賈秋思，何芝菲，羅佩文，何利，周康，胡欣潔，韓新鋒，顏正財，劉書亮，胡濱

1(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安，625014)2(四川吉香居食品有限公司，四川眉山，620039)

泡菜是我國民間大眾化的蔬菜加工食品，富含以乳酸菌為主的益生菌群，不僅具有獨特的口味，而且具有凈腸［1］、抗動脈硬化和抗肥胖［2］、延緩衰老［3］、抗癌［4-5］等多種保健功能。但目前，我國泡菜生產(chǎn)企業(yè)多使用自然發(fā)酵或高鹽腌制方式生產(chǎn)，產(chǎn)品發(fā)酵周期較長、亞硝酸鹽含量較高、品質(zhì)不穩(wěn)定，無法滿足市場的要求，制約了我國泡菜行業(yè)的發(fā)展［6-7］。

直投式乳酸菌發(fā)酵劑是指高濃度的乳酸菌懸浮液添加抗凍保護(hù)劑后，經(jīng)凍結(jié)、真空條件下升華干燥而制成的粉末狀固體發(fā)酵劑［8］，其特點主要有:接種方便，活菌含量高(109～1012CFU/g)，保質(zhì)期長，不需要活化便可直接應(yīng)用于生產(chǎn)［9］。采用直投式乳酸菌發(fā)酵泡菜可顯著縮短泡菜的發(fā)酵周期，改善發(fā)酵泡菜的品質(zhì)，同時在發(fā)酵初期，過氧化氫、雙乙酰等抑菌性物質(zhì)的產(chǎn)生能有效地抑制不耐酸的雜菌的生長，降低亞硝酸鹽含量，提高產(chǎn)品質(zhì)量和穩(wěn)定性［10］。以葉用芥菜為原料生產(chǎn)的泡青菜或酸菜，可鮮食、也可廣泛用作酸菜魚、酸菜燉肉、酸菜湯等烹飪食品的佐料，市場占有量大。本實驗采用自然發(fā)酵、老鹽水發(fā)酵、直投式乳酸菌發(fā)酵方式制作泡青菜，分析3種發(fā)酵泡青菜的感官、理化和微生物指標(biāo)的動態(tài)變化，比較3種發(fā)酵方式的特點及產(chǎn)品間的差異，為改進(jìn)泡青菜生產(chǎn)發(fā)酵工藝，提高產(chǎn)品品質(zhì)提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

卷心芥筍殼青菜(也稱芥菜，Brassica juncea)，于青菜實驗田采集;干辣椒、花椒、姜、蒜、八角、茴香、桂皮、冰糖、白酒、食鹽，購自農(nóng)貿(mào)市場。

直投式乳酸菌菌劑:耐鹽戊糖片球菌PP，高效降亞硝酸鹽植物乳桿菌N2，產(chǎn)廣譜細(xì)菌素植物乳桿菌P158，調(diào)整菌含量均約為1010CFU/g，備用。

培養(yǎng)基:MRS培養(yǎng)基;平板計數(shù)瓊脂(PCA)、馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂(PDA)，購于杭州微生物試劑廠。

主要藥品:蛋白胨、牛肉浸膏、酵母膏、瓊脂粉等均為生化試劑(BR);K2HPO4·3H2O、CH3COONa、(NH4)2HC6H5O7、MgSO4、MnSO4等均為分析純試劑(AR)。

主要儀器:DHG-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司;UV-3200紫外可見分光光度計，四川新科儀器有限公司;Thermo BR4i型冷凍離心機(jī)，Thermo Electron Corporation;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀GC-MS(GP2010)，島津國際貿(mào)易有限公司。

1.2 方法

1.2.1 泡青菜制作

自然發(fā)酵泡青菜制作:將青菜清洗干凈，瀝干水分后取15 kg放入壇中，根據(jù)蔬菜與水的比例為1∶1，向壇內(nèi)加含鹽量為60 g/L的涼開水和適量輔料，壇沿加水密封，于20℃培養(yǎng)，每24 h測定泡菜的pH值，當(dāng)pH值降至3.6［11］，總酸含量達(dá)到0.4%時，結(jié)合發(fā)酵蔬菜色澤、口感等確定發(fā)酵終點。

老鹽水發(fā)酵泡青菜制作:將青菜清洗干凈，瀝干水分后取15 kg放入壇中，向壇內(nèi)加40%的老鹽水和適量輔料，根據(jù)蔬菜與水的比例為1∶1，向壇內(nèi)添加剩余所需的鹽水(鹽含量約60 g/L)，壇沿加水密封，于20℃培養(yǎng)，每24 h測定泡菜的pH值，當(dāng)pH值降至3.6，總酸含量達(dá)到0.4%時，結(jié)合發(fā)酵蔬菜色澤、口感等確定發(fā)酵終點。

直投式乳酸菌劑發(fā)酵泡青菜制作:將青菜清洗干凈，瀝干水分后取15 kg放入壇中，根據(jù)蔬菜與水的比例為1∶1，向壇內(nèi)加含鹽量為60 g/L的涼開水和適量輔料，并按青菜總質(zhì)量的0.05%添加乳酸菌劑粉末至壇內(nèi)(3株菌劑按 PP∶P158∶N2=1∶0.5∶0.5添加)，壇沿加水密封，于30℃培養(yǎng)，每24 h測定泡菜的pH值，當(dāng)pH值降至3.6，總酸含量達(dá)到0.4%時，結(jié)合發(fā)酵蔬菜色澤、口感等確定發(fā)酵終點。

1.2.2 品質(zhì)測定

在泡青菜發(fā)酵過程中，于 0、1、2、3、4、5、6、9、12 d分別對3種發(fā)酵方式的泡青菜在泡菜壇內(nèi)的上、中、下3層的位置進(jìn)行取樣混合，測定其各項理化、微生物指標(biāo)及發(fā)酵成熟后泡青菜的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)并進(jìn)行感官評價。

1.2.2.1 感官評定

感官評價邀請食品專業(yè)同學(xué)和老師共10人作為感官評價人員，采用加權(quán)法，考察色澤、形態(tài)、氣味、口感和脆度五個方面進(jìn)行感官評價，對應(yīng)的評價得分集={很差(2)，較差(4)，一般(6)，較好(8)，很好(10)}，評價結(jié)果用SPSS軟件進(jìn)行分析。具體評價標(biāo)準(zhǔn)及得分權(quán)重見表1。

表1 感官指標(biāo)評定標(biāo)準(zhǔn)［12］Table 1 Criterion of sensory evaluation

1.2.2.2 部分理化指標(biāo)測定

pH值:參照GB/T 10468—1989;亞硝酸鹽:鹽酸萘乙二胺法，參照 GB 5009.33—2010;Vc:2，6-二氯靛酚滴定法，參照GB/T 6195—1986;總酸:酸堿中和法，參照GB/T 12456—2008。

1.2.2.3 部分微生物指標(biāo)的測定

細(xì)菌菌落總數(shù):參照GB 4789.2—2010;酵母菌數(shù):參照 GB 4789.15—2010;乳酸菌數(shù):參照 GB 4789.35—2010。

1.2.2.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定

采用同時蒸餾萃取(SDE)和GC-MS對泡青菜的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行提取和測定。稱取200 g樣品于研缽中研磨至勻漿，取100 g勻漿與500 mL蒸餾水放入1 L圓底燒瓶中，將50 mL乙醚加入裝置中的另一側(cè)250 mL燒瓶中，將裝置樣品端置于電爐上，保持微沸，另溶劑端置于40℃水浴鍋中，蒸餾萃取2 h，之后向提取液中加入一定量的無水硫酸鈉，置于冰箱中過夜除水。真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1 mL，于GC-MS進(jìn)樣分析。

GC-MS檢測條件［13］:色譜柱:Rtx-5MS彈性石英玻璃毛細(xì)管柱(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm);載氣:氦氣;進(jìn)樣溫度:250℃，分流比10∶1;進(jìn)樣量:1 μL;升溫程序:初溫40℃保持2 min，5℃/min上升至80℃，保持1 min，8℃/min上升至180℃/min，保持1 min，再以15℃/min上升至240℃，保持8 min。

離子源溫度:200℃;電子能量:70 eV;放射電流:150 μA，檢測電壓350 V;電離作用模式:EI+，掃描范圍(m/z):35～450。

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)數(shù)據(jù)處理:樣品經(jīng)過GC-MS分析后，各香氣成分的質(zhì)譜圖經(jīng)計算機(jī)譜庫(NIST05)匹配檢索及相關(guān)資料分析，對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同發(fā)酵方式過程中的泡青菜感官評價結(jié)果

從表2中可看出，在發(fā)酵初期，感官得分較低，可能由于泡菜鹽水中的各種風(fēng)味成分沒有滲入青菜組織中，且發(fā)酵尚未成熟，所以泡青菜較咸且伴有生青菜味，色澤呈青色，發(fā)酵香味差;隨著發(fā)酵時間的延長，泡青菜的色澤逐步由青綠色轉(zhuǎn)變?yōu)榻瘘S色，伴有發(fā)酵清香氣味，微生物發(fā)酵產(chǎn)生的酸也逐步賦予泡青菜酸爽的口感，感官得分逐步提高。從發(fā)酵初期到發(fā)酵終點，3種發(fā)酵方式的泡青菜感官評價得分均存在顯著差異(P＜0.05)，從總體上看，直投式乳酸菌發(fā)酵泡青菜色澤金黃，咀嚼脆性好，感官評分最高，明顯優(yōu)于其他兩種發(fā)酵方式的泡青菜，與李文婷、余文華等［14-15］的研究結(jié)果吻合。自然發(fā)酵泡青菜風(fēng)味較清淡，略有苦澀味，得分最低。

表2 不同發(fā)酵方式下泡青菜感官評定結(jié)果Table 2 Results of sensory evaluation of mustard pickles during different fermentation

2.2 不同發(fā)酵方式下泡青菜的理化指標(biāo)

2.2.1 不同發(fā)酵方式下泡青菜pH的變化情況

pH值是泡菜發(fā)酵過程中的一項重要指標(biāo)，它對乳酸菌動態(tài)變化、微生物的生長和代謝產(chǎn)物的形成有著重要的影響［16］。當(dāng)泡菜pH為3.5～3.8時，泡菜即成熟且風(fēng)味品質(zhì)最佳［11］。由圖1可以看出，3種發(fā)酵方式的泡青菜pH變化趨勢基本一致，直投式乳酸菌發(fā)酵泡青菜pH下降速度最快，在發(fā)酵第6天時降至3.54，老鹽水與自然發(fā)酵泡菜的pH分別在第9天和第12天降至3.6以下。由此可以看出，使用直投式乳酸菌發(fā)酵泡青菜，可在一定程度上縮短泡青菜的發(fā)酵周期。

圖1 不同發(fā)酵方式下泡青菜pH的變化Fig.1 Changes of pH in mustard pickles during different fermentation

2.2.2 不同發(fā)酵方式下泡青菜總酸的變化情況

從圖2可以看出，3種發(fā)酵方式的泡青菜在整個發(fā)酵過程中總酸變化趨勢基本一致。在發(fā)酵初期，泡青菜中的水分、糖分等可溶性成分向外滲出，泡菜水的鹽濃度降低，抗鹽較強和抗鹽較弱的微生物可同時活動，此時乳酸菌含量不高，產(chǎn)酸較低［11］。發(fā)酵前2天總酸含量緩慢上升，在第3天均出現(xiàn)一個最低點，這可能是由于在整個過程中，泡菜自身的酸性物質(zhì)如蘋果酸、檸檬酸等不斷向泡菜液中滲透或被分解，而乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，造成泡菜和泡菜液之間酸性物質(zhì)的相互滲透、擴(kuò)散［17］。發(fā)酵3天后，總酸含量隨著發(fā)酵時間延長、乳酸菌濃度升高而逐步增加，至發(fā)酵第9天后，自然發(fā)酵泡青菜總酸含量趨于穩(wěn)定，而直投式乳酸菌發(fā)酵和老鹽水發(fā)酵泡青菜總酸含量仍呈一定程度的上升趨勢，這是由于自然發(fā)酵泡青菜是利用青菜表面附著的微生物進(jìn)行發(fā)酵，由于泡菜發(fā)酵時間較短，其中存在的乳酸菌適應(yīng)酸的過程相應(yīng)較短，因此通過自然篩選存在的耐酸乳酸菌比例可能相對較少，在發(fā)酵后期總酸的大量累積，使自然發(fā)酵泡青菜中乳酸菌的生長代謝被抑制;而直投式乳酸菌發(fā)酵泡青菜中的乳酸菌是經(jīng)過選擇的具有一定耐酸能力的乳酸菌，且老鹽水發(fā)酵泡青菜的泡菜水是經(jīng)過較長時期選擇的優(yōu)質(zhì)泡菜水，其中含有較多耐酸性較強的乳酸菌，因此發(fā)酵后期的酸環(huán)境對其生長影響均相對較弱，使發(fā)酵后期總酸含量仍呈一定程度上升趨勢。發(fā)酵至12天時3種發(fā)酵方式相比，老鹽水發(fā)酵泡菜的總酸含量最高，其次是直投式乳酸菌發(fā)酵泡菜，自然發(fā)酵泡菜的總酸含量最低。

圖2 不同發(fā)酵方式下泡青菜總酸的變化Fig.2 Changes of total acid in mustard pickles during different fermentation

2.2.3 不同發(fā)酵方式下泡青菜亞硝酸鹽的變化情況

亞硝酸鹽是合成強致癌物質(zhì)亞硝胺類化合物的前體物質(zhì)，容易在泡菜等發(fā)酵食品中累積［18］。圖3顯示，泡菜亞硝酸鹽含量隨發(fā)酵時間的增加呈先上升后下降的趨勢。在發(fā)酵初期，有氧環(huán)境下，乳酸菌含量少，雜菌含量多，泡菜液pH值高，亞硝酸鹽含量逐步升高并出現(xiàn)一個峰值;隨著乳酸菌含量的增加，泡菜酸度逐步升高，硝酸鹽還原菌的生長被抑制，同時亞硝酸鹽在酸性環(huán)境中發(fā)生化學(xué)降解或酶降解［19-20］，致亞硝酸鹽含量逐步降低。直投式乳酸菌發(fā)酵泡青菜于發(fā)酵第2天出現(xiàn)亞硝峰，峰值為7.63 mg/kg，老鹽水發(fā)酵泡青菜于第3天出現(xiàn)亞硝峰，峰值為9.39 mg/kg，自然發(fā)酵泡青菜亞硝峰出現(xiàn)最晚，峰值最高，為16.21 mg/kg，直投式乳酸菌發(fā)酵泡青菜亞硝酸鹽出峰時間相對較早，峰值較低，降解速度快，優(yōu)于自然發(fā)酵和老鹽水發(fā)酵，表明人工接種乳酸菌有利于抑制亞硝酸鹽的生成或降解生成的亞硝酸鹽，減少亞硝酸鹽的積累。證實了本實驗接入的植物乳桿菌N2具有較好的降解亞硝酸鹽能力［21］。有研究表明，泡菜中亞硝酸鹽的生成與變化規(guī)律隨食鹽濃度的不同而異，食鹽含量低，出峰時間早［22］，本實驗相對其他泡菜研究［23］報道的亞硝酸鹽峰值出現(xiàn)的時間較早，這可能是由于本實驗食鹽添加量較低所致。3種發(fā)酵方式泡青菜成品的亞硝酸鹽含量均符合四川泡菜地方標(biāo)準(zhǔn)(≤10 mg/kg)。

圖3 不同發(fā)酵方式下泡青菜亞硝酸鹽的變化Fig.3 Changes of nitrite content in mustard pickles during different fermentation

2.2.4 不同發(fā)酵方式下泡青菜Vc的變化情況(圖4)

圖4 不同發(fā)酵方式下泡青菜Vc的變化Fig.4 Changes of vitamin C in mustard pickles during different fermentation

Vc易溶于水，在空氣中易被氧化，但在酸性條件下穩(wěn)定，因此泡菜發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酸對Vc具有一定的保護(hù)作用。青菜中Vc含量較高，但在發(fā)酵液滲透作用下會有部分損失，且Vc具有二烯醇結(jié)構(gòu)，有極強的還原性，而裝壇時壇內(nèi)有一定量的氧氣，Vc在有氧條件下發(fā)生氧化還原反應(yīng)被氧化，因此發(fā)酵前期Vc量降低幅度較大;在發(fā)酵中后期，青菜發(fā)酵的厭氧環(huán)境及乳酸菌產(chǎn)酸形成的酸性環(huán)境可以抑制Vc氧化，有利于Vc保存，Vc的下降趨于緩和，直投式乳酸菌發(fā)酵泡青菜的Vc含量相對較高。

2.3 不同發(fā)酵方式過程中泡青菜菌相的變化情況

由圖5、圖6、圖7可以看出，在發(fā)酵初期老鹽水發(fā)酵和自然發(fā)酵中的乳酸菌含量較低，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，乳酸不斷積累，pH下降，老鹽水和自然發(fā)酵中的乳酸菌分別在第4和第5天成為發(fā)酵優(yōu)勢菌。直投式乳酸菌發(fā)酵由于接入了一定量的乳酸菌，從發(fā)酵初期乳酸菌就是發(fā)酵優(yōu)勢菌，對酵母菌的抑制作用相對其他兩種發(fā)酵方式更明顯。直投式發(fā)酵的乳酸菌在第4天為107CFY/g，第6天達(dá)到108CFU/g，發(fā)酵末期略有下降，自然發(fā)酵和老鹽水發(fā)酵分別在第5和第9天達(dá)到107CFU/g。在整個發(fā)酵過程中，自然發(fā)酵泡青菜與老鹽水發(fā)酵泡青菜乳酸菌的增長速度及含量均低于直投式發(fā)酵泡青菜，進(jìn)一步確認(rèn)直投式乳酸菌發(fā)酵泡青菜可縮短發(fā)酵時間，且乳酸菌含量較高，從細(xì)菌菌落總數(shù)看出，它能有效抑制雜菌的生長。

圖5 自然發(fā)酵過程中泡青菜菌相的變化Fig.5 Changes of mustard pickles microflora during natural fermentation

圖6 直投式乳酸菌發(fā)酵過程中泡青菜菌相的變化Fig.6 Changes of mustard pickles microflora during direct vat set fermentation

2.4 不同發(fā)酵方式下泡青菜的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

圖7 老鹽水發(fā)酵過程中泡青菜菌相的變化Fig.7 Changes of mustard pickles microflora during aged brine fermentation

經(jīng)SDE和GC-MS檢測，分別從自然發(fā)酵、直投式乳酸菌發(fā)酵、老鹽水發(fā)酵泡青菜中鑒定出81、91、92種香氣成分，其成分主要包括烴類、酯類、酸類、醇類、硫醚類、醛類等，其中以烴類、酯類和醇類的成分最多。烴類包括烷烴和烯烴，而烷烴香氣閾值較高，賦予泡菜的香氣作用較小，烯烴相對烷烴閾值較低并具有特殊香氣，作用較大。

一般泡菜中的風(fēng)味物質(zhì)有3大來源，1是泡菜原料(蔬菜和香辛料)本身的風(fēng)味物質(zhì)(如花椒中的檸檬烯，青菜中的酸類、醇類等)，2是乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)(如乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、琥珀酸、乙酸乙酯等)，3是其他菌群發(fā)酵產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)(如酵母菌發(fā)酵)。由表3可以看出，3種發(fā)酵泡青菜中異硫氰酸酯類含量占比較大，它是辣味的前體物質(zhì)——芥子油苷經(jīng)硫苷酸酶水解得到的，是十字花科蔬菜的獨特風(fēng)味組分［24］。該類物質(zhì)在直投式乳酸菌發(fā)酵泡青菜中的含量明顯高于其他兩種發(fā)酵泡青菜，這是由于Vc能顯著提高硫苷酸酶活性［25］，且異硫氰酸酯類物質(zhì)在酸性條件下穩(wěn)定。

表3 不同發(fā)酵方式下的泡青菜揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要組分及其相對含量Table 3 Component of volatile flavor compounds in mustard pickles with different fermentation methods

老鹽水發(fā)酵泡青菜其總酸含量雖略高，但Vc含量相對較低，自然發(fā)酵泡青菜總酸含量較低，其發(fā)酵環(huán)境不適宜該類物質(zhì)的生成。另外，由發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸等酸類物質(zhì)可適當(dāng)中和泡菜的芥辣刺激味，賦予泡青菜酸爽可口的風(fēng)味。醛類和芳香族化合物的香氣閾值較低，為賦予泡青菜風(fēng)味提供了較大作用。3種發(fā)酵方式其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的類別相似，但各組分的種類和含量具有一定差異，直投式乳酸菌發(fā)酵泡青菜和老鹽水發(fā)酵泡青菜的風(fēng)味成分較為接近，其相同組分占直投式乳酸菌發(fā)酵泡青菜種類的57.14%。

目前對直投式發(fā)酵與老鹽水發(fā)酵泡青菜品質(zhì)的對比研究較少，因此進(jìn)一步對直投式發(fā)酵及老鹽水發(fā)酵泡青菜進(jìn)行深入研究，尤其是對其微生物菌群分布及呈味機(jī)理的研究是十分必要的，其研究結(jié)果可為提高直投式發(fā)酵泡青菜的品質(zhì)和風(fēng)味提供數(shù)據(jù)參考，使其品質(zhì)風(fēng)味更接近于傳統(tǒng)的老壇泡青菜。

3 結(jié)論

本文分別以自然發(fā)酵、直投式乳酸菌發(fā)酵、老鹽水發(fā)酵制作泡青菜，并以感官評定、理化及微生物指標(biāo)為參考比較了其品質(zhì)的差異。直投式乳酸菌發(fā)酵泡青菜總酸上升快，可加快發(fā)酵速度，縮短發(fā)酵時間;其成品中亞硝酸鹽含量低，約為自然發(fā)酵泡青菜的1/5，老鹽水發(fā)酵泡菜的2/5。同時，接種乳酸菌占優(yōu)勢，能抑制雜菌感染與生長，在一定程度上提高了產(chǎn)品的安全性;直投式發(fā)酵泡青菜成品酸度適中，色澤金黃，Vc含量相對較高，風(fēng)味物質(zhì)所含成分比自然發(fā)酵泡青菜種類多，與老鹽水發(fā)酵泡青菜相近，風(fēng)味純正濃郁。

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