邸 倩，邱明才，張 鑫，楊 靜(山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院內(nèi)分泌科，太原 03000;天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院內(nèi)分泌科)

吡格列酮為噻唑烷二酮類藥物(TZDs)，噻唑烷二酮類藥物是治療糖尿病的一類新藥，主要通過激活PPAR-γ(過氧化物酶酶體增殖受體)，增加多種基因編碼蛋白的表達(dá)［1］，從而提高胰島素敏感性。近來有研究表明，TZDs可能導(dǎo)致骨量減少，可能增加骨折的風(fēng)險［2］，但也有報道，TZDs不影響骨轉(zhuǎn)換及骨密度［3］。本文探討不同劑量PIO干預(yù)影響糖尿病大鼠骨代謝指標(biāo)及骨密度。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)對象與材料

1．1．1 實(shí)驗(yàn)動物 采用鼠齡相同、平均體重約240 g的雄性SD大鼠38只［二級，實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證編號:SGCK(京)2008－0001］，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動物中心提供。標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)，自然晝夜光線照明，室內(nèi)相對濕度40%－70%，室溫保持于20－25℃。實(shí)驗(yàn)期間動物自由飲水、進(jìn)食。

1．1．2 主要藥物和試劑 鏈脲佐菌素(美國Sigma公司)、微量血糖試紙(羅氏診斷有限公司)、PIO(北京太洋有限公司)

1．1．3 實(shí)驗(yàn)所用檢測試劑盒 血清鈣磷、尿鈣檢測試劑盒(鄰甲酚肽絡(luò)合酮檢測試劑盒，通用型):中生北控生物科技股份有限公司;血堿性磷酸酶檢測試劑盒(通用型):中生北控生物科技股份有限公司。

1．1．4 主要儀器 ACCT-CHECK Active血糖儀(羅氏診斷有限公司)、TN-100B型托盤扭力天平(上海第二天平儀器廠)、半自動生化分析儀(荷蘭Vital Scientific公司)、PRODYIGY型雙能X線骨密度儀。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 實(shí)驗(yàn)分組 選取平均體重約為240 g的雄性SD大鼠38只，隨機(jī)選擇10只為正常對照組，其余28只大鼠為造模成功的大鼠，按血糖和體重分層，隨機(jī)分為PIO小劑量治療組(4 mg/(kg·d)，n=10)、PIO 大劑量治療組(20 mg/(kg·d)，n=8)、DM未治療組(n=10)。造模前夜，大鼠自由進(jìn)食水。造模當(dāng)日實(shí)驗(yàn)動物稱重，將大鼠置于鼠盒，酒精棉球擦拭大鼠尾部使尾靜脈暴露，按照45 mg/kg尾靜脈一次注射STZ(以0．1 mol/L pH 4．2的無菌枸櫞酸－枸櫞酸鈉緩沖液配制成濃度為2%的溶液)，1 ml注射器穿刺尾靜脈，見回血后30 s內(nèi)勻速完成推注。給藥后72 h和1周后測定大鼠尾靜脈血糖，血糖兩次均大于16．7 mmol/L判定為DM造模成功。正常對照組大鼠僅尾靜脈注射等體積的枸櫞酸－枸櫞酸鈉緩沖液。全部動物于成模后干預(yù)16周處死。干預(yù)期間未應(yīng)用吡格列酮之外的降糖藥物，每日上午9∶00時給藥，吡格列酮混懸液灌胃服用。干預(yù)期間無因血糖原因死亡大鼠。

1．2．2 大鼠一般狀況檢測 每周檢測大鼠體重;成模后每月經(jīng)內(nèi)眥靜脈取血，應(yīng)用血糖儀檢測大鼠血糖;處死前留取24 h尿，記錄尿量，以備測定24 h尿鈣，24 h尿磷。

1．2．3 血清鈣、磷，24 h尿鈣檢測 采用鄰甲酚肽絡(luò)合銅比色法檢測血尿鈣水平。

1．2．4 血清骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物檢測 血清堿性磷酸酶(alkaline phosphotase，ALP)的測定:處死前經(jīng)股動脈取血，分離血清，－20℃保存。在VITALAB-micro半自動生化分析儀上采用連續(xù)監(jiān)測法檢測血清ALP的酶活度。

1．2．5 骨密度測定 測量時將股骨和椎骨(L1－5)放在一個小動物平臺上，沿平臺的長軸放置。BMD測定用美國Lunar公司的Prodigy型DEXA骨密度儀，配備小動物測量軟件，儀器測定質(zhì)控體模的變異系數(shù)為0．09%。

1．3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2．1 各組大鼠血清鈣磷比較

處死前股動脈放血收集血標(biāo)本，離心后收集血清，用鄰甲酚酞絡(luò)合銅比色法測定各組大鼠處死前血鈣水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組大鼠之間血清鈣水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)。同時測定大鼠處死前血清磷水平，各組大鼠之間血清磷水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0．05，見表1)。

2．2 各組大鼠24尿量和24 h尿鈣比較

處死前留取各組大鼠24 h尿，記錄尿量，用鄰甲酚肽絡(luò)合銅比色法測定各組大鼠24 h尿鈣水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各DM組大鼠24 h尿量顯著高于正常對照組(P＜0．05)，且組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)。24 h尿鈣水平比較顯示，不同劑量組和未治療組大鼠24 h尿鈣顯著高于正常對照組(P＜0．05)，且三組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05，見表1)。

2．3 各組大鼠血清堿性磷酸酶(ALP)水平的比較

處死前股動脈放血收集血標(biāo)本，用半自動生化分析儀測定ALP酶活度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組大鼠血清堿性磷酸酶水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05，見表1)。

表1 各組大鼠血清Ca、P、ALP、24 h尿量、尿鈣比較(±s)Table 1 Comparison of serum Ca，P and ALP，and 24 h urine volume and urine Ca，among four groups(±s)

表1 各組大鼠血清Ca、P、ALP、24 h尿量、尿鈣比較(±s)Table 1 Comparison of serum Ca，P and ALP，and 24 h urine volume and urine Ca，among four groups(±s)

與對照組相比，★P ＜0．01

組別 n Ca(mmol/L) P(mmol/L) 24 h尿量(ml) 24 h尿鈣(mg) ALP(U/L)低劑量組 10 2．52 ±0．06 1．64 ±0．10 98．70 ±5．75★ 16．09 ±5．62★166．3 ±6．24高劑量組 10 2．51 ±0．09 1．64 ±0．07 97．40±4．82★ 16．32 ±2．32★ 163．5±7．34未治療組 8 2．52 ±0．11 1．65 ±0．06 99．51±11．96★ 17．03 ±3．92★ 164．1±5．62對照組 10 2．54 ±0．08 1．63 ±0．06 30．80 ±3．37 2．98 ±0．58163．7 ±6．68

2．4 各組大鼠骨密度(BMD)的比較

用DEXA雙能X線骨密度儀測定各組大鼠骨密度，結(jié)果提示，DM各組與對照組比較，股骨和腰椎骨密度均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0．01)。高劑量組股骨和腰椎骨密度低于其他三組(P＜0．05，見表2)。

與對照組相比，低劑量組大鼠股骨骨密度減低2．25%，高劑量組減低3．93%，未治療組減低1．69%。與未治療組相比，高劑量組減低2．29%;與低劑量組相比，高劑量組減低1．72%。

與對照組相比，低劑量組大鼠腰椎骨密度減低3．03%，高劑量組減低4．04%，未治療組減低2．53%。與未治療組相比，高劑量組減低1．55%，余各組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與低劑量組相比，高劑量組減低1．04%。

表2 各組大鼠骨密度比較(±s)Table 2 Comparison of the body mineral density among four groups(±s)

表2 各組大鼠骨密度比較(±s)Table 2 Comparison of the body mineral density among four groups(±s)

與對照組相比，★P ＜0．01;與未治療組相比，△P ＜0．05;與低劑量組相比，#P ＜0．05

組別 n 股骨骨密度(g/cm2) 腰椎骨密度(g/cm2)低劑量組 10 0．174±0．013★ 0．192±0．009★10 0．178 ±0．012 0．198 ±0．011高劑量組 10 0．171 ±0．009★△# 0．190 ±0．004★△#未治療組 8 0．175±0．008★ 0．193±0．011★對照組

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，各PIO干預(yù)組對DM大鼠的血鈣、磷水平均差異無統(tǒng)計學(xué)意義。最近一項臨床研究顯示，PIO干預(yù)對糖尿病患者的血鈣、磷指標(biāo)無顯著影響，與本研究結(jié)果一致［4］。各 PIO干預(yù)組對DM大鼠的24 h尿鈣水平均無顯著影響。考慮與以下因素有關(guān):①本實(shí)驗(yàn)DM大鼠模型近似于1型DM，PIO干預(yù)對血糖及胰島素敏感性均無顯著影響，因此，對DM大鼠尿糖增高的滲透性利尿及胰島素絕對缺乏造成的鈣鹽丟失無顯著影響。②可能PIO有與羅格列酮相似的作用抑制IGF－Ⅰ造成鈣鹽丟失。Sugimoto等［5］在體外實(shí)驗(yàn)以羅格列酮(1 μmol/L)作用于骨髓細(xì)胞(UAMS－33)，減少了胰島素樣生長因子－Ⅰ(IGF－Ⅰ)、IGF－Ⅱ、IGF結(jié)合蛋白(IGF－BP4)及IGF－Ⅰ受體、IGF－Ⅱ受體的表達(dá);體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以羅格列酮［(20 mg/(kg·d)］作用于B6鼠抑制了骨及肝臟IGF－Ⅰ水平。③PIO干預(yù)對DM大鼠腎臟有保護(hù)作用，因此，減弱了1α羥化酶受損造成的尿鈣重吸收減少。PIO干預(yù)對DM大鼠的24 h尿鈣水平影響是多種因素綜合影響的結(jié)果。

吡格列酮干預(yù)組無論低劑量或高劑量組分別與DM組相比，血清堿性磷酸酶水平均無統(tǒng)計學(xué)差異。這可能是因?yàn)橥ǔ２捎玫臏y定方法反映的是總堿性磷酸酶的水平。血清堿性磷酸酶來源廣泛，骨、肝、腸、腎等部位均可分泌，因而缺乏組織特異性。

結(jié)果提示，高劑量PIO組干預(yù)導(dǎo)致大鼠股骨及腰椎(L1－L4)骨密度均減少，而低劑量PIO組干預(yù)對大鼠骨密度未造成影響。既往有關(guān)TZDs對DM骨轉(zhuǎn)換及骨密度影響的研究較少且頗具爭議。Lecka-Czernik等［6］以羅格列酮［20 mg/(kg·d)］干預(yù)C57BL/6J(B6)鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)做出與本實(shí)驗(yàn)相一致的結(jié)果。也有認(rèn)為，TZDs改善血糖而減低了DM骨轉(zhuǎn)換，機(jī)體BMD增加，而這種骨轉(zhuǎn)換的減低發(fā)生在血糖改善之前，提示TZDs可能對骨有直接作用［7］。最近丹麥Syversen等給予未去除卵巢的完整雌鼠(Fischer－344)吡格列酮［35 mg/(kg·d)］，治療4個月發(fā)現(xiàn)大鼠股骨及腰椎骨密度均減低，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致［8］。一項研究顯示，小劑量吡格列酮［3 mg/(kg·d)］干預(yù)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠，不影響骨密度，骨吸收及骨代謝，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致［9］。Lecka-Czernik等［10］的骨髓干細(xì)胞培養(yǎng)與羅格列酮［20 mg/(kg·d)］干預(yù)C57BL/6J(B6)鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，大鼠骨小梁體積減少，通過骨形成速率減低造成骨量減少。也有研究顯示不同的結(jié)果。Syversen等［8］給予未去除卵巢的完整雌鼠(Fischer－344)吡格列酮35 mg/(kg·d)治療4個月發(fā)現(xiàn)大鼠骨小梁體積減少，該實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞培養(yǎng)也未能顯示任何與羅格列酮類似的影響前成骨細(xì)胞分化的作用，而僅表現(xiàn)為血清OPG減低，推測PPARγ激動劑可能主要對骨吸收起作用。有研究表明，這種結(jié)果差異可能與TZDs激活PPARγ的活性不同有關(guān)［11］。較為公認(rèn)的是，TZDs減低骨密度及形成“脂肪骨”，至少部分是因?yàn)殚g充質(zhì)細(xì)胞從骨生成方向脫離向脂肪生成分化［12］。

綜上所述，TZDs可能減低骨密度，宜小劑量使用，使用選擇性PPARγ調(diào)節(jié)劑(SPPARγMs)或許是將來的一個新的研究方向［13］。當(dāng)然，還需大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

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