duì)心梗大鼠心率無(wú)明顯作用，但可以減少大鼠心肌梗死面積，同時(shí)降低心肌TLR4的mRNA水平。結(jié)合以上研究，我們初步推測(cè) NRG-1可能通過(guò)下調(diào)心肌TLR4表達(dá)，抑制其下游炎性因子的進(jìn)一步激活，從而減輕炎癥反應(yīng)保護(hù)缺血心肌，減少心梗面積。近年來(lái)NRG-1有關(guān)心血管方面的研究讓學(xué)者們看到了其潛在的臨床應(yīng)用前景，目前已有Ⅱ期臨床研究證實(shí)NRG-1可改善慢性心衰患者心功能，臨床運(yùn)用安全耐受性較好［19］。然而NRG-1是直接作用于心肌Toll樣受體4，下調(diào) TLR4的 mRNA水平，其對(duì)TLR4蛋白水平的影響是如何，是否還作用于其他通路抑制TLR4的表達(dá)，亦或是作用于其他靶點(diǎn)，其多重生物學(xué)效應(yīng)的機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

［1］Odiete O，Hill MF，Sawyer DB．Neuregulin in cardiovascular development and disease［J］．Circ Res，2012，111(10):1376－1385．

［2］Timmers L，Sluijter JP，van Keulen JK，et al．Toll-like receptor 4 mediates maladaptive left ventricular remodeling and impairs cardiac function after myocardial infarction［J］．Circ Res，2008，102(2):257－264．

［3］Oyama J，Blais C Jr，Liu X，et al．Reduced myocardial ischemiareperfusion injury in toll-like receptor 4-deficient mice［J］．Circulation，2004，109(6):784－789．

［4］Shimamoto A，Chong AJ，Yada M，et al．Inhibition of Toll-like receptor 4 with eritoran attenuates myocardial ischemia-reperfusion injury［J］．Circulation，2006，114(1 Suppl):1270－ 1274．

［5］張?jiān)?，王階，郭麗麗，等．活血安心方減輕急性心肌缺血損傷的實(shí)驗(yàn)研究［J］．中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，32(7):939－943．

［6］Soraya H，Clanachan AS，Rameshrad M，et al．Chronic treatment with metformin suppresses toll-like receptor 4 signaling and attenuates left ventricular dysfunction following myocardial infarction［J］．Eur J Pharmacol，2014(8)，737:77－ 84．

［7］唐倫先，張華．Toll樣受體2/4在心臟疾病中的作用研究進(jìn)展［J］．中華臨床醫(yī)師雜志:電子版，2012，6(12):3341－3343．

［8］Yan ZQ．Regulation of TLR4 expression is a tale about tail［J］．Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006，26(12):2582－2584．

［9］Timmers L，Sluijter JP，van Keulen JK，et al．Toll-like receptor 4 mediates maladaptive left ventricular remodeling and impairs cardiac function after myocardial infarction［J］．Circ Res，2008，102(2):257－264．

［10］Murphy S，Krainock R，Tham M．Neuregulin signaling via erbB receptor assemblies in the nervous system［J］．Mol Neurobiol，2002，25(1):67－77．

［11］Feldman AM，Lorell BH，Reis SE．Trastuzumab in the treatment of metastatic breast cancer:anticancer therapy versus cardiotoxicity［J］．Circulation，2000，102(3):272－274．

［12］Schneider JW，Chang AY，Rocco TP．Cardiotoxicity in signal transduction therapeutics:erbB2 antibodies and the heart［J］．Semin Oncol，2001，28(5 Suppl 16):18－26．

［13］Hedhli N，Huang Q，Kalinowski A，et al．Endothelium-derived neuregulin protects the heart against ischemic injury［J］．Circulation，2011，123(20):2254－2262．

［14］Mendes-Ferreira P，De Keulenaer GW，Leite-Moreira AF，et al．Therapeutic potential of neuregulin-1 in cardiovascular disease［J］．Drug Discov Today，2013，18(17－18):836－842．

［15］Gu Xinghua，Liu Xifu，Xu Danling，et al．Cardiac functional improvement in rats with myocardial infarction by up-regulating cardiac myosin light chain kinase with neuregulin［J］．Cardiovasc Res，2010，88(2):334－343．

［16］Xu Z，Jiang J，F(xiàn)ord G，et al．Neuregulin-1 is neuroprotective and attenuates inflammatory responses induced by ischemic stroke［J］．Biochem Biophys Res Commun，2004，322(2):440－446．

［17］Xu Z，F(xiàn)ord GD，Croslan DR，et al．Neuroprotection by neuregulin-1 following focal stroke is associated with the attenuation of ischemia-induced pro-inflammatory and stress gene expression［J］．Neurobiol Dis，2005，19(3):461－470．

［18］Solomon W，Wilson NO，Anderson L，et al．Neuregulin-1 attenuates mortality associated with experimental cerebral malaria［J］．J Neuroinflammation，2014，11:9．

［19］Jabbour A，Hayward CS，Keogh AM，et al．Parenteral administration of recombinant human neuregulin-1 to patients with stable chronic heart failure produces favourable acute and chronic haemodynamic responses［J］．Eur J Heart Fail，2011，13(1):83－92．