邱松山，王彥安，林夢紅，姜翠翠，李春海

(廣東石油化工學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，果蔬加工與貯藏工程中心，廣東茂名，525000)

微生物油脂具有油脂含量高、生產(chǎn)周期短、不受季節(jié)影響、不占用耕地等優(yōu)勢。微生物油脂最早采用的菌種是內(nèi)孢霉屬(Endomyces)和單細(xì)胞藻類鐮刀屬(Fusarium)。目前，發(fā)酵微生物油脂的常用菌種有酵母菌、霉菌和藻類等［1］，產(chǎn)油細(xì)菌較少，同時細(xì)菌油脂的開發(fā)有一定難度。利用現(xiàn)代工業(yè)生物技術(shù)改良產(chǎn)油微生物資源成為微生物油脂研究的熱點(diǎn)［2-5］。荔枝深加工過程中產(chǎn)生大量的荔枝渣下腳料，造成環(huán)境污染，破壞生態(tài)環(huán)境。而荔枝渣的主要化學(xué)成分為纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，通過降解處理能夠得到單糖等小分子物質(zhì)，很適合用于培養(yǎng)產(chǎn)油微生物生產(chǎn)生物油脂［6］。本文利用高產(chǎn)油脂菌種粘紅酵母［7-9］發(fā)酵制備微生物油脂，研究優(yōu)化發(fā)酵荔枝渣水解液制備微生物油脂的工藝技術(shù)參數(shù)，通過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝，并對微生物油脂的理化性質(zhì)進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步綜合利用荔枝渣奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要原料

荔枝渣由高州龍利果業(yè)有限公司提供;粘紅酵母(Rhodotorula gutini，GIM2.27)，購自廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心。

1.2 試劑

無水乙醇、NaOH、H2SO4、甲醇、CHCl3、KOH、乙醚、酚酞、KI、淀粉、硫代硫酸鈉、(NH4)2SO4、KH2PO4、HCl、環(huán)己烷、冰醋酸、NaCl、異辛烷、石油醚、苯、韋氏試劑、蘇丹黑B均為分析純，蛋白胨、營養(yǎng)瓊脂為生化試劑。

1.3 儀器

XO-1200超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，南京先歐儀器制造有限公司;SHZ-DⅢ循環(huán)水式真空泵，鞏義市英欲予華儀器廠;DGG-9146A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;AUY220分析天平，島津企業(yè)管理(中國)有限公司;BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;SPX系列生化培養(yǎng)箱，鄭州南北儀器設(shè)備有限公司;722N可見分光光度計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份公司;RX-7000α自動恒溫折光儀，日本ATAGO株式會社。

1.4 培養(yǎng)基

1.4.1 麥芽汁活化培養(yǎng)基

將發(fā)酵啤酒的麥芽汁，稀釋至10°Brix，加瓊脂20 g/L，溶化后分裝，121℃滅菌30 min，備用。

1.4.2 斜面培養(yǎng)基

在10°Brix麥芽汁的基礎(chǔ)上加入2%蛋白胨、2%瓊脂，調(diào)pH 5.5，115℃滅菌20 min，冷卻，備用。

1.4.3 種子培養(yǎng)基

在10°Brix麥芽汁的基礎(chǔ)上加入2%蛋白胨，調(diào)pH 5.5，115℃滅菌 20 min，備用。

1.4.4 荔枝渣水解液發(fā)酵培養(yǎng)基

在經(jīng)過預(yù)處理的荔枝下腳料水解液的基礎(chǔ)上添加1.8 g/L蛋白胨、(NH4)2SO41.11 g/L、KH2PO42.5 g/L，115 ℃滅菌30 min，備用。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 荔枝渣水解液制備

將干燥好的荔枝殼、荔枝核等荔枝渣粉碎，準(zhǔn)確稱取200 g細(xì)粉于1 L三角瓶中，按固液比1∶3加入600 mL 1.5%(體積分?jǐn)?shù))的稀H2SO4，121℃高溫下酸處理90 min，水解液趁熱過濾并以4 000 r/min離心60 min，取其上清液置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 菌種活化培養(yǎng)

粘紅酵母菌活化，加入0.3～0.5 mL 0.9%的生理鹽水，振蕩使凍干菌體溶解呈懸浮狀。取0.1～0.2 mL菌體懸浮液于麥芽汁活化培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)48 h。然后將其接種于斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h。

1.5.3 種子培養(yǎng)

250 mL三角瓶中裝入30 mL種子培養(yǎng)基，28℃、190 r/min搖床培養(yǎng)24 h。

1.5.4 發(fā)酵培養(yǎng)

250 mL三角瓶中裝入40 mL適合濃度的水解液發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)至合適的pH，以10%的接種量接入種子培養(yǎng)基，28℃、190 r/min搖床培養(yǎng)96 h。

1.5.5 菌體收集

培養(yǎng)結(jié)束后發(fā)酵液加入1 mol/L HCl 10 mL，4 000 r/min下離心20 min，加入10 mL蒸餾水，4 000 r/min下離心20 min，即可獲得濕菌體。

1.5.6 種子液培養(yǎng)時間的確定

250 mL三角瓶中裝入30 mL種子培養(yǎng)基，從斜面培養(yǎng)基上刮取的3環(huán)菌接種至瓶內(nèi)，28℃、190 r/min搖床分別培養(yǎng) 12、16、20、24、28、32 和 36 h，再分別以10%的接種量接種到初始糖度為10°Brix、pH值為6.0的發(fā)酵培養(yǎng)基上搖瓶，28℃、190 r/min搖床培養(yǎng)96 h，測定并計(jì)算發(fā)酵終點(diǎn)菌體生物量和產(chǎn)脂能力。

1.5.7 供氧量對產(chǎn)油脂發(fā)酵的影響

為了在搖瓶培養(yǎng)基礎(chǔ)上考察供氧量對粘紅酵母產(chǎn)油發(fā)酵的影響，設(shè)計(jì)試驗(yàn):250 mL三角瓶中分別裝入 30、40、50、60、70 mL 初始糖度為 10°Brix、pH值為5.5的發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、190 r/min搖床培養(yǎng)96 h，測定并計(jì)算發(fā)酵終點(diǎn)菌體生物量和產(chǎn)脂能力。

1.6 微生物油脂發(fā)酵工藝優(yōu)化

1.6.1 單因素實(shí)驗(yàn)

(1)發(fā)酵液初始糖度對微生物發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響

250 mL三角瓶中裝入初始pH值6.0、初始糖度分別為4、6、8、10、12°Brix 的發(fā)酵培養(yǎng)基，接入 10%種子液，28℃、190 r/min振蕩培養(yǎng)96 h，測定并計(jì)算發(fā)酵終點(diǎn)菌體生物量、油脂濃度、油脂含量和產(chǎn)脂能力。

(2)發(fā)酵液初始pH值對微生物發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響

以10%的接種量將種子液接入初始糖度為10°Brix的發(fā)酵培養(yǎng)基中，初始pH值分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，28 ℃、190 r/min 振蕩培養(yǎng) 96 h，測定并計(jì)算發(fā)酵終點(diǎn)菌體生物量、油脂濃度、油脂含量和產(chǎn)脂能力。

(3)發(fā)酵液接種量對微生物發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基以接種量為5%、10%、15%和20%接入種子培養(yǎng)基，在28℃，初始糖度為10°Brix，初始pH為6.0，轉(zhuǎn)速為190 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)96 h，測定并計(jì)算發(fā)酵終點(diǎn)菌體生物量、油脂濃度、油脂含量和產(chǎn)脂能力。

(4)發(fā)酵時間對微生物發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響

以10%的接種量將種子培養(yǎng)基接入初始糖度為10°Brix、初始 pH為6.0的發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃，190 r/min下分別發(fā)酵培養(yǎng) 72、84、96、108、120 h，測定并計(jì)算發(fā)酵終點(diǎn)菌體生物量、油脂濃度、油脂含量和產(chǎn)脂能力。

1.6.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取初始糖度、初始pH值、接種量以及發(fā)酵時間4個因素進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)。選擇L9(34)正交表對發(fā)酵條件工藝的4個參數(shù)進(jìn)行考察，因素水平設(shè)置如表1所示。

表1 發(fā)酵條件正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment of process

1.6.3 酸熱法提取對比

收集50 g濕菌體，平均分為2份。1份進(jìn)行恒重干燥得到干菌體，再對其進(jìn)行酸熱耦合超聲波提取;另1份濕菌體則直接進(jìn)行酸熱耦合超聲波提取，對提取效果進(jìn)行比較，平行實(shí)驗(yàn)測定3次。

1.6.4 微生物油脂驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

稱取提取產(chǎn)物50 mg置于10 mL具塞量瓶內(nèi)，加入2 mL石油醚和苯的混合劑(1∶1)，輕輕搖動使之溶解，再加入2 mL 0.4 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液，混勻。在室溫下靜置5 min，觀察并做試劑空白實(shí)驗(yàn)。另稱取金龍魚調(diào)和油50 mg進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。

1.7 測定方法

菌體生物量采用細(xì)胞干重法［10-11］進(jìn)行測定;菌體內(nèi)油脂采用酸熱耦合超聲波法［12］提取;相對密度的測定采用密度計(jì)法進(jìn)行;折光指數(shù)采用自動恒溫折光儀測定;酸價(jià)的測定方法參照GB/T 5530—2005《植物油脂酸值和酸度的測定方法》進(jìn)行實(shí)驗(yàn);碘價(jià)的測定參照GB/T 5532—2008進(jìn)行;過氧化值的測定方法參照GB/T 5538—2005/ISO 3960:2001進(jìn)行。

2 結(jié)果分析

2.1 種子液培養(yǎng)時間對產(chǎn)脂能力的影響

種子液不同培養(yǎng)時間對發(fā)酵終點(diǎn)菌體生物量、油脂濃度、油脂含量和產(chǎn)脂能力的影響如表2所示。

表2 培養(yǎng)時間對粘紅酵母產(chǎn)油脂能力的影響Table 2 The effect of cultivation time on the capacity of lipid production

由表2可知，油脂濃度與產(chǎn)脂能力的變化趨勢相同，以粘紅酵母的產(chǎn)脂能力為指標(biāo)進(jìn)行分析，菌體的產(chǎn)脂能力經(jīng)歷了一個由低到高再降低的過程，期間種子菌經(jīng)歷了延長期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰亡期。結(jié)果表明在種齡為24 h時粘紅酵母菌的產(chǎn)脂能力最高，達(dá)到377.0 mg/L，此時微生物細(xì)胞處于生長和分裂的高峰期，因此本試驗(yàn)選取搖瓶培養(yǎng)24 h的種子液用于接種發(fā)酵培養(yǎng)。

2.2 供氧量對產(chǎn)油脂發(fā)酵的影響

供氧量對產(chǎn)油脂發(fā)酵的影響如表3所示。

表3 供氧量對發(fā)酵產(chǎn)油脂能力的影響Table 3 The effect of O2content on the capacity of lipid production

由表3可知，在250 mL三角瓶中隨著發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量的增多，粘紅酵母的產(chǎn)脂能力逐漸增大，當(dāng)裝液量達(dá)到40 mL時，裝液量增大反而降低了粘紅酵母菌的產(chǎn)脂能力，這說明了產(chǎn)油粘紅酵母菌在生長的過程中耗氧量比較大。因此試驗(yàn)選擇的最適發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為40 mL/250 mL。

2.3 發(fā)酵條件的單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 發(fā)酵液初始糖度

發(fā)酵液初始糖度對產(chǎn)油脂發(fā)酵的影響如表4所示。

表4 發(fā)酵液初始糖度對產(chǎn)油脂能力的影響Table 4 The effect of original sugar content on the capacity of lipid production

由表4可知，以粘紅酵母的產(chǎn)脂能力為指標(biāo)進(jìn)行分析，發(fā)酵液初始糖度在4～8°Brix時，粘紅酵母的產(chǎn)脂能力隨著發(fā)酵液初始糖度的增加而增加，到8°Brix時達(dá)到最大。此后隨著初始糖度的增大，菌體的產(chǎn)脂能力反而減小。這說明初始糖度過高過低都不利于菌體生長和脂肪的合成。若初始糖度過低，培養(yǎng)基中沒有足夠的碳源供菌體生長;初始糖度過高，可能導(dǎo)致培養(yǎng)基中產(chǎn)生較高的滲透壓，同時過高的糖度會使代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸大量積累，導(dǎo)致發(fā)酵液的pH值降低，從而不利于菌體的生長和脂肪的合成。因此粘紅酵母產(chǎn)脂能力最高的初始濃度為 8°Brix。

2.3.2 發(fā)酵液初始pH值

環(huán)境中的pH值對微生物的生命活動影響很大，影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及酶活。每種微生物都有其最適pH值和pH范圍，在最適pH范圍內(nèi)產(chǎn)量最高，發(fā)酵液初始pH值對產(chǎn)油脂發(fā)酵的影響如表5所示。

表5 發(fā)酵液初始pH對產(chǎn)油脂能力的影響Table 5 The effect of pH on the capacity of lipid production

由表5可知，發(fā)酵液初始pH值為5.5時，粘紅酵母的產(chǎn)脂能力達(dá)到最大。這可能是因?yàn)閜H值5.5時菌體內(nèi)各種酶的活性較高，偏離5.5細(xì)胞生長較慢，影響粘紅酵母的產(chǎn)脂能力。因此初始pH值在5.5左右發(fā)酵產(chǎn)脂能力較好。

2.3.3 發(fā)酵液接種量

發(fā)酵液初始pH值對產(chǎn)油脂發(fā)酵的影響見表6。

表6 發(fā)酵液接種量對產(chǎn)油脂能力的影響Table 6 The effect of inoculation on the capacity of lipid production

由表6可知，發(fā)酵水解液中接種量對菌體生物量的影響較大，接種量為10%時粘紅酵母的產(chǎn)脂能力達(dá)到最大。適宜的接種量可以減少雜菌污染的機(jī)會，縮短產(chǎn)物合成的時間，提高發(fā)酵效率，但接種量過大時會導(dǎo)致細(xì)胞生長過快，培養(yǎng)液黏度增加，有害物質(zhì)積累，影響產(chǎn)物的合成。因此在本實(shí)驗(yàn)所考察的水解液接種量中，接種量為10%較佳。

2.3.4 發(fā)酵時間

微生物細(xì)胞油脂含量和生物量隨微生物生長階段的不同而有顯著差異。因此，培養(yǎng)時間對粘紅酵母產(chǎn)油脂能力有重要的影響，培養(yǎng)時間不足，菌體總量少而影響油脂產(chǎn)率，培養(yǎng)時間過長，細(xì)胞容易變形、自溶，合成的油脂進(jìn)入培養(yǎng)基中難以收集。發(fā)酵時間對產(chǎn)油脂發(fā)酵的影響如圖1所示。

圖1 發(fā)酵時間對產(chǎn)油脂能力的影響Fig.1 The effect of time on the capacity of lipid production

圖1可知，在粘紅酵母生長初期，微生物以自身繁殖為主，油脂含量低，隨著發(fā)酵時間的增加，菌體生物量和油脂含量逐漸增加。發(fā)酵到96 h時，粘紅酵母油脂含量、生物量和產(chǎn)脂能力均達(dá)到最大值，隨著培養(yǎng)時間的延長，油脂產(chǎn)脂能力有所下降，可能的原因是培養(yǎng)基中碳源基本耗盡，此時菌體開始利用所積累的油脂維持代謝。在單因素試驗(yàn)中，發(fā)酵培養(yǎng)96 h為較佳培養(yǎng)時間。

2.4 發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.4.1 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

荔枝渣水解液發(fā)酵制備微生物油脂的試驗(yàn)結(jié)果如表7所示。

表7 發(fā)酵條件正交試驗(yàn)及結(jié)果Table 7 Its result of the orthogonal experiment

續(xù)表7

以產(chǎn)脂能力為指標(biāo)，對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。由表7通過對比極差值R可得，各因素對產(chǎn)脂能力的影響程度依次為:接種量﹥發(fā)酵時間﹥初始糖度﹥初始pH值(C＞D＞A＞B)。由研究結(jié)果確定發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂發(fā)酵條件的最佳組合為A2B2C2D2，即初始糖度8°Brix，初始pH值5.5，接種量10%，發(fā)酵時間96 h。

2.4.2 驗(yàn)證性試驗(yàn)

以發(fā)酵液初始糖度8°Brix，初始pH值5.5，種子液接種量10%為培養(yǎng)基質(zhì)，在28℃、190 r/min下發(fā)酵培養(yǎng)96 h，進(jìn)行3批次的發(fā)酵產(chǎn)微生物油脂實(shí)驗(yàn)，測算得:平均油脂濃度為 0.378 g/L，油脂含量2.414%，生物量15.670 g/L，產(chǎn)脂能力378.3 mg/L，發(fā)酵產(chǎn)脂具有較好的穩(wěn)定性，理論最佳工藝條件與實(shí)際操作條件相符合。

2.5 濕干菌體酸熱法提油的比較

對濕干菌體分別進(jìn)行酸熱提油，結(jié)果如表8所示。

表8 濕干菌體酸熱法提油實(shí)驗(yàn)結(jié)果對比Table 8 The comparison of dry and wet acid heat extraction

由表8可知，濕菌體酸熱法得到的菌液與殘留的鹽酸分層界限明顯，且隨著時間的進(jìn)行，其顏色深淺也有著不同的變化。干菌體酸熱法得到的菌液顏色較深，為黑褐色，且其較為黏稠。從兩者最終的油脂提取量可以看出，干菌體酸熱提油的得率顯然大于濕菌體的提油得率。究其原因可能是4.0 mol/L的HCl破碎細(xì)胞的效果較佳，當(dāng)濕菌體水分含量過高時，稀釋了HCl的濃度，低濃度的HCl對細(xì)胞壁破壞較小，油脂不易被浸提出。因此本試驗(yàn)采用的均是先對濕菌體進(jìn)行干燥后得到干菌體，再對干菌體進(jìn)行提油。

試驗(yàn)提取到的產(chǎn)物與植物油的試驗(yàn)現(xiàn)象一致，兩者均由黃色變?yōu)槿榘咨瞻自囼?yàn)沒有該現(xiàn)象，這說明了試驗(yàn)提取產(chǎn)物與植物油存在相似的性質(zhì)，均可發(fā)生乳化現(xiàn)象，初步可以判定提取產(chǎn)物為微生物油脂。

2.6 理化指標(biāo)分析

所得的微生物油脂呈黃色透明液體，無特殊氣味，其平均相對密度為1.104 4 g/mL，折光指數(shù)為1.459 0，酸價(jià)為5.39 mg/g，碘價(jià)為101.8(gI2/100g)，過氧化值為9.44 mmol/kg。

3 結(jié)論

荔枝渣水解液發(fā)酵制備微生物油脂工藝中粘紅酵母種子液培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)時間為24 h，發(fā)酵液最適裝液量為40 mL/250 mL。單因素及正交優(yōu)化后的最佳發(fā)酵工藝:發(fā)酵液初始糖度8°Brix、初始 pH值5.5，種子液接種量10%，培養(yǎng)時間96 h，在此條件下微生物的產(chǎn)脂能力為378.3 mg/L;通過對比濕干菌體酸熱提油，可知干菌體酸熱提油效果佳于濕菌體酸熱提油，所制備的微生物油脂呈黃色透明液體，無特殊氣味。

本試驗(yàn)在荔枝渣水解液中成功實(shí)現(xiàn)了微生物油脂的發(fā)酵生產(chǎn)，但與類似研究比較，發(fā)酵生產(chǎn)的油脂含量低，酵母的產(chǎn)脂能力不高，這可能與培養(yǎng)基的配比不佳有關(guān)。此外，微生物油脂的驗(yàn)證試驗(yàn)表明理論最佳工藝參數(shù)與實(shí)際操作比較吻合，微生物發(fā)酵過程中C/N比，影響微生物的生長和產(chǎn)脂，可開展相關(guān)研究。試驗(yàn)所得的微生物油脂有必要進(jìn)行后續(xù)的組分分析和性質(zhì)檢測。如何將水解液應(yīng)用到工業(yè)化生產(chǎn)中也需進(jìn)一步研究。

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