糖化酵母糖化酶基因在釀酒酵母中的克隆與表達(dá)

郭彥言，王紅蕾，左小明*

(長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130012)

摘要[目的]使釀酒酵母高效表達(dá)糖化酵母糖化酶基因。[方法]利用PCR技術(shù)從糖化酵母中擴(kuò)增出大小為2 700 bp左右的帶有啟動(dòng)子的糖化酶基因STA1。通過(guò)限制性內(nèi)切酶BspDI與Acc65I雙酶切，將目的基因STA1連接到穿梭質(zhì)粒pRS416中構(gòu)建重組質(zhì)粒pRS416-sta1，轉(zhuǎn)化釀酒酵母通過(guò)篩選。[結(jié)果]糖化酶活性最高為120 U/ml，酶的最適溫度為60 ℃，最適pH為5.0，在酶催化反應(yīng)2 h后，酶剩余活力能達(dá)到約90%。[結(jié)論]通過(guò)基因工程手段得到高效表達(dá)糖化酶基因的釀酒酵母工程菌株。

關(guān)鍵詞釀酒酵母；糖化酶；糖化酵母；基因表達(dá)

中圖分類號(hào)S188+.4;Q786

作者簡(jiǎn)介郭彥言(1989-)，女，吉林吉林人，碩士研究生，研究方向：基因工程。*

收稿日期2015-06-15

Cloning and Expressing Glucoamylase Gene ofSaccharomycesdiastaticusinSaccharomycescerevisiae

GUO Yan-yan, WANG Hong-lei, ZUO Xiao-ming*(College of Chemistry and Life Science, Changchun University of Technology, Changchun, Jilin 130012)

Abstract[Objective] Highly expressing glucoamylase gene of Saccharomyces diastaticus in Saccharomyces cerevisiae. [Method] The glucoamylase STA1 gene of 2700 bp with promoter from Saccharomyces diastaticus was amplified by PCR. STA1 was digested by BspDI and Acc65I with Saccharomyces cerevisiae integrative expression vectors pRS416, named pRS416-sta1. This plasmid was introduced into S.cerevisiae. [Result] The glucoamylase levels of Saccharomyces cerevisiae activity was 120 U/ml. The result of determination of enzymatic properties of glucoamylase showed that the optimum temperature of glucoamylase was 60 ℃, the optimum pH of glucoamylase was 5.0. After the enzyme reacted for 2 hours, the remaining enzyme activity achieved 90%. [Conclusion] The result indicated that the plasmid carrying extracellular glucoamylase gene could express in yeast, and this gene product could hydrolyze starch.

Key wordsSaccharomycescerevisiae; Glucoamylase;Saccharomycesdiastaticus; Gene expression

釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是發(fā)酵工業(yè)的重要微生物，主要用于酒精、啤酒和面包工業(yè)[1-2]。淀粉來(lái)源廣泛、成本低廉，是一種很有潛力的生物資源，工業(yè)發(fā)酵一直利用淀粉酶來(lái)分解利用淀粉。但釀酒酵母由于缺少水解淀粉的酶類不能直接利用淀粉，所以淀粉原料必須先經(jīng)蒸煮、酶解或酸水解成葡萄糖后被利用[3-5]。

糖化酶主要來(lái)源于2種菌株：霉菌和酵母菌[6]。以往研究主要集中于黑曲霉或泡盛酒曲霉等霉菌中糖化酶基因的轉(zhuǎn)化[7-9]。與霉菌相比糖化酵母與釀酒酵母親緣更近，且產(chǎn)生的糖化酶基因遇熱更不穩(wěn)定，更容易在生產(chǎn)后對(duì)其進(jìn)行滅活，對(duì)產(chǎn)物影響更小[10]。

采用基因工程技術(shù)，將糖化酶基因?qū)氲结劸平湍钢校瑯?gòu)建能產(chǎn)生糖化酶的釀酒酵母工程菌株，可以簡(jiǎn)化工藝步驟和設(shè)備，大大降低生產(chǎn)成本，具有很高的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。由于提取的目的基因STA1自帶強(qiáng)啟動(dòng)子，提高了糖化酶基因的表達(dá)率。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒。糖化酵母CICC1868購(gòu)自北京北納凱創(chuàng)生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌DH5α為長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)生物實(shí)驗(yàn)室保存；釀酒酵母AH109購(gòu)自普如汀生物技術(shù)(北京)有限公司；pUM-T載體購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；酵母表達(dá)質(zhì)粒pRS416為長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基(10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L NaCl，pH7.0)用于培養(yǎng)和篩選大腸桿菌；YPD培養(yǎng)基(10 g/L酵母提取物，20 g/L蛋白胨，20 g/L葡萄糖)用于培養(yǎng)糖化酵母與釀酒酵母；淀粉固體培養(yǎng)基(5 g/L牛肉膏，10 g/L蛋白胨，5 g/L NaCl，2 g/L可溶性淀粉，20 g/L瓊脂，pH7.2)用于釀酒酵母陽(yáng)性克隆篩選。

1.1.3 主要生化試劑。限制性內(nèi)切酶BspDI與Acc65I購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司；RNA酶購(gòu)自美國(guó)Sigma；T4DNA 連接酶購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 目的基因STA1的PCR擴(kuò)增。以糖化酵母全基因組為模板[11]；利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，上游引物5′-TACTATGGTAGGCCTCAAAAATCGAT-3′，下游引物5′-ACTTAGTTCCCCGTCTGTTCGGTACC-3′；采用Primer Star DNA聚合酶；反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min熱啟動(dòng)；95 ℃ 30 s、45 ℃ 30、72 ℃ 1 min,35個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min保溫。

1.2.2 重組質(zhì)粒pRS416-sta1構(gòu)建。將pUM-T-sta1用BspDI與Acc65I雙酶切，回收大小為2 700 bp的目的片段，與用同樣的酶切pRS416進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行菌落PCR和雙酶切鑒定[12]，并將陽(yáng)性克隆菌落質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，與NCBI中的STA1序列進(jìn)行比對(duì)。

1.2.3 釀酒酵母轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定。將重組質(zhì)粒pRS416-sta1通過(guò)電轉(zhuǎn)化整合到釀酒酵母菌株中[13]。將轉(zhuǎn)化后的釀酒酵母接種到篩選平板培養(yǎng)基上，篩選陽(yáng)性克隆[14]。將篩選后的陽(yáng)性克隆點(diǎn)接于淀粉平板培養(yǎng)基中，采用碘熏法進(jìn)行鑒定，在28 ℃培養(yǎng)2～3 d，用碘蒸汽熏，若在菌落周圍出現(xiàn)透明圈則說(shuō)明此菌落為糖化酶陽(yáng)性菌落。

1.2.4 糖化酶酶活測(cè)定。將菌株經(jīng)過(guò)誘變處理后，離心取上清液看作粗酶液。采用DNS法[15]測(cè)定粗酶液與淀粉反應(yīng)30 min后產(chǎn)生的還原糖含量與粗酶液原有還原糖含量，兩者相減得到酶液在一定時(shí)間內(nèi)催化淀粉生成葡萄糖的酶量，從而計(jì)算出酶活。一個(gè)酶活力單位定義為在pH 5.0，溫度60 ℃下1 min酶促反應(yīng)生成1 mg還原糖含量。

1.2.5 糖化酶酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定。分別在40、50、60、70、80 ℃下反應(yīng)2 h測(cè)定原始糖化酵母和轉(zhuǎn)化釀酒酵母中的糖化酶酶活，繪制最適溫度曲線。分別調(diào)節(jié)粗酶液pH 2～8，使酶促反應(yīng)在60 ℃不同pH中反應(yīng)2 h測(cè)定原始糖化酵母和轉(zhuǎn)化釀酒酵母中的糖化酶酶活，繪制最適pH曲線。在60 ℃、pH 5.0條件下分別保溫20、40、60、80、120、140、160、180 min，測(cè)定不同反應(yīng)時(shí)間下原始糖化酵母和轉(zhuǎn)化釀酒酵母的酶活，比較2種菌株產(chǎn)生糖化酶的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組釀酒酵母表達(dá)載體構(gòu)建

2.1.1目的基因連接并轉(zhuǎn)化。將從糖化酵母中提取的目的基因STA1連接到pUM-T質(zhì)粒中并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。篩選出陽(yáng)性克隆并通過(guò)菌落PCR進(jìn)行DNA電泳鑒定。當(dāng)轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒pUM-T時(shí)沒(méi)有擴(kuò)增出任何條帶，而轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pUM-T-sta1后在2 700 bp左右出現(xiàn)單一明亮條帶，與目的基因STA1大小相符，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.1.2 重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建。用Acc65I與BspDI雙酶切重組質(zhì)粒pUM-T-sta1與表達(dá)載體pRS416，分離提純目的基因STA1并通過(guò)T4DNA連接酶與表達(dá)載體pRS416連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pRS416-sta1，結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.1.3重組表達(dá)質(zhì)粒pRS416-sta1轉(zhuǎn)化。將重組表達(dá)質(zhì)粒PRS416-stal轉(zhuǎn)化釀酒酵母。篩選陽(yáng)性克隆并提取質(zhì)粒，通過(guò)Acc65I與BspDI雙酶切，DNA凝膠電泳顯示在5 000 bp左右與2 700 bp左右出現(xiàn)亮帶，與質(zhì)粒大小4 898 bp，目的基因STA1大小2 700 bp大小符合，結(jié)果見(jiàn)圖3。進(jìn)一步測(cè)序表明目的基因正確導(dǎo)入釀酒酵母中。

2.2 釀酒酵母陽(yáng)性克隆鑒定 將轉(zhuǎn)化后的釀酒酵母點(diǎn)接于淀粉固體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)48 h，用碘蒸汽熏染培養(yǎng)基。由圖4可知，轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pRS416-sta1的釀酒酵母菌落周圍出現(xiàn)透明圈，而轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒pRS416的釀酒酵母菌落周圍沒(méi)有出現(xiàn)透明圈。說(shuō)明糖化酶能在釀酒酵母中表達(dá)并分泌到胞外水解淀粉。

2.3糖化酶的SDS-PAGE檢測(cè) 對(duì)轉(zhuǎn)化后的釀酒酵母進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。目的基因STA1有效片段約為2 400 bp，理論蛋白大小為80 kD左右。SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒的釀酒酵母相比，轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pRS416-sta1的釀酒酵母在80 kD左右出現(xiàn)明顯亮帶，結(jié)果與理論蛋白大小相一致(圖5)。

2.4糖化酶酶學(xué)性質(zhì) 將糖化酵母和重組釀酒酵母接種于淀粉液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)3 d，離心取上清液，經(jīng)過(guò)透析和濃縮處理，以5%可溶性淀粉溶液為底物進(jìn)行酶解反應(yīng)，采用DNS法測(cè)定溶液中還原糖含量以計(jì)算酶活，并對(duì)比2種菌株中的糖化酶酶學(xué)性質(zhì)。

由圖6可知，重組的釀酒酵母產(chǎn)生的糖化酶最適溫度為60 ℃，最適pH 5.0，在60 ℃、pH 5.0時(shí)酶活最高為120 U/ml左右。與原菌株產(chǎn)生糖化酶相比，2種菌株產(chǎn)生糖化酶隨pH與溫度變化基本相同，轉(zhuǎn)化釀酒酵母后并未影響其酶的性質(zhì)。

由圖7可知，重組的釀酒酵母產(chǎn)生的糖化酶酶活隨時(shí)間變化比糖化酵母的更為穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化后糖化酶在120 min內(nèi)酶活保持穩(wěn)定，而原始菌株的糖化酶在100 min左右呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

2.5重組質(zhì)粒pRS416-sta1在釀酒酵母中的穩(wěn)定性 將攜帶重組質(zhì)粒pRS416-sta1的釀酒酵母在無(wú)選擇壓力的YPD液體培養(yǎng)基中多次傳代培養(yǎng)后，取樣涂平板，挑取單菌落分別點(diǎn)種于YPD完全培養(yǎng)基和含氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)2 d。能在YPD培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，不能在選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的即為重組質(zhì)粒丟失的菌落。結(jié)果表明，在完全培養(yǎng)基中共生長(zhǎng)菌落247個(gè)，選擇培養(yǎng)基中共生長(zhǎng)菌落224個(gè)，所以其丟失率約為9.3%，證明重組質(zhì)粒pRS416-sta1在釀酒酵母中能穩(wěn)定表達(dá)。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)成功構(gòu)建了表達(dá)糖化酵母STA1基因的釀酒酵母表達(dá)載體，篩選并獲得了能穩(wěn)定表達(dá)糖化酶基因的重組釀酒酵母菌株。對(duì)比糖化酵母與釀酒酵母產(chǎn)生的糖化酶酶學(xué)性質(zhì)與穩(wěn)定性，結(jié)果表明重組菌株產(chǎn)生糖化酶性質(zhì)與原菌株基本相同，轉(zhuǎn)化過(guò)程并未影響其表達(dá)產(chǎn)物活性，且轉(zhuǎn)化后的糖化酶酶活隨時(shí)間變化更加穩(wěn)定，酶促反應(yīng)2 h后仍有約90%酶活，且得到糖化酶的最適溫度為60 ℃，最適pH為5.0，在此條件下達(dá)到最大酶活約為120 U/ml。

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