何家璇，薛榮亮，呂建瑞，吳 剛，雷曉鳴(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科，西安 710004;通訊作者，E-mail:xbyw@163．com)

目前研究認(rèn)為，腦缺血再灌注損傷仍是多種因素或機(jī)制共同或先后作用的結(jié)果，其具體機(jī)制非常復(fù)雜。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族成員是連接細(xì)胞膜表面受體與決定性基因表達(dá)之間重要調(diào)節(jié)酶，對其成員之一細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)在腦缺血再灌注損傷中作用的研究結(jié)果仍不完全一致，在腦缺血再灌注致神經(jīng)元凋亡中ERK通路是何作用尚未定論。Bad(Bcl-xL/Bcl-2 associated death promoter，Bad)是 B 細(xì)胞淋巴瘤/白血?。?(B-cell leukemia-2，Bcl-2)蛋白家族中的促凋亡蛋白的一員，生理狀態(tài)下Bad蛋白以磷酸化狀態(tài)穩(wěn)定存在，而去磷酸化的游離Bad蛋白通過易位和一系列細(xì)胞活動(dòng)促進(jìn)凋亡的發(fā)生［1－3］。但Bad與ERK信號通路之間的關(guān)系如何目前報(bào)道甚少。本實(shí)驗(yàn)建立大鼠全腦缺血再灌注模型，應(yīng)用特異性抑制劑對ERK通路進(jìn)行干預(yù)，檢測磷酸化ERK和磷酸化Bad的表達(dá)變化及與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的關(guān)系，探討ERK對全腦缺血再灌注損傷后大鼠神經(jīng)元凋亡的作用及對凋亡調(diào)控蛋白Bad的影響。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

小鼠抗磷酸化Bad(Ser112)單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司，美國)，兔抗ERK單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司，美國)，PD98059(Cell Signaling Technology公司，美國)，TUNEL試劑盒購自德國寶靈曼公司，SP法免疫組化試劑盒購自北京中山生物技術(shù)公司。

1．2 動(dòng)物分組及模型的建立

選用健康雄性SD大鼠90只，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供，體重為(300±20)g。隨機(jī)分成三組，假手術(shù)組(sham，n=30)、全腦缺血再灌注組(IR，n=30)和 PD98059干預(yù)組(sham，n=30)，每組各設(shè)6個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別為再灌注后2，6，12，24，48，72 h，每組各時(shí)間點(diǎn)均為5只。采用大鼠四血管結(jié)扎法建立全腦缺血模型，大鼠全腦缺血5 min后進(jìn)行再灌注。IR組:所有動(dòng)物均以1%戊巴比妥鈉40 mg/kg行腹腔內(nèi)注射麻醉，待翻正反射消失后俯臥固定于手術(shù)臺上，在大鼠枕頸正中切開皮膚顯露枕后三角，在顯微鏡下于枕后三角外側(cè)與第一橫突之間找到椎動(dòng)脈博動(dòng)后，以25 mV電凝器凝斷雙側(cè)椎動(dòng)脈，逐層縫合，術(shù)畢回籠，使其體溫維持37℃左右。24 h后先將大鼠經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水(每只鼠給予0．3 mg/kg)，20 min后進(jìn)行夾閉頸總動(dòng)脈處理。以同樣方法麻醉，在胸鎖乳突肌后氣管旁，顯露頸總動(dòng)脈，用無創(chuàng)動(dòng)脈夾同時(shí)夾閉5 min，期間密切觀察其瞳孔變化，無瞳孔散大者予以剔除，逐層縫合后回籠，分別于再灌注后 2，6，12，24，48，72 h 以4%多聚甲醛灌注處死。PD組:將SD大鼠經(jīng)尾靜脈注射抑制劑PD98059(每只鼠給予0．3 mg/kg)20 min后進(jìn)行夾閉頸總動(dòng)脈處理，其他操作同IR組。sham組:除不凝斷椎動(dòng)脈和夾閉頸總動(dòng)脈外，其他處理同IR組。

1．3 組織學(xué)檢查

在再灌注后 2，6，12，24，48，72 h 各時(shí)點(diǎn)麻醉大鼠，于劍突下橫向剪開腹壁顯露膈肌，將其沿胸壁左右向剪開，將胸前壁離斷掀起，顯露心臟，用9號針從心尖插入心室，剪開右心房，先用生理鹽水然后再用4%多聚甲醛200 ml灌注至肝臟變白、四肢僵硬，斷頭取腦，在視交叉后1 mm及4 mm處冠狀切面切開，取中間塊，固定后石蠟包埋，在海馬齒狀回互包平面連續(xù)冠狀切片，片厚4 μm。HE染色光鏡(×400)觀察海馬CA1/CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)。

1．4 TUNEL 染色

采用德國寶靈曼公司的TUNEL試劑盒染色，參照試劑盒方法并做部分修改，同時(shí)設(shè)立陽性(加DNaseⅠ，1 mg/L)和陰性對照(不加TdT)組。光鏡觀察顯示細(xì)胞核有明顯的黃棕色顆?；虬咂瑸殛栃约?xì)胞，即凋亡細(xì)胞。定量分析方法為:光鏡下計(jì)算凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)。計(jì)算方法:每只動(dòng)物隨機(jī)兩張切片，每張切片觀察CA1或CA3區(qū)，分別計(jì)算各區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù):AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1．5 免疫組化染色

鼠抗磷酸化Bad單克隆稀釋度為1∶150，兔抗ERK單克隆稀釋度為1∶100。等稀釋度的兔抗IgG做陰性對照。切片依次脫蠟至水，3%過氧化氫孵育10 min，三蒸水洗5 min×3次。PBS(pH 7．4)浸泡5 min，微波爐抗原修復(fù)15 min。自然冷卻至室溫。滴加封閉血清，室溫孵育1 h，傾去勿洗。滴加1∶100的p-ERK、p-Bad抗體，放入4℃冰箱過夜。PBS沖洗5 min×3，擦干組織周圍水分，滴加生物素標(biāo)記的二抗，60℃孵育30 min;三蒸水洗5 min×3次，擦凈切片周圍水分后，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，放入37℃溫箱孵育20 min。三蒸水洗5 min×3次，DAB顯色，脫水、透明、封片。

1．6 圖像分析

切片采用Leica Qunatimet570圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。取每張切片CA1區(qū)、CA3區(qū)各測5個(gè)相同單位面積取平均灰度值。灰度值越高則表達(dá)越弱。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2．1 HE染色觀察神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)

高倍鏡下各時(shí)點(diǎn)可見假手術(shù)組大鼠海馬錐體細(xì)胞排列整齊，形態(tài)完整;缺血組神經(jīng)元細(xì)胞腫脹，分布不均，細(xì)胞周圍間隙增寬，有的細(xì)胞體積縮小，核固縮深染。PD組神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，細(xì)胞間質(zhì)水腫明顯。

2．2 TUNEL染色檢測神經(jīng)元細(xì)胞凋亡

TUNEL法檢測發(fā)現(xiàn)IR組在缺血再灌注后6 h凋亡細(xì)胞開始增加，主要位于CA1區(qū)，24－48 h為高峰，至72 h明顯減少。各時(shí)間點(diǎn)CA1區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)多于CA3區(qū)(P＜0．05)。PD組于各時(shí)間點(diǎn)各區(qū)凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)多于IR組(P＜0．05，見表1)。

表1 SD大鼠缺血再灌注后各時(shí)點(diǎn)CA1區(qū)和CA3區(qū)凋亡指數(shù)(±s，%)Table 1 Apoptosis index in CA1 and CA3 of SD rats after ischemia reperfusion(±s，%)

表1 SD大鼠缺血再灌注后各時(shí)點(diǎn)CA1區(qū)和CA3區(qū)凋亡指數(shù)(±s，%)Table 1 Apoptosis index in CA1 and CA3 of SD rats after ischemia reperfusion(±s，%)

與 sham 組比較，*P ＜0．05;與 IR 組比較，ΔP ＜0．05;與 CA1比較，#P ＜0．05

組別2 h 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h CA1區(qū)sham 組 0．25 ±0．50 1．49 ±0．67 1．51 ±0．65 1．57 ±0．78 2．14 ±0．48 1．65 ±0．63 IR 組 2．54 ±0．38 14．42 ±4．25* 29．24 ±6．08* 41．32 ±7．30* 38．94 ±7．32* 21．36 ±5．07*PD 組 5．63 ±0．84 29．76 ±5．13*Δ 43．57 ±7．11*Δ 60．08 ±7．68*Δ 53．31 ±7．36*Δ 31．06 ±6．56*Δ CA3區(qū)sham 組 0．25 ±0．50 1．49 ±0．67 1．51 ±0．65 1．57 ±0．78 2．14 ±0．48 1．65 ±0．63 IR 組 1．33 ±0．29 9．05 ±3．12*# 20．57 ±6．08*# 33．75 ±6．12*# 30．13 ±6．34*# 15．03 ±4．22*#PD 組 4．04 ±0．70 23．32 ±6．02*Δ# 31．26 ±6．10*Δ# 49．87 ±7．26*Δ# 42．82 ±7．21*Δ# 22．64 ±6．10*Δ#

2．3 免疫組化染色檢測p-ERK及p-Bad的表達(dá)

p-ERK染色陽性表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)，呈現(xiàn)淺棕黃色顆粒狀。p-ERK在sham組各時(shí)點(diǎn)海馬CA3區(qū)細(xì)胞核內(nèi)無表達(dá)，胞質(zhì)內(nèi)極少表達(dá)，CA1區(qū)表達(dá)弱于CA3區(qū)(P＜0．05，見表2);IR組各時(shí)點(diǎn)在海馬CA1區(qū)p-ERK均未見表達(dá)，CA3區(qū)于再灌注后2 h可見細(xì)胞核內(nèi)有微弱的表達(dá)，于再灌注6 h后逐漸下降，至再灌注后48 h未見表達(dá)。PD組CA1區(qū)、CA3區(qū)均未見著色。

p-Bad在sham組各時(shí)間點(diǎn)可見表達(dá);IR組于再灌注后2 h在CA3區(qū)可見p-Bad表達(dá)，之后逐漸減弱，再灌注后24 h后未見，CA3區(qū)表達(dá)均強(qiáng)于CA1區(qū)(P＜0．05);IR組各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均弱于sham組(P＜0．05);PD組p-Bad各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均弱于IR組(P＜0．05)，再灌注后2 h及6 h可見微弱表達(dá)，之后時(shí)間點(diǎn)未見表達(dá)，CA3區(qū)表達(dá)均強(qiáng)于CA1區(qū)(P ＜0．05，見表3)。

表2 SD大鼠缺血再灌注后各時(shí)點(diǎn)CA1區(qū)和CA3區(qū)p-ERK灰度值Table 2 The p-ERK gray value in CA1 and CA3 of SD rats after ischemia reperfusion

表3 SD大鼠缺血再灌注后各時(shí)點(diǎn)CA1區(qū)和CA3區(qū)p-Bad灰度值Table 3 The p-Bad gray value in CA1 and CA3 of SD rats after ischemia reperfusion

3 討論

MAPK家族成員是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)一組進(jìn)化保守的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)酶類，作為重要的信號傳遞途徑之一，其連接細(xì)胞膜表面受體與決定性基因的表達(dá)，被認(rèn)為是任何胞外刺激由胞外向胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的跨膜信號通路的交匯點(diǎn)。ERK是MAPK家族的一員，引起ERK激活的細(xì)胞外信號主要是生長因子等有絲分裂刺激，它的信號傳遞途徑是涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、發(fā)育及分裂的信號網(wǎng)絡(luò)的核心。研究表明ERK途徑在多種疾病包括腦缺血再灌注損傷過程中發(fā)揮著重要作用。迄今為止，在重要臟器的缺血/再灌注損傷研究中，均發(fā)現(xiàn)在損傷早期伴有ERK蛋白激酶的激活。但其在腦缺血中的表達(dá)及作用研究結(jié)果不一。PD98059是作用于ERK通路中ERK上游的蛋白激酶MEK(MAPK/ERK激酶)的特異性抑制劑，其特異性地抑制ERK的磷酸化而阻斷此通路的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

腦缺血再灌注損傷可誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡［4－7］，并激活一些基因及其表達(dá)產(chǎn)物，通過對促細(xì)胞凋亡基因和抑制細(xì)胞凋亡基因的調(diào)控發(fā)揮作用。從目前巳知的細(xì)胞凋亡機(jī)制看，線粒體功能異常是重要的通路，而該通路與Bcl-2家族蛋白有著密切關(guān)系［8］。在凋亡誘導(dǎo)因素的刺激下，細(xì)胞的跨膜或者胞內(nèi)信號通路將被啟動(dòng)，此時(shí)相對線粒體來說，Bad蛋白的磷酸化和非磷酸化將成為一個(gè)檢查點(diǎn)(check piont)。線粒體膜表面分別存在著Bax同型二聚體，非磷酸化的Bad將直接導(dǎo)致Bax的單聚化，從而形成線粒體的Ca2+內(nèi)流和細(xì)胞色素C外流的交換通道，這將導(dǎo)致膜電勢降低、ATP形成不足及下游的caspapse活化［9］;而磷酸化的Bad則可能誘導(dǎo)Bax的單聚化，從而失去作為凋亡誘導(dǎo)信號的功能［10］。據(jù)報(bào)道［11］，地塞米松刺激下，ERK通路被顯著抑制。其結(jié)果是，Bcl-2等抗凋亡活性蛋白失去ERK的磷酸化激活，從而加速了凋亡過程的發(fā)生，且由于Bad蛋白不能被磷酸化，故導(dǎo)致下游的線粒體膜電勢的崩潰和ATP形成不足，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等Ca2+庫不能維持正常的功能，游離Ca2+流入胞質(zhì)，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡。

Bad是Bcl-2蛋白家族中的促凋亡蛋白的一員，正常生理狀態(tài)下磷酸化的Bad與其分子伴侶蛋白14－3－3結(jié)合組成無活性的復(fù)合物［8，9］。接受凋亡刺激后，Bad去磷酸化，去磷酸化的Bad與分子伴侶蛋白解離，Bad從構(gòu)成性結(jié)合的Bcl-XL-Bax二聚體中置換并釋放促凋亡的Bax［3］，Bax移位到線粒體，促使線粒體釋放cytC，引起caspase級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［11］?？傊?，穩(wěn)定狀態(tài)的磷酸化Bad蛋白發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)，而去磷酸化的游離Bad蛋白通過易位和一系列細(xì)胞活動(dòng)促進(jìn)凋亡的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腦缺血再灌注后ERK在SD大鼠海馬缺血耐受區(qū)CA3區(qū)表達(dá)而缺血敏感區(qū)CA1區(qū)未見表達(dá)，應(yīng)用ERK通路抑制劑后，CA1區(qū)凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目增加，同時(shí)發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)的磷酸化Bad蛋白在CA1區(qū)表達(dá)減弱，這一結(jié)果更加支持了ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抗凋亡作用。王耀岐等［13］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)5 min腦缺血使對缺血敏感的海馬CA1區(qū)p-JNK表達(dá)增加，p-ERK無明顯表達(dá)，CA3區(qū)存活的神經(jīng)元上有p-ERK的表達(dá)，而p-JNK的表達(dá)較弱，他們認(rèn)為CA1區(qū)缺乏保護(hù)信號而增強(qiáng)有害信號的表達(dá)可能是腦缺血后神經(jīng)元延遲性死亡的重要機(jī)制。我們研究結(jié)果與此一致，提示ERK可能參與了腦缺血后的細(xì)胞保護(hù)，因此缺血敏感的CA1區(qū)缺乏保護(hù)性信號，應(yīng)用抑制劑后保護(hù)性信號表達(dá)更加減少，凋亡細(xì)胞增加;對缺血耐受的CA3區(qū)保護(hù)性信號表達(dá)強(qiáng)于CA1區(qū)，應(yīng)用抑制劑后保護(hù)性信號表達(dá)也減輕。Hu等［14］用 Western blot和激光共聚焦顯微鏡在大鼠腦缺血模型上觀察15 min腦缺血后MAPK的活性變化，發(fā)現(xiàn)缺血再灌注后30 min和4 h在耐受缺血的CA3/DG區(qū)細(xì)胞核有p-ERK表達(dá)，在死亡的CA1區(qū)神經(jīng)元無表達(dá)。而JNK的底物c-Jun卻在CA1區(qū)選擇性表達(dá)，提示ERK參與缺血后的細(xì)胞保護(hù)，JNK介導(dǎo)了神經(jīng)元損傷。我們的研究結(jié)果也與這些報(bào)道一致。ERK激活后通過信號傳導(dǎo)，活化細(xì)胞核內(nèi)不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，進(jìn)而使細(xì)胞出現(xiàn)增殖、分化或凋亡。本實(shí)驗(yàn)中IR組較sham組ERK表達(dá)增強(qiáng)，也提示我們?nèi)毖俟嘧⒑驟RK活性的增加參與了促進(jìn)細(xì)胞存活的保護(hù)性機(jī)制，可能是缺血刺激引起的膠質(zhì)細(xì)胞釋放生長因子等機(jī)制所致。

綜上所述，通過本研究我們認(rèn)為ERK通路參與了缺血后神經(jīng)元的保護(hù)，是腦缺血再灌注時(shí)神經(jīng)元的存活通路;特異性抑制劑使得ERK通路發(fā)生變化并影響凋亡調(diào)控蛋白Bad的表達(dá)，抗凋亡效應(yīng)的磷酸化Bad蛋白表達(dá)減少，也從另一方面說明ERK參與了缺血后神經(jīng)元的保護(hù)。磷酸化ERK和磷酸化Bad在抑制劑組表達(dá)下降且變化一致，同時(shí)細(xì)胞凋亡增加并達(dá)到高峰，說明ERK信號通路可能通過抑制Bad的磷酸化抗凋亡形式向去磷酸化促凋亡形式的轉(zhuǎn)變，參與到細(xì)胞凋亡的線粒體途徑中發(fā)揮抗調(diào)亡機(jī)制，參與腦缺血再灌注時(shí)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)。

［1］Datta SR，Dudek H，Tao X，et al．Akt phosphorylation of BAD couples survival signals to the cell-intrinsic death machinery［J］．Cell，1997，91(2):231－241．

［2］Tan Y，Demeter MR，Ruan H，et al．BAD Ser－155 phosphorylation regulates BAD/Bcl-XL interaction and cell survival［J］．J Biol Chem，2000，275(33):25865－25869．

［3］Yang E，Zha J，Jockel J，et al．Bad，a heterodimeric partner for Bcl-XL and Bcl-2，displaces Bax and promotes cell death［J］．Cell，1995，80(2):285－291．

［4］薛榮亮，紀(jì)娜，高靜，等．茶多酚對大鼠全腦缺血再灌注損傷的影響［J］．中華麻醉學(xué)雜志，2011，31(9):1117－1119．

［5］吳剛，薛榮亮，呂建瑞，等．全腦缺血再灌注后Fas、TNFR1蛋白的表達(dá)與細(xì)胞凋亡的關(guān)系及Bcl-2過度表達(dá)對其的影響［J］．中華麻醉學(xué)雜志，2011，31(8):1298－1303．

［6］趙紫玉，薛榮亮，呂建瑞，等．急性等容量血液稀釋對大鼠全腦缺血再灌注時(shí)海馬組織細(xì)胞凋亡的影響［J］．中華麻醉學(xué)雜志，2012，32(2):201－203．

［7］曹瑞琪，李雪卿，吳文浩，等．酸敏感離子通道在大鼠全腦缺血再灌注損傷中的作用［J］．中華麻醉學(xué)雜志，2011，31(1):108－111．

［8］Gross A，Mc Donnell JM，Korsmeyer SJ．Bcl-2 family members and the mitochondria lcomplex that integrates glycolysis and apoptosis［J］．Genes Dev，1999，13(15):1899－1991．

［9］Danial NN，Gramm CF，Scorrano L，et al．BAD and glucokinase reside in a mitochondrial complex that integrates glycolysis and apoptosis［J］．Nature，2003，424(6951):952－956．

［10］Datta SR，Ranger AM，Lin MI，et al．Survival factor mediated BAD phosphorylation raises the mitochondrial threshold for apoptosis［J］．Dev Cell，2002，3(5):631－643．

［11］馬蓮環(huán)，劉建．ERK1/2的研究進(jìn)展［J］．國外醫(yī)學(xué)生理、病理科學(xué)與臨床分冊，2005，25(3):279－282．

［12］Wei MC，Zong WX，Cheng EH，et al．Proapoptotic BAX and BAK:a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death［J］．Science，2001，292(5517):727－730．

［13］王耀岐，李軍，曹紅，等．ERK和JNK通路在沙土鼠腦缺血預(yù)處理中的表達(dá)及作用［J］．中國藥理學(xué)通報(bào)，2006，22(3):337－340．

［14］Hu BR，Liu CL，Park DJ．Alteration of MAP kinase pathways after transient forebrain ischemic［J］．J Cereb Blood Flow Metab，2000，20(7):1089－1095．