楊振泉，張咪，王曉霖，梅秋艷，周海波

(揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚(yáng)州，225127)

蔬菜泡制不僅是一種良好的蔬菜保藏途徑，而且形成的泡菜產(chǎn)品清淡爽口、具有獨(dú)特的風(fēng)味。蔬菜泡制可以直接添加有機(jī)酸進(jìn)行酸化，也可以通過微生物厭氧發(fā)酵酸化，我國泡菜主要是通過后者形成［1］。發(fā)酵酸化不僅對(duì)蔬菜的營養(yǎng)物質(zhì)破壞較小，而且發(fā)酵過程中形成的多種氨基酸、維生素、酶，以及對(duì)人體健康有益的乳酸菌可以提高發(fā)酵蔬菜的營養(yǎng)價(jià)值［2-3］。泡菜發(fā)酵中鹽濃度控制是產(chǎn)品品質(zhì)和安全性的重要影響因素。高濃度鹽產(chǎn)生的高滲透壓作用能夠使微生物細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離，導(dǎo)致微生物生長抑制或者死亡，從而有效控制蔬菜中有害微生物的數(shù)量［4］。另一方面，高濃度的鹽對(duì)蔬菜攜帶的發(fā)酵菌區(qū)系(主要是乳酸菌)的生長繁殖產(chǎn)生抑制，導(dǎo)致產(chǎn)酸量減少，發(fā)酵周期延長［5］。近年來接種發(fā)酵技術(shù)被應(yīng)用于泡菜的生產(chǎn)，接種純?nèi)樗峋蛘邚?fù)合菌種發(fā)酵劑比自然發(fā)酵產(chǎn)酸的能力強(qiáng)，大大縮短了泡菜的生產(chǎn)周期，保持了產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性［6-7］。篩選繁殖快、產(chǎn)酸能力強(qiáng)并且對(duì)發(fā)酵蔬菜環(huán)境適應(yīng)性好的菌種是制備高品質(zhì)泡菜發(fā)酵劑的前提。微生物的耐鹽脅迫能力與其在含鹽環(huán)境中的繁殖和代謝能力密切相關(guān)［8-10］，研究耐鹽性微生物在泡菜發(fā)酵過程中的消長規(guī)律可以指導(dǎo)泡菜工藝的改進(jìn)，同時(shí)有利于獲得適合不同鹽含量泡菜發(fā)酵的優(yōu)良菌種。本文研究了不同鹽濃度的泡菜在自然發(fā)酵過程中pH值、菌落總數(shù)、大腸菌群以及乳酸菌數(shù)的變化規(guī)律，并對(duì)高鹽泡菜中的乳酸菌進(jìn)行分離鑒定，探討不同分離株在蔬菜汁模型中耐NaCl脅迫能力與產(chǎn)酸特性，為提高不同鹽度泡菜發(fā)酵產(chǎn)酸速度、縮短成熟周期提供合適菌種。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

泡菜制備所需新鮮胡蘿卜、黃瓜、白菜以及食鹽均采購于揚(yáng)州當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂、MRS培養(yǎng)基均為廣州環(huán)凱生物試劑有限公司產(chǎn)品;分子生物學(xué)試劑蛋白酶 K、10 ×Buffer、dNTPs、Taq酶、DNA Marker等購自上海生工生物工程有限公司;細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增引物8F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和 15R:5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’，由上海生工生物工程有限公司合成;其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

PHS-3C pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;FP-110-C自動(dòng)生長曲線分析儀，芬蘭Bioscreen公司;XSP-BM-12CAC顯微鏡，上海彼愛姆光學(xué)儀器制造公司;UV-2401PC紫外分光光度計(jì)，日本島津公司;TG16-WS型臺(tái)式高速離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司;DGX-9053B-2型生化培養(yǎng)箱，上海福瑪實(shí)驗(yàn)有限公司;PTC-100型PCR儀，美國MJ公司;DYY-SB型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，北京市六一儀器廠;Tanon-2500凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 泡菜自然發(fā)酵

挑選新鮮、沒有蛀蟲及腐爛現(xiàn)象的蔬菜，切除頭部用清水洗凈、晾干。將白菜和配料切成3～4 cm的長條或薄片，混合均勻，放入泡菜壇，壓實(shí)。將已經(jīng)冷卻的20 g/L和80 g/L的鹽水倒入壇中，鹽水高出料面2 cm，將泡菜壇的蓋緊，在室溫下自然發(fā)酵，定期取樣分析，第1天的0～12 h每隔2 h取樣1次，24 h后每隔1天取樣1次。

1.2.2 pH值測(cè)定

用無菌吸量管取10 mL的泡菜鹵水，用pH計(jì)測(cè)量泡菜的pH值，取3組平行的平均值描述泡菜pH隨時(shí)間的變化趨勢(shì)。

1.2.3 菌落總數(shù)測(cè)定

無菌吸取泡菜鹵水1 mL注入含有9 mL滅菌生理鹽水的試管中，經(jīng)充分振搖后做成1∶10的均勻稀釋液。再按上述方法，做10倍遞增稀釋。選擇5個(gè)適宜的稀釋度，取250 μL的稀釋液于營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)培養(yǎng)皿，將營養(yǎng)肉湯瓊脂板倒置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，人工計(jì)數(shù)并計(jì)算菌落總數(shù) (CFU/mL)。

1.2.4 大腸菌群測(cè)定

無菌吸取泡菜鹵水1 mL注入含有9 mL滅菌生理鹽水的試管中，經(jīng)充分振搖后做成1∶10的均勻稀釋液，10倍遞增稀釋。選擇3個(gè)合適的稀釋度接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，每個(gè)稀釋度接種3管，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。產(chǎn)氣管劃線接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，挑取典型菌落做革蘭氏染色和證實(shí)試驗(yàn)，根據(jù)大腸菌群陽性管數(shù)，查MPN檢索表報(bào)告大腸菌群的最大可能數(shù)(MPN/100 mL)。

1.2.5 乳酸菌分離與鑒定

1.2.5.1 乳酸菌的計(jì)數(shù)與分離

發(fā)酵鹵水樣品充分混勻后用滅菌生理鹽水10倍稀釋。吸取250 μL不同稀釋度樣品液涂布含有0.75%CaCO3的MRS平板，放入?yún)捬豕蓿?7℃恒溫培養(yǎng)48 h，選擇分離程度較好的平板對(duì)有溶鈣圈的菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算乳酸菌數(shù)量(CFU/mL)。取菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢細(xì)胞形態(tài)，挑取單菌落在MRS平板上反復(fù)劃線純化，挑取單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng)24 h后，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5.2 乳酸菌生理生化鑒定

按文獻(xiàn)［11］所述的方法對(duì)接觸酶陰性、產(chǎn)酸的革蘭氏陽性菌進(jìn)行耐鹽性、溫度、耐酸堿、動(dòng)力學(xué)以及糖和氨基酸發(fā)酵試驗(yàn)，細(xì)菌的細(xì)胞微觀形態(tài)采用顯微鏡拍攝觀察。

1.2.5.3 16S rDNA擴(kuò)增及測(cè)序鑒定

乳酸菌基因組DNA的提取方法參照文獻(xiàn)［12］所述的CTAB法提取。以基因組DNA為模板進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(50 μL)包括:模板(50 ng/μL)2.0 μL、dNTPs(10 mmol/L)2.0 μL、25 pmol/μL 引物 8F 和 15R 各 2.0 μL、10 × Buffer 5.0 μL、MgCl2(25 mmol/L)2.0 μL、Tag 酶(5 U/μL)0.3 μL，最后加 ddH2O 補(bǔ)足至 50 μL。熱循環(huán)參數(shù)為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性40 s，50℃退火50 s，72℃延伸2.0 min，35次循環(huán);72℃延伸10 min。取7.0 μL PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)片段大小，其余PCR產(chǎn)物委托上海生物工程有限公司測(cè)序，所得序列在GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行在線比對(duì)，序列同源性大于99%設(shè)為相同種。

1.2.6 乳酸菌在不同鹽濃度黃瓜汁中的生長曲線測(cè)定

從-70℃冰箱里取出菌種，0℃解凍，無菌吸取200 μL菌液于5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)36 h后取培養(yǎng)物劃線接種MRS固體平板，37℃厭氧培養(yǎng)36 h，挑取單菌落接種于培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，離心取菌體，滅菌生理鹽水洗滌2次后，調(diào)節(jié)OD600nm=0.5。取菌懸液進(jìn)行梯度稀釋后涂布MRS平板，37℃厭氧培養(yǎng)36 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。分別取15 mL澄清透明的黃瓜汁(50%，V/V)于7根試管中，分別加入0、0.3、0.6、0.9、1.2 和 1.5 g NaCl于試管中振蕩溶解，用0.45 μm濾器過濾除菌，分裝備用。取20 μL不同菌懸液接種2.0 mL不同NaCl濃度的黃瓜汁中充分混勻，轉(zhuǎn)移至多孔培養(yǎng)板，每孔400 μL，每樣3孔平行，未接種黃瓜汁作為空白對(duì)照;將接菌后的培養(yǎng)板蓋上蓋子，放入Bioscreen自動(dòng)生長曲線分析儀中，參數(shù)設(shè)置為30℃培養(yǎng)60 h，波長580 nm，每60 min讀取1次數(shù)據(jù)。以O(shè)D580nm平均值為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.2.7 乳酸菌的生長動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算

生長動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算參考文獻(xiàn)［13］進(jìn)行，通過Sigmaplot 10.0軟件中的非線性擬合程序中的參數(shù)Gompertz模型對(duì)生長曲線進(jìn)行擬合，擬合方程轉(zhuǎn)換成Nt=A+C ×exp{-exp［-B(t-M)］}，菌株最大生長速度μmax=B×C/e，其中e取2.718，單位h-1;最大群體密度Nmax=A+C，單位OD580nm。

1.2.8 乳酸菌分離株產(chǎn)酸能力測(cè)定

乳酸菌復(fù)蘇、培養(yǎng)以及懸液制備同1.2.6，將用于自然發(fā)酵的泡菜原料勻漿制成蔬菜汁培養(yǎng)基，起始鹽濃度為8%(W/V)，每管分裝15 mL用于接種發(fā)酵，每管接種濃度分別為106和108CFU/mL，分為對(duì)照組(未接種);M0、M1、M3、M4和 M6單獨(dú)接種組;M0+M3(1∶3)、M0+M3(1∶1)、M0+M3(3∶1)、M0+M6(1∶3)、M0+M6(1∶1)和 M0+M6(3∶1)組合接種組。每隔24 h各取3管測(cè)量pH，取平均值描述pH隨發(fā)酵時(shí)間的變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 鹽含量對(duì)泡菜發(fā)酵過程中pH值變化的影響

對(duì)低鹽和高鹽泡菜在發(fā)酵過程中pH值變化的測(cè)定結(jié)果如圖1所示。高濃度鹽(8.0%)可明顯減緩泡菜的pH值的下降，延長泡菜的發(fā)酵周期。一般來說，泡菜液pH值達(dá)到3.5～3.8即可認(rèn)為泡菜已發(fā)酵成熟［14］。本研究中起始鹽含量為2.0%的泡菜產(chǎn)酸速度較快，在24 h鹵水pH下降了3.0個(gè)單位，發(fā)酵72 h后pH維持在3.5左右;而起始鹽含量8%的泡菜產(chǎn)酸速度顯著減小，發(fā)酵至144 h鹵水pH值才降低到3.6，結(jié)果表明高濃度鹽抑制了乳酸菌的生長代謝，導(dǎo)致酸化速度減慢。

圖1 鹽含量對(duì)泡菜發(fā)酵過程中pH變化的影響Fig.1 The effect of salt concentration on pH change during pickle fermentation

2.2 鹽含量對(duì)泡菜發(fā)酵過程中菌落總數(shù)變化的影響

對(duì)不同鹽含量的泡菜在發(fā)酵過程中的菌落總數(shù)變化測(cè)定結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示鹽含量為2%的泡菜的起始菌落總數(shù)為6.92 lg CFU/mL，發(fā)酵24 h菌落總數(shù)上升至8.05 lg CFU/mL，之后隨著pH下降菌落總數(shù)迅速下降到4.45 lg CFU/mL，表明有機(jī)酸的產(chǎn)生使酸敏感菌群迅速下降。在鹽含量為8%的泡菜鹵水中，起始菌落總數(shù)為3.11 lg CFU/mL，隨發(fā)酵進(jìn)行(0～120 h)菌落總數(shù)緩慢上升到5.56 lg CFU/mL，在144 h開始下降，最終降到4.67 lg CFU/mL。結(jié)果表明:盡管8.0%NaCl導(dǎo)致原料中鹽敏感細(xì)菌的死亡，減少細(xì)菌的初始數(shù)量，但耐鹽性細(xì)菌在8.0%NaCl條件下仍會(huì)緩慢生長，同時(shí)高濃度鹽也抑制了乳酸菌的生長和產(chǎn)酸，最終導(dǎo)致菌落總數(shù)下降趨勢(shì)并不明顯。

圖2 鹽含量對(duì)泡菜發(fā)酵過程中菌落總數(shù)變化的影響Fig.2 The effect of salt concentration on the total number of colonies during pickle fermentation

2.3 鹽含量對(duì)泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌總數(shù)變化的影響

應(yīng)用改良的MRS平板厭氧培養(yǎng)法測(cè)定泡菜鹵水中的乳酸菌總數(shù)變化，結(jié)果如圖3所示。

圖3 鹽含量對(duì)泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌總數(shù)的影響Fig.3 The effect of salt concentration on the lactic acid bacteria number during pickle fermentation

起始鹽含量為2.0%和8.0%泡菜在發(fā)酵過程中乳酸菌數(shù)量變化趨勢(shì)存在明顯差異。在起始鹽含量為2.0%的泡菜中，乳酸菌數(shù)量總體上呈先增大后減小的趨勢(shì)，起始數(shù)量為5.89 lg CFU/mL，發(fā)酵24 h后上升到最高(8.21 lg CFU/mL)，72 h開始逐漸下降，到192 h減低至5.35 lg CFU/mL，表明發(fā)酵后期有機(jī)酸的累積導(dǎo)致部分兼性厭氧菌的消亡。而8%鹽濃度的泡菜在發(fā)酵0～144 h階段，乳酸菌濃度從起始2.92 lg CFU/mL上升到7.85 lg CFU/mL，隨后緩慢下降，至192 h減低到6.93 lg CFU/mL。結(jié)果表明，高濃度的鹽抑制了泡菜原料中攜帶的鹽敏感性菌群及乳酸菌的生長速度，但原料中存在的部分耐鹽性乳酸菌仍然能夠生長和產(chǎn)酸。

2.4 鹽含量對(duì)泡菜發(fā)酵過程中大腸菌群變化的影響

對(duì)高鹽和低鹽泡菜發(fā)酵過程中大腸菌群測(cè)定結(jié)果如表1所示。不同鹽含量泡菜發(fā)酵過程中大腸菌群數(shù)量隨時(shí)間變化趨勢(shì)均呈先增大后減小的趨勢(shì)，在NaCl濃度為2.0%泡菜中，起始大腸菌群數(shù)為110 000 MPN/100 g，第24 h上升到最高(2.4×107MPN/100g)，隨后逐漸下降到40 MPN/100 g;在NaCl濃度為8.0%泡菜中，起始大腸菌群數(shù)為﹤30，第72 h＞24 000，在96～192 h逐漸下降到 90 MPN/100 g，基本趨勢(shì)與菌落總數(shù)的變化一致。結(jié)果表明8.0%NaCl對(duì)大腸菌群中的大多數(shù)種屬具有抑制作用，但也存在少數(shù)耐鹽性菌群早期緩慢生長，發(fā)酵后期隨著酸度增加逐漸消亡，產(chǎn)酸速度是影響大腸菌群數(shù)量的主要因素。

表1 鹽濃度對(duì)泡菜發(fā)酵過程中大腸菌群的影響Table 1 The effect of salt concentration on coliform during pickle fermentation

2.5 乳酸菌分離與生理生化鑒定結(jié)果

從8%NaCl泡菜鹵水中分離得到5株乳酸菌，分別為 M0、M1、M3、M4和 M6，所有菌株革蘭氏染色均為陽性，無芽孢，其中M0為球菌，其余4株均為桿菌，參照常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)［11］中乳酸菌的特征進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示，M0各項(xiàng)特征與屎腸球菌(Enterococcus faecium)相符，M1、M3、M4 和M6符合植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)的特征描述。

表2 乳酸菌分離株的生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical characteristics of lactic acid bacteria isolates

2.6 乳酸菌的16S rDNA測(cè)序鑒定結(jié)果

以5株乳酸菌分離株的基因組DNA為模板，應(yīng)用引物8F和15R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果擴(kuò)增產(chǎn)物大小均在1500 bp左右。將16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果在GenBank上進(jìn)行Blasten對(duì)比分析，結(jié)果如表3所示，M0 為屎腸球菌(Enterococcus faecium)，M1、M3、M4和M6均鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)，序列同源性均大于99%，結(jié)果與生理生化鑒定結(jié)果一致。已有的研究結(jié)果顯示泡菜中存在著豐富的乳酸菌種群，主要包括乳桿菌屬、腸球菌屬、葡萄球菌屬、片球菌屬以及明串珠菌屬等，其中植物乳桿菌為優(yōu)勢(shì)菌［15］。本研究中從8%NaCl泡菜發(fā)酵鹵水中分離到屎腸球菌和植物乳桿菌，表明這兩個(gè)種群的一些菌株具有較高的耐鹽性。

表3 分離株16S rDNA序列同源性分析結(jié)果Table 3 Results of 16S rDNA sequence homology analysis for isolates

2.7 乳酸菌分離株在不同鹽濃度蔬菜汁模型中的生長動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定結(jié)果

將乳酸菌分離株E.faecium M0和L.plantarum M1、M3、M4和M6按1.0%接種量接種不同NaCl含量的黃瓜汁，應(yīng)用Bioscreen自動(dòng)生長曲線分析儀測(cè)定60 h生長曲線(結(jié)果未列出)，通過Gompertz方程擬合曲線計(jì)算最大生長速率(μmax)和最大群體密度(Nmax)結(jié)果如表4所示。結(jié)果表明NaCl對(duì)乳酸菌的生長能力具有明顯的抑制作用，4%NaCl對(duì)大多數(shù)菌株顯示出明顯的抑制，使μmax和Nmax顯著下降，隨著NaCl濃度升高，生長抑制作用逐步增強(qiáng)。不同菌株具有不同的耐鹽特征，其中E.faecium M0生長快、耐鹽性最好，在2.0%NaCl的黃瓜汁中生長最快(μmax=0.064 h-1，Nmax=0.588)，隨著 NaCl濃度的上升，μmax和Nmax逐漸下降，但最終能在10%NaCl黃瓜汁中顯示了微弱的生長(μmax=0.006 h-1，Nmax=0.185);L.plantarum生長速度相對(duì)較慢，耐鹽性較弱，但具有菌株差異性，在8%NaCl的黃瓜汁中M4不能生長，M1顯示了微弱生長(μmax=0.007，Nmax=0.122)，而M3和 M6能較好的生長，μmax值分別為0.016和0.015 h-1。

表4 起始NaCl濃度對(duì)不同乳酸菌分離株的生長動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響Table 4 The influence of initial NaCl concentration on the growth kinetic parameters of different lactic acid bacteria isolates

乳酸菌對(duì)NaCl的耐受能力具有種屬特異性，研究表明植物乳桿菌能耐受9.1%NaCl［16］，但是細(xì)菌對(duì)鹽的耐受性取決于菌株及其生理狀態(tài)［17］。本研究中發(fā)現(xiàn)L.plantarum M3和M6能在8.0%NaCl的黃瓜汁中較好的生長，但M1生長微弱，M4不能生長，在不同鹽濃度下最大生長速率和群體密度也顯著不同，表明植物乳桿菌菌株之間對(duì)NaCl的耐受能力存在差異。腸膜明串珠菌是泡菜發(fā)酵中的優(yōu)勢(shì)菌，但研究顯示6.4%NaCl就能抑制腸膜明串珠菌生長［16］，屎腸球菌屬于同型發(fā)酵乳酸菌，產(chǎn)酸快，被廣泛用于改善食品、飼料的質(zhì)量［18-19］。本研究發(fā)現(xiàn)M0生長快、耐鹽性最好，能在10%NaCl黃瓜汁中生長，在高鹽泡菜發(fā)酵早期屎腸球菌可能發(fā)揮了重要作用。

2.8 分離株及其組合接種發(fā)酵對(duì)泡菜pH變化的影響

以8%NaCl蔬菜汁作為模型，以自然發(fā)酵作為對(duì)照，研究了接種106CFU/mL和108CFU/mL單菌種增效發(fā)酵后的酸化趨勢(shì)，結(jié)果乳酸菌接菌量為106CFU/mL組與未接乳酸菌的自然發(fā)酵的pH值下降趨勢(shì)沒有顯著區(qū)別(結(jié)果未列出)。當(dāng)乳酸菌接種量為108CFU/mL時(shí)，pH值下降顯著快于對(duì)照組。接入球菌M0蔬菜汁在起始48 h內(nèi)，pH值下降顯著快于3株植物乳桿菌，但在48 h之后，M0產(chǎn)酸減弱，但其余3株植物乳桿菌產(chǎn)酸增強(qiáng)，其中M3和M6接種組尤為明顯，在72 h后pH后顯著低于M0接種組。選擇球菌M0和桿菌M3和M6進(jìn)行不同的配比，接種后pH變化趨勢(shì)結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同分離株及其組合接種發(fā)酵對(duì)泡菜pH變化的影響Fig.4 The effects of isolates and their combinations on the pH change during fermentation

結(jié)果顯示，組合接種組M0+M3(1∶1接種)產(chǎn)酸速度高于 M0和 M3單獨(dú)接種組，在 48 h達(dá)到pH3.5，M0+M6(1∶1接種)在 72 h 達(dá)到 pH3.5，兩個(gè)組合均顯著低于對(duì)照組和單獨(dú)接種組(P＜0.05)，但是與其他接種比例的組合(結(jié)果未列出)的pH變化趨勢(shì)沒有顯著差異(P＞0.05)。結(jié)果表明M0+M3組合接種組產(chǎn)酸最快，適合作為高NaCl濃度泡菜發(fā)酵劑的進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

論文對(duì)起始鹽濃度為2.0%(低鹽)和8.0%(高鹽)泡菜發(fā)酵過程中pH、總酸、細(xì)菌菌落總數(shù)、乳酸菌總數(shù)以及大腸菌群的變化規(guī)律進(jìn)行了測(cè)定與分析，并從鹽濃度為8.0%的泡菜發(fā)酵鹵水中分離得到5株乳酸菌，并對(duì)菌株在不同鹽含量的蔬菜汁中的生長動(dòng)力學(xué)參數(shù)及其產(chǎn)酸特性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明:

(1)高鹽泡菜發(fā)酵產(chǎn)酸速度顯著低于低鹽泡菜，但在發(fā)酵后期兩者均能達(dá)到pH3.5～3.8。高鹽泡菜起始菌落總數(shù)、乳酸菌總數(shù)以及大腸菌群數(shù)均顯著低于低鹽泡菜。發(fā)酵過程中，菌群變化呈先上升后下降趨勢(shì)，其中8.0%鹽濃度泡菜菌落總數(shù)及大腸菌群數(shù)緩慢上升，144 h后開始緩慢下降，而在低鹽泡菜中24 h后迅速下降，結(jié)果表明蔬菜攜帶的自然菌群中包含耐鹽性和鹽敏感性群體，高濃度鹽對(duì)鹽敏感性乳酸菌的抑制是發(fā)酵周期延長的主要原因，通過提高起始耐鹽性乳酸菌數(shù)量可以加快高鹽泡菜成熟。

(2)從高鹽泡菜發(fā)酵鹵水中分離獲得1株球菌(M0)和4株桿菌(M1、M3、M4 和 M6)，經(jīng)生理生化和分子鑒定，球菌M0屬于屎腸球菌(Enterococcus faecium)，4株桿菌均鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)。5株乳酸菌分離株在含0～10%NaCl的黃瓜汁中的最大生長速率、最大群體密度、以及耐鹽特性呈現(xiàn)菌株差異性。菌株M0能夠在10%NaCl的黃瓜汁中生長，顯示了良好的耐鹽性，而在8%NaCl的黃瓜汁中，菌株M3和M6能較好生長，而M4不能生長。結(jié)果表明菌株M0、M3和M6具有良好的耐NaCl脅迫的能力，可能是高鹽泡菜中的優(yōu)勢(shì)乳酸菌。

(3)5株乳酸菌在含8%NaCl的蔬菜汁中呈現(xiàn)不同的產(chǎn)酸特性，球菌M0前期產(chǎn)酸速度快，而桿菌在發(fā)酵后期產(chǎn)酸速度快，球菌M0和桿菌M3和M6按不同的配比接種8%NaCl的蔬菜汁，其中M0+M3(1∶1)接種組產(chǎn)酸最快，在48 h達(dá)到pH3.5，顯著低于對(duì)照組和單獨(dú)接種組(P＜0.05)，適合用于高鹽泡菜發(fā)酵劑制備。

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