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(1.湖南省人民醫(yī)院檢驗科，湖南 長沙 410005；2.湖南省人民醫(yī)院臨床輸血科；3.中南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)研究中心)

·技術(shù)與方法·

一步法分離石蠟切片DNA的改進(jìn)與鑒定

彭劍橋1，雷平2，楊秦3，朱敏3*

(1.湖南省人民醫(yī)院檢驗科，湖南 長沙 410005；2.湖南省人民醫(yī)院臨床輸血科；3.中南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)研究中心)

目的改進(jìn)一種以含蛋白酶K的裂解液作用于石蠟包埋處理的細(xì)胞、分離DNA粗提液用于PCR擴(kuò)增的實驗方案。方法石蠟包埋組織切片經(jīng)常規(guī)脫蠟處理，用蛋白酶K裂解液洗脫細(xì)胞，55 ℃消化3 h后離心，吸取上清液；分光光度法檢測DNA酶裂解液質(zhì)量和濃度；以之為模板分別擴(kuò)增人線粒體基因微衛(wèi)星多態(tài)D310區(qū)、ATPase6基因區(qū)和核基因HBB、BRCA1等的DNA片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測分析PCR擴(kuò)增情況，并測序驗證擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果以石蠟切片的DNA裂解粗提液為模板，擴(kuò)增目的DNA片段陽性率可達(dá)100%；獲得序列分析驗證。結(jié)論改進(jìn)的蛋白酶K裂解液一步洗脫消化法操作簡單、過程快捷、費用低廉，能快速有效地分離石蠟組織切片DNA，用于后續(xù)PCR擴(kuò)增檢測，具有較高效率。

DNA分離； 石蠟包埋組織切片； 線粒體DNA； 核基因

越來越多的研究表明，人類多種復(fù)雜疾病如各種腫瘤、糖尿病、高血壓、AD、PD、心血管疾病等的發(fā)生發(fā)展均與多重遺傳因素相關(guān)，不僅包括核基因變異，也包括線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)變異[1]，同時，這些關(guān)聯(lián)在不同人群中可能存在差別。為確證基因變異與不同疾病的相關(guān)性及其人群差異性，必須在人群中開展大規(guī)模的遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)分析；而如果能對醫(yī)院病理科積存的大量石蠟包埋組織切片加以有效利用，將有助于規(guī)避相關(guān)工作中耗時長的標(biāo)本收集階段，從而縮短研究進(jìn)程、提高研究效率。從石蠟包埋組織切片中分離DNA或RNA雖然已經(jīng)建立了比較成熟的方法[2-6]，但大多程序繁瑣，且試劑盒純化系統(tǒng)價格不菲，對大樣本處理而言勞動量大、費用高昂。本文根據(jù)文獻(xiàn)[7]介紹的方法，運用含蛋白酶K的細(xì)胞裂解(消化)液直接洗脫和消化，對石蠟包埋處理的組織切片(包括新近制備和空氣曝露5年以上的陳舊切片)，分離其中細(xì)胞DNA成分，并進(jìn)一步進(jìn)行其PCR擴(kuò)增應(yīng)用的分析。

1 材料與方法

1.1樣本石蠟包埋病理組織切片取自湖南省人民醫(yī)院和中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院病理科。

1.2試劑二甲苯、無水乙醇、Tris粉等購自上海國藥集團(tuán)；蛋白酶K、Taq DNA聚合酶、dNTP等購自鼎國公司；DNA裂解消化緩沖液含0.5 mg/mL蛋白酶K、0.05 mol/L Tris-HCl(pH 8.5)、1 mmol/L EDTA和0.5% Tween-20[1]。

擴(kuò)增包含人mtDNA D310 區(qū)(包含poly C微衛(wèi)星多態(tài))、部分ATPase6基因編碼區(qū)(包含mtDNA單倍型特異性遺傳標(biāo)志8701A/G SNP位點)及核內(nèi)的人乳腺癌易感風(fēng)險基因1(breast cancer 1，early onset,BRCA1)和人β-珠蛋白(hemoglobin beta，HBB)基因部分片段的引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小見表1。引物由北京鼎國公司合成。

表1PCR擴(kuò)增引物

基因名稱引物序列/退火溫度片段大小ntDNA微衛(wèi)生多態(tài)D310區(qū)5′?ACAATGAATGTCTTGCACAGC?CACTT?3′(上游)109bp5′?GGCAGAGATGTGTTTAAGT?GCTG?3′(下游)/60℃mtDNAATPase65′?AAGATTAAGAGAACCAACAC?CTCT?3′(上游)415bp5′?GTGGCAATAAAAATGATTAAG?GA?3′(下游)/58℃BRCAl5′?CATCTGGTAAGTCAGCA?CAAGAG?3′(上游)105bp5′?ACATGTCTTTTCTTCCCTAG?TATGT?3′(下游)/64℃HBB5′?GTGCACCTGACTCCTGAGGA?GA?3′(上游)102bp5′?CCTTGATACCAACCTGCCCAG?3′(下游)/58℃

1.3 DNA提取在通風(fēng)櫥內(nèi)將載玻片上的石蠟切片以二甲苯靜置洗脫約10 min，無水乙醇浸泡洗滌5 min×3次；脫蠟后的組織片變得疏松，室溫下水平放置至無水乙醇完全揮發(fā)，然后以約180 μL消化液分次沖洗，將組織片轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管內(nèi)，55 ℃消化3 h后沸水浴10 min以滅活蛋白酶K；12 000 rpm離心10 min后吸取上清液轉(zhuǎn)入一潔凈新離心管內(nèi)，小心避免吸入沉淀殘渣及懸浮的石蠟碎片；上清液即為所獲DNA酶解溶液，各取1 μL在NanoDrop儀上進(jìn)行DNA濃度測定和質(zhì)量檢測；余樣置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴(kuò)增反應(yīng)在20 μL PCR混合物中進(jìn)行，其中含模板DNA約50 ng、200 μmol/L 4種dNTP、上游和下游引物各5 pmol、KCl 50 mmol/L、Tris-HCl (pH 8.3，25℃) 10 mmol/L、MgCl21.5 mmol/L及0.2 U Taq DNA聚合酶。擴(kuò)增參數(shù)為94 ℃變性30 s、相應(yīng)溫度退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)40次，最后于72℃充分延伸10 min。

1.5 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測及其測序分析取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行2.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色后紫外燈下觀察結(jié)果，照相保留。

剩余PCR產(chǎn)物送至鉑尚(Biosune)生物技術(shù)公司進(jìn)行DNA序列分析。

2 結(jié) 果

2.1 DNA粗提液的紫外分光光度法檢測通常如果在A260 nm處有最大吸收峰值，A260/280值大于1.8而小于2.0，表明樣品DNA具有正常質(zhì)量。部分石蠟切片樣本DNA提取液質(zhì)量檢測結(jié)果顯示：與對照(從正常人外周血白細(xì)胞分離的基因組DNA)不同，絕大部分樣品的A260/280值僅為1.0左右，同時A260/230值極低(圖1)；此外，在吸收峰曲線中A260 nm處未出現(xiàn)明顯的銳峰。

進(jìn)一步對上述各樣品取約100 ng進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以從正常人外周血白細(xì)胞分離的基因組DNA為對照，可見較分子量標(biāo)志物23 130 bp位置略高的DNA條帶，但全部10例石蠟切片DNA樣品在各自泳道上未呈現(xiàn)DNA區(qū)帶(圖2)。

圖1 10例不同石蠟切片DNA粗提液的質(zhì)量檢測結(jié)果 “control”為1例外周血白細(xì)胞基因組DNA

圖2 10例不同石蠟切片DNA粗提液的瓊脂糖凝膠電泳 M:λDNA/HindⅢ分子量標(biāo)志物(小片段已電泳脫離凝膠)； 1：對照(外周血白細(xì)胞基因組DNA)； 2～11：10例不同石蠟切片標(biāo)本DNA分離物(含DNA 100 ng)

2.2 PCR擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電泳檢測經(jīng)與50 bp DNA梯級分子量標(biāo)志物比較，所獲mtDNA D310區(qū)、ATPase6、HBB和BRCA1基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期吻合(圖3，表1)。但4對引物的擴(kuò)增檢測情況不盡相同，與BRCA1(圖3D)相比，ATPase6(圖3B)和HBB(圖3C)的陽性率明顯更高，而mtDNA D310區(qū)陽性率最低；此外，在標(biāo)志物50 bp位置處多呈現(xiàn)一致密區(qū)域，系引物二聚體。

增加模板用量至100 ng后，mtDNA D310區(qū)擴(kuò)增可見每個樣本均獲目的產(chǎn)物。

圖3 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測 M：50 bp DNA梯級分子量標(biāo)志物；C：陽性對照；1～10：10個不同樣本

2.3 PCR產(chǎn)物測序PCR產(chǎn)物直接測序結(jié)果進(jìn)一步表明所獲擴(kuò)增物與設(shè)計相吻合。對部分具有明顯識別標(biāo)志(如D310 polyC微衛(wèi)星多態(tài)區(qū)、mtDNA 8701A/G SNP位點)進(jìn)行了搜索分析(圖5)。

3 討 論

根據(jù)文獻(xiàn)[1]配制的DNA消化液中未使用強(qiáng)去垢劑SDS，而是較為溫和的Tween 20，因為后者同樣具有極強(qiáng)的破壞細(xì)胞膜功能但對后續(xù)PCR反應(yīng)影響不大，同時，溶液中含有適當(dāng)濃度蛋白酶K，從而能一步完成甲醛固定細(xì)胞的裂解及蛋白消化，促進(jìn)切片上細(xì)胞DNA的分離。

圖4 模板DNA增量(至100 ng)后mtDNA D310區(qū)的PCR擴(kuò)增檢測 M：50 bp DNA梯級分子量標(biāo)志物；C：陽性對照；泳道2～11：10個不同樣本

圖5 部分PCR產(chǎn)物的DNA序列分析結(jié)果 A：mtDNA D310區(qū)(下劃線部分為poly C微衛(wèi)星多態(tài)部分)；B：mtDNA ATPase6基因(以下游引物測序結(jié)果，箭頭所指處為8 701 G，系mtDNA宏單倍型M的標(biāo)志SNP基因型之一)

DNA分離提取產(chǎn)率是制約石蠟包埋陳舊組織標(biāo)本用于PCR擴(kuò)增檢測的難點之一。提取效率取決于兩個方面：一是所用細(xì)胞數(shù)量，二是裂解消化的效率。最初在脫蠟處理后的玻片上直接滴加消化裂解液進(jìn)行原位消化，結(jié)果在55℃較高溫度、3 h較長時間處理過程中，因液體揮發(fā)嚴(yán)重，無法發(fā)生有效裂解和消化；因此改進(jìn)為將脫蠟后組織片用消化裂解液洗脫并轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，且每隔1小時低速瞬時離心富集液體，以補(bǔ)償因水分揮發(fā)對細(xì)胞裂解和蛋白酶K消化作用的抑制。

針對切片上有限的細(xì)胞數(shù)量，為獲得盡可能大的DNA產(chǎn)量，需用消化裂解液充分洗脫玻片上組織殘片，盡量避免細(xì)胞的丟失。我們將180 μL溶液分三次沖洗收集細(xì)胞，每次用200 μL移液器吹出液體、沖擊疏松的組織片，并使玻片一角伸入1.5 mL離心管管腔，使得液體匯聚后從角尖滴入管內(nèi)。

由圖2可以看出樣本間濃度差別明顯，這主要是因為切片上固定的組織細(xì)胞數(shù)量相互間還存在差別。DNA純度根據(jù)A260/280比值判斷，純度高的DNA樣品，其值在1.8左右，若比值高于1.9，說明DNA樣品中RNA未除盡；若比值低于1.6，則表明樣品中含有酚和/或蛋白質(zhì)污染。本研究在組織消化后未進(jìn)行純化處理，因此DNA酶解分離液中含有大量蛋白質(zhì)和有機(jī)類雜質(zhì)，導(dǎo)致所有樣本A260/280值均顯著低于1.6，同時A260/230值均遠(yuǎn)小于2，提示高鹽離子濃度；瓊脂糖凝膠電泳中未出現(xiàn)DNA條帶的原因在于切片DNA主體為片段化的核酸分子，大小不一，因此無法簇集形成致密區(qū)帶。然后，由于后續(xù)PCR實驗對模板DNA的純度要求并不高，且所擴(kuò)增多為小DNA片段(多為100 bp左右，不超過500 bp)，因此適用此方案；若對DNA樣品有純度要求，可用常規(guī)方法如酚/氯仿法、柱層析法等進(jìn)一步抽提純化，但推測將造成DNA得率的下降。

由圖3可以看到，在PCR擴(kuò)增驗證實驗中，絕大部分樣品獲得4對引物相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物，雖然陽性率和強(qiáng)度不一；而部分樣品擴(kuò)增產(chǎn)物帶極弱或呈陰性的原因，推測有二：①切片上細(xì)胞數(shù)量過少，導(dǎo)致分離所獲DNA產(chǎn)量極低下，如樣品5，濃度僅為9.3 μg/mL，與其他樣品相差達(dá)數(shù)倍至數(shù)十倍，故其4種PCR產(chǎn)物均相對較少，條帶弱；②模板DNA降解，導(dǎo)致起始分子數(shù)過少、模板效用性過于低下所致。如樣品9和10，盡管表觀測定濃度分別達(dá)到75.9 μg/mL和47.4 μg/mL，但擴(kuò)增條帶弱甚至呈陰性。但從總體來看，通過增加模板用量可提高擴(kuò)增陽性率、增加產(chǎn)物量，如圖4所示，針對相同條件下mtDNA D310區(qū)擴(kuò)增陽性率偏小的情況，增加1倍的模板用量至100 ng/20 μL反應(yīng)，結(jié)果全部樣品均獲得理想的擴(kuò)增檢測結(jié)果。

引起石蠟包埋組織細(xì)胞DNA降解的原因來自多個方面。在組織塊經(jīng)歷甲醛固定和高熱石蠟冷卻包裹的過程中，細(xì)胞內(nèi)DNA易受損傷，加之所用切片多在空氣中曝露達(dá)1年以上，這可能是造成DNA嚴(yán)重降解、所提取多為碎片化較小DNA分子并導(dǎo)致其用于PCR擴(kuò)增時模板效率下降的主要原因。但是，這種影響對細(xì)胞質(zhì)中線粒體DNA和核基因有較大差別：每個細(xì)胞具有數(shù)十至數(shù)百個線粒體，每個線粒體可擁有1個以上mtDNA分子，因而細(xì)胞內(nèi)mtDNA可達(dá)數(shù)百到上千個拷貝，同時分子尺寸較小—人類線粒體DNA為僅16 569 bp的環(huán)狀分子；而核基因多系細(xì)胞內(nèi)單個拷貝，且為長鏈大分子，加之二甲苯法雖脫蠟較為徹底，但容易導(dǎo)致DNA長鏈斷裂、降解；因DNA拷貝數(shù)量和分子大小的雙重因素，mtDNA在耐受降解上具有相對核基因的顯著優(yōu)勢。當(dāng)然，PCR擴(kuò)增效率并非完全取決于模板效用性，還與引物及待擴(kuò)增區(qū)域的結(jié)構(gòu)等有關(guān)，本文中D310區(qū)的擴(kuò)增在其他條件一致的情況下反而較核基因如HBB更差可能屬于后者。

本研究結(jié)果表明，改進(jìn)的蛋白酶K裂解液“一步法”能快速從石蠟包埋組織切片中分離獲得細(xì)胞DNA，因不經(jīng)純化回收處理，不僅產(chǎn)率不致嚴(yán)重受損，且規(guī)避了繁瑣的純化處理過程和昂貴的試劑費用；即使來自陳舊標(biāo)本DNA粗提液也可有效用于PCR擴(kuò)增線粒體基因片段。因此，醫(yī)院病理科歷年來所積存的病理組織包埋塊或切片都可提供作為至少線粒體DNA疾病遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)研究的重要標(biāo)本來源，同時，mtDNA序列表征人類母系遺傳背景，對于個體鑒別等也具有重要意義，而犯罪現(xiàn)場或災(zāi)難事故現(xiàn)場來源的陳舊血跡、毛發(fā)等核酸包含材料，完全有可能視為石蠟切片的情況，可進(jìn)行相似的高效、快速核酸分離。

綜上，盡管石蠟切片上經(jīng)高溫和有機(jī)溶劑處理獲取DNA數(shù)量有限、且質(zhì)量難以控制，但用于某些定性研究工作如基于PCR短片段擴(kuò)增的個體基因分型，尤其對線粒體DNA的相關(guān)工作，仍然提供了來源豐富而合理的優(yōu)質(zhì)資源。

[1] Zhou WM,Zhu M,Gui M,et al.Peripheral blood mitochondrial DNA copy number is associated with prostate cancer risk and tumor burden[J].PLoS One,2014 9(10):e109470.doi:10.1371/journal.pone.0109470.eCollection 2014.

[2] Yuan YT，Jiang YX，Yin XW，et al.Comparison of four methods for DNA extraction from paraffin-embedded tissues[J].J Clinic Rehabilitative Tissue Engineering Res，2010,14(24):4430-4434

[3] 張素娟，趙彤，董敬朋，等.石蠟切片提取方法的改良及其臨床應(yīng)用臨床[J].臨床與實驗病理學(xué)雜志,1996，R446:62-65.

[4] 趙吉生，蓋寶東，森隆弘，等.石蠟包埋組織中提取DNA應(yīng)用于PCR 反應(yīng)影響因素的研究[J].中國實驗室診斷雜志，2003，7:330-333.

[5] 宋麗新，高興華，張士發(fā)，等.石蠟包埋組織中DNA提取方法的對比研究[J].中國麻風(fēng)皮膚病雜志，2006,22(4):268-269.

[6] 白春英，郝俊海，白海花.石蠟包埋組織中DNA的提取[J].生物學(xué)雜志,2002，19(3):35-36.

[7] Aral C,Kaya H,Ataizi-Celikel C，et al.A novel approach for rapid screening of mitochondrial D310 polymorphism[J].BMC Cancer,2006,6:21-25.

DNAIsolationfromParaffinSectionsbyanAdjustedOne-StepProtocolanditsQualificationTestbyPCR

PENG Jianqiao,LEI Ping,YANG Qin,et al

(ClinicalLaboratory,HunanProvincialPeople’sHospital,Changsha,Hunan410005,China)

ObjectiveTo improve a simple method to extract DNA from tissues fixed in paraffin sections by direct digestion with proteinase K lysis buffer.MethodsFormalin-fixed paraffin-embedded sections were routinely deparaffinized and then the tissues were washed off for the glass slides using digestion buffer with proteinase K and transferred into a 1.5 mL microtube for each sample.After incubation at 55 ℃ for 3 h,the supernatant containing DNA was transferred into a new tube.The DNA concentration and A260/280values of the lysate were assayed by ultraviolet spectrophotometry.Amplification of the mitochondrial DNA fragment flanking D310 microsatellite region,part of the ATPase6 gene as well as nuclear genes HBB and BRCA1 were performed,and PCR amplification following detection with agarose gel electrophoresis was analyzed.ResultsAs shown by agarose gel electrophoresis and DNA sequence analysis,all the target mtDNA fragments were successfully amplified by PCR using the DNA lysate directly as template.ConclusionA simple-manipulation,rapid-procedure and low-cost method for DNA separation from paraffin sections was presented here,by which the DNA content was extracted by one-step digestion with proteinase K lysis buffer;its effectiveness were evidenced by PCR of mitochondrial DNA and nuclear DNA fragments.

DNA extraction; paraffin-embedded sections; mitochondrial DNA; nuclear gene

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.06.027

2015-08-21；

2015-10-22

湖南省科技計劃(2010FJ3084)；中南大學(xué)學(xué)位與研究生教育教學(xué)改革研究(2340-74333003019)；中南大學(xué)教師科研基金(2013JSJJ042).

*通訊作者，E-mail:zhumin0678@yahoo.com.

R446

A

(此文編輯：朱雯霞)