陳 溪， 程 磊， 曲世超， 黃大亮， 劉佳成，崔 晗， 賈彥波， 紀明山

（1. 沈陽農業(yè)大學植物保護學院，遼寧 沈陽110866；2. 大連出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，遼寧 莊河116400；3. 上海愛博才思分析儀器貿易有限公司，北京100015）

我國是世界上最大的水稻生產(chǎn)國之一，全國近60%的人口以大米為主食。我國也是大米出口國，自1994 年以來，每年出口大米200 多萬噸，主要出口日本、韓國和非洲一些國家。農藥的使用可以提高農產(chǎn)品的產(chǎn)量和品質，但隨著其廣泛使用，農藥殘留問題已引起社會的廣泛關注，國際社會設置了嚴格的限量標準。國際食品法典委員會（CAC）規(guī)定糧谷中的最高農藥殘留限量（MRL）為0.02 ～20.0 mg／kg；我國于2014 年實施了國家標準GB 2763-2014《食品中農藥最大殘留限量》，涉及農藥387種、檢測項目3 650 項［1］。目前，出口至韓國的大米農殘檢驗項目已擴增到293 項，出口至日本的大米農殘檢驗項目擴增到581 項。我國對于大米樣品的檢測常采用GB／T 20770-2008，采用該方法通常不能得到用來確證的質量較好的二級質譜圖，發(fā)現(xiàn)疑似陽性樣品時需要重新設定方法，將樣品重新分析測定一次，影響效率并增加了工作量。因此建立大米中農藥多殘留的快速篩查和確證方法具有重要意義。

目前，用于農藥多殘留檢測的前處理技術已有多篇綜述類文獻報道，主要有超臨界流體萃取（SFE）、加速溶劑萃?。ˋSE）、微波輔助萃取（MAE）、固相萃?。⊿PE）、固相微萃?。⊿PME）、凝膠滲透色譜（GPC）、基質固相分散萃取（MSPD）、分子印跡（MIP）和QuEChERS 等技術［2-6］，其中QuEChERS 因簡便、快速、安全、高效等優(yōu)點而應用廣泛。農藥多殘留的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）［7-9］、氣相色譜法（GC）［10］、氣相色譜-質譜法（GC-MS）［11-13］、氣相色譜-串聯(lián)質譜法（GCMS／MS）［14-17］、液相色譜法（LC）［18，19］、液相色譜-質譜法（LC-MS）［20，21］、液相色譜-串聯(lián)質譜法（LCMS／MS）［22-28］等，其中LC-MS／MS 的靈敏度和準確性高，應用廣泛。

液相色譜-三重四極桿復合線性離子阱質譜（LC-Q-TRAP／MS）具有多反應監(jiān)測-信息關聯(lián)采集-增強子離子掃描（MRM-IDA-EPI）檢測模式，能夠對未知化合物進行雙重定性，大大排除了假陽性結果，提高了定性分析的準確度；并且能夠利用高選擇性和高靈敏度的s-MRM 掃描獲得化合物的峰面積信息，對化合物進行定量分析。本文結合QuEChERS和LC-MS／MS 建立了大米中205 種農藥的快速篩查分析方法，與傳統(tǒng)的目標化農藥殘留檢測方法相比，該方法適合對食品中的非目標農藥進行掃描和鑒定，并通過二級譜庫檢索進一步確證。該方法能夠一次進樣同時檢測大米中殺蟲劑、殺螨劑、除草劑、殺線蟲劑、殺菌劑、生長調節(jié)劑等各種農藥，比GB／T 20770-2008 擴增了74 個檢測項目，并且具有快速、準確、靈敏度高等特點，不用分組便能準確進行定性和定量分析，對大米樣品進行實際檢測僅需20 min。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

AB SCIEX 5500 QTRAP 三重四極桿復合線性離子阱質譜系統(tǒng)（美國Applied Biosystems 公司）；Shimadzu HPLCXR系統(tǒng)（日本島津公司）；冷凍離心機3K15（德國Sigma 公司）；旋渦混合器MS3（德國IKA 公司）。

乙腈、甲醇（HPLC 級，德國Merck 公司）；甲酸、甲酸銨、乙酸（HPLC 級，上海安譜科學儀器有限公司）；PSA、C18吸附劑（美國Agilent 公司）；聚丙烯離心管15 mL、50 mL（德國Greiner 公司）；濾膜0.2 μm Econofilters PTFE（聚四氟乙烯）（美國Agilent 公司）；GSB（石墨化炭黑，美國Supelco 公司）；無水MgSO4、無水CH3COONa、無水Na2SO4（分析純，科密歐公司）；高純水（經(jīng)Milli-Q 超純水器純化得到）。標準品購自蘭伯瑞公司（A ～H，J，K 10 組，共計205 種農藥），質量濃度為100 mg／L，純度均大于98.3%。

1.2 標準溶液的配制

從上述10 組質量濃度為100 mg／L 的混合標準乙腈溶液中各取10 μL，用900 μL 乙腈稀釋，制備質量濃度為1 mg／L 的儲備液，于-18 ℃冰箱中保存。用空白大米樣品基質液作為溶劑，將上述儲備液逐級稀釋制備標準工作曲線溶液，質量濃度分別為0.1、0.25、0.5、2、5、10、15、20 μg／L。

1.3 樣品前處理

按照GB 5491-1985 扦取的大米樣品經(jīng)過粉碎機粉碎，過20 目篩，混勻，密封作為試樣。精確稱取5.00 g 樣品于50 mL 離心管中，加入10 mL 水，渦旋混合1 min；加入乙腈（含0.1% （v／v）乙酸）15 mL，渦旋1 min；加入6 g 無水MgSO4與1.5 g CH3COONa，劇烈振搖20 s 至塊狀結晶散開，4 000 r／min 離心5 min。取上清液8 mL 于預先加有400 mg PSA、1 200 mg 無水MgSO4及400 mg C18吸附劑的15 mL 離心管中，渦旋混合15 min，4 000 r／min 離心5 min，上清液過0.2 μm 的濾膜后，供LC-Q-TRAP／MS 測定。

1.4 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Synergi Fusion-RP C18（50 mm×2.0 mm，粒徑2.5 μm，孔徑10 nm）；柱溫：40 ℃；流動相：A 相為5 mmol／L 甲酸銨水溶液（將5 mL 1 mol／L 甲酸銨溶液與895 mL 水、100 mL 甲醇混合超聲即得）；B 相為5 mmol／L 甲酸銨甲醇溶液（將5 mL 1 mol／L 甲酸銨溶液與95 mL水、900 mL 甲醇混合超聲即得）；流速：0.4 mL／min；梯度洗脫程序：0 ～1.0 min，100%A；1.0～15.0 min，100% A ～100% B；15.0 ～18.0 min，100%B；18.0～18.1 min，100%B～100%A；20 min完成梯度洗脫程序。進樣量：10 μL。

1.5 質譜條件

離子源溫度：550 ℃；掃描模式：正離子模式；離子化電壓（IS）：＋5 500 V；氣簾氣（CUR）壓力：241.3 kPa；MRM-IDA-EPI 檢測模式；噴霧氣（GS1）壓力：379.2 kPa；輔助加熱氣（GS2）壓力：413.7 kPa；接口的加熱器：On；碰撞氣（CAD）壓力：High；智能MRMTM時間監(jiān)測窗口：120 s；目標掃描時間：0.7 s；入口電壓（EP）：10 V；出口電壓（CXP）：13 V；其他參數(shù)見表1。

2 結果與討論

2.1 QuEChERS 前處理方法的優(yōu)化

QuEChERS 是一種快速、簡單、廉價、高效、耐用、安全的樣品前處理方法，參考AOAC 2007.01［29］和EN 15662［30］兩種方法對鹽析劑和吸水劑進行選擇。常用的鹽析劑為NaCl 和CH3COONa，吸水劑為無水Na2SO4和無水MgSO4，本文分別對此進行了比較分析。對于兩種鹽析劑，結果表明NaCl 和CH3COONa 對回收率沒有顯著的影響，平均回收率相差在3.0%以內。苯噻草胺是除草劑中的噻唑多環(huán)化合物，雙硫磷是有機磷類殺蟲劑，咪唑菌酮為含苯胺基的殺菌劑，綠麥隆為含苯甲基除草劑，西草凈為三嗪類芽前除草劑，嘧菌酯為甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，這些化合物能代表大多數(shù)化合物的結構特點，因此在10 μg／L 添加水平下，本文以上述6 種農藥為考察對象，考察了無水MgSO4和無水硫酸鈉兩種吸水劑對農藥提取效果的影響。結果表明，使用無水MgSO4的回收率要優(yōu)于無水硫酸鈉，回收率提高了0.9%～31.7%。原因在于凈化步驟中使用的PSA 屬于正相吸附劑，樣品含水量越少凈化效果越好，無水MgSO4的吸水能力強且在吸水過程中放熱，有利于農藥的提??；而且無水MgSO4粒度較小，在振搖和渦旋過程中與樣品的混合更加充分，并能夠與乙腈發(fā)生協(xié)同作用從而提高提取效率。另外，QuEChERS 方法在凈化過程中，常采用PSA 吸附劑除去樣品基質中的有機酸、色素、糖、脂肪酸等，GCB去除甾體、葉綠素、類胡蘿卜素等，C18吸附劑除去基質中的脂肪和脂類等非極性有機物，因此在凈化過程中僅添加了PSA 和C18吸附劑用于吸附大米樣品中的脂肪酸、氨基酸、脂肪和脂類等有機物。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 流動相的選擇

電噴霧質譜中樣品的電離是在溶液狀態(tài)下進行的，因此流動相的組成和添加劑不僅影響分析物的色譜保留時間和峰形，還會影響分析物的離子化效率，從而影響目標化合物的檢測靈敏度。由于質譜檢測要求流動相的揮發(fā)性能好，而且甲醇是質子性溶劑，有利于樣品離子化，因此本文考察了5 mmol／L 甲酸銨水溶液與5 mmol／L 甲酸銨甲醇溶液二元體系、甲醇-1%（v／v）甲酸水溶液和甲醇水溶液分別作為流動相時對農藥殘留的分離效果。對10 μg／L 的205 種農藥混合標準溶液進行分析，發(fā)現(xiàn)僅以甲醇水或者添加1%（v／v）甲酸作為流動相時，樣品中許多組分有峰拖尾現(xiàn)象，且霜霉威、滅蠅胺、呋蟲胺等農藥尤為嚴重，原因可能是流動相的pH 值不適合農藥組分的分離。而采用5 mmol／L甲酸銨水溶液與5 mmol／L 甲酸銨甲醇溶液作為流動相時，205 種農藥的響應較好；進一步調節(jié)流動相的比例，205 種農藥都能得到較好的分離。因此選用5 mmol／L 甲酸銨水溶液與5 mmol／L 甲酸銨甲醇溶液作為流動相。

2.2.2 色譜柱的選擇

根據(jù)待測農藥性質，一般選擇C18色譜柱。本文共考察了4 種色譜柱：1 號色譜柱Phenomenex Synergi Fusion-RP C18柱（50 mm×2.0 mm，2.5 μm）；2 號色譜柱Waters ACQUITY UPLC BEN C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；3 號色譜柱Phenomenex Synergi Fusion-RP C18柱（50 mm×2.0 mm，4 μm）；4 號色譜柱RESTEK Ultra AQ C18柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）。實驗發(fā)現(xiàn)采用1號色譜柱可以實現(xiàn)205 種農藥較好的分離，且峰形較好；2 號色譜柱分析時間長，且峰形較差；3 號色譜柱分離不顯著；4 號色譜柱分析時間較長。考慮到快速分析的要求，本文最終選擇1 號色譜柱。

2.3 質譜條件的優(yōu)化

質譜檢測的各種條件也是影響分析結果的重要因素之一。本文首先通過全掃描確定各農藥的分子離子與特征碎片離子，然后對離子源溫度、噴霧器、輔助加熱氣等操作參數(shù)進行了系統(tǒng)的優(yōu)化，結果表明，當離子源溫度為550 ℃、噴霧器壓力為379.2 kPa、輔助加熱氣壓力為413.7 kPa、氣簾氣壓力為241.3 kPa、離子化電壓為＋5 500 V 時，樣液中所有農藥組分的離子化效率和質譜響應信號均達到最佳。最終，在上述最佳的流動相、色譜柱以及質譜條件下確定了各目標物的定量離子、輔助定性離子、去簇電壓（DP）和碰撞電壓（CE）（見表1）。205 種農藥混合標準溶液在MRM 模式下的總離子流圖見圖1。

圖1 質量濃度均為5 μg／L 的205 種農藥混合標準溶液在MRM 模式下的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram for a mixed standard solution of the 205 pesticides （5 μg／L for each）in MRM mode

表1 205 種農藥的保留時間、定量及定性離子對、DP、CE、平均回收率和相對標準偏差（RSD）（n＝6）Table 1 Retention times，quantitative and qualitative ion pairs，declustering potentials （DP），collision energies （CE），average recoveries and relative standard deviations （RSDs）of the 205 pesticides （n＝6）

表1 （續(xù)）Table 1 （Continued）

表1 （續(xù)）Table 1 （Continued）

表1 （續(xù)）Table 1 （Continued）

表1 （續(xù)）Table 1 （Continued）

2.4 質譜掃描方式的選擇及譜庫的檢索

常規(guī)的串聯(lián)四極桿質譜只能得到MRM 的兩對離子的色譜峰，定性僅靠兩對離子的豐度比確定；本研究使用的儀器是LC-Q-TRAP／MS，并采用了MRM-IDA-EPI 掃描模式，由于該方法使用的是高靈敏度的增強型二級譜庫，譜庫中最少含有4 張譜圖，包括高、中、低3 個能量以及（35±15）V 的平均圖，因此對標準溶液的標準譜圖匹配度較高（均在85%以上）。另外，該譜庫是開放性的，能夠在原有譜庫的基礎上，將205 種農藥的EPI 圖譜補全，進而實現(xiàn)一次進樣同時得到MRM 的色譜圖和相應高靈敏度的EPI 圖，并能夠通過保留時間、碎片離子對及高靈敏度的EPI 圖進行定性、定量分析，有效地降低了假陽性結果。

2.5 方法學驗證

2.5.1 方法的線性范圍、相關系數(shù)及定量限

用空白大米樣品基質液作為溶劑制備標準工作曲線溶液，按1.4 節(jié)及1.5 節(jié)的條件進行測定，以目標物的質量濃度x （μg／L）為橫坐標，定量離子的峰面積y 為縱坐標繪制工作曲線。結果顯示，3-羥基克百威等178 種農藥的線性范圍為0.1 ～20.0 μg／L；阿維菌素、多拉菌素、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、乙酰氨基阿維菌素、氟蟲脲、氟鈴脲、伊維菌素、氰氟蟲腙、莫西菌素、氟酰脲、乙基多殺菌素和多殺霉素12 種農藥的線性范圍為2.0～20.0 μg／L；氟啶脲、氟啶胺和雙硫磷3 種農藥的線性范圍為1.0 ～20.0 μg／L；環(huán)丙唑醇及水胺硫磷的線性范圍為0.25～20.0 μg／L；乙環(huán)唑、乙螨唑、喹螨醚、唑螨酯、氟蟲腈、氟蟻腙、茚蟲威、虱螨脲、噠螨靈和螺甲螨酯10 種農藥的線性范圍為0.5 ～20.0 μg／L。所有農藥的線性相關系數(shù)均大于0.995。以10 倍信噪比（S／N）確定農藥的定量限，205 種農藥的定量限均低于10μg／kg，滿足農藥殘留限量的要求，其中176種農藥的定量限為0.5 μg／kg，3 種農藥的定量限為5 μg／kg，11 種農藥的定量限為2.5 μg／kg，2 種農藥的定量限為1.25 μg／kg，13 種農藥的定量限為10.0 μg／kg。

2.5.2 方法的回收率和精密度

采用QuEChERS 方法對大米樣品進行提取凈化，添加水平為10 μg／kg 時，205 種農藥的平均回收率范圍為62.4%～127.1%，相對標準偏差（RSD）范圍為1.9%～20.0%，其中RSD≤10%的有90 種，10%＜RSD＜20%的有115 種；添加水平為50 μg／kg時，平均回收率范圍為65.9%～120.3%，RSD 范圍為1.0%～18.4%，其中RSD≤10%的有125 種，10%＜RSD＜20%的有80 種（見表1）。該研究方法可以達到檢測低含量多農藥殘留的要求。

2.6 實際大米樣品中205 種農藥殘留的分析檢測

將建立的方法用于市場上購買的3 種東北大米、1 種盤錦大米、1 種泰國大米和1 種五常大米中205 種農藥殘留的快速篩查分析，在MRM-IDA-EPI掃描模式下通過對205 種農藥的篩查分析，發(fā)現(xiàn)有兩種農藥疑似陽性，對其進行譜庫檢索進一步判定未知農藥，通過查看未知化合物增強型二級全掃描譜，并與標準樣品的二級全掃描譜庫匹配，結果顯示在6 個實際樣品中，有一個樣品檢出了三環(huán)唑，與標準譜庫匹配率為94.956%，測定值為5.70 μg／kg；同時該樣品還檢出多菌靈，與標準譜庫匹配率為89.261%，測定值為2.78 μg／kg。在中國的水稻生產(chǎn)過程中，三環(huán)唑與多菌靈是應用較廣的殺菌劑，對防止稻瘟病與胡麻葉斑病具有較好的效果，每年多次使用，若在噴灑農藥過程中沒有注意安全間隔期，可能會導致殘留。將檢出的大米樣品與中國、日本、韓國、歐盟的最大殘留限量（MRLs）要求進行了比對，可以看出該檢測值遠遠低于各國最大殘留限量要求（見表2）。該檢測結果進一步說明了本文所建立的大米中農藥殘留快速篩查和確證方法能夠快速、高靈敏的對農藥殘留進行分析檢測。

表2 大米樣品中檢出的農藥含量和各國最大農藥殘留限量（MRLs）Table 2 Pesticides measured in one rice sample and their MRLs

3 結論

本文采用LC-MS／MS 技術建立了大米中205種農藥殘留的快速篩查分析方法，涵蓋了出口日本的大米農藥殘留檢驗的136 個檢測項目和出口韓國的大米農藥殘留檢驗的88 個檢測項目。與GB／T 20770-2008 相比具有以下區(qū)別及優(yōu)勢：一是本方法涵蓋了標準中的131 個檢測項目，擴增了74 個檢測項目。二是標準中采用的是傳統(tǒng)的三重四極桿串聯(lián)質譜法，將486 種農藥分為7 組，每組的分析時間為23 min；而本方法僅需一次進樣即可檢測205 種農藥，且分析時間僅需20 min。三是標準中采用兩對MRM 及比值定性，判斷是否含有該農藥；而本方法采用MRM-IDA-EPI 掃描模式，一次進樣即可同時得到MRM 和母離子所有高靈敏度的二級碎片，通過譜庫檢索排除假陽性結果。綜上所述，本文建立的方法快速、準確、靈敏度高、篩查范圍廣，適用于大米中農藥殘留的快速、全面篩查分析，為大米進行風險監(jiān)測提供了一種有力的技術手段，可為食品安全監(jiān)管提供有效的保障。

［1］ GB 2763-2014

［2］ Dimitra A L，Triantafyllos A A. Anal Bioanal Chem，2007，389：1663

［3］ Angelika B，Marek B. Food Chem，2008，108（2）：669

［4］ Yolanda F，Alexander J K，Jon W W. J Agric Food Chem，2010，58（10）：5859

［5］ Chen J，Duan C F，Guan Y F. J Chromatogr B，2010，878（17／18）：1216

［6］ Monika K，Marek B. Trends Anal Chem，2010，29（9）：1064

［7］ Zhang R，Liu K C，Cui Y L，et al. RSC Adv，2015，5：35874

［8］ Chen Y N，Kong D Z，Liu L Q，et al. Anal Methods，2015，7：3559

［9］ Yan X，Li H X，Yan Y，et al. Anal Methods，2014，6：3543

［10］ Jin B H，Xie L Q，Wu W D，et al. Chinese Journal of Analysis Laboratory （靳保輝，謝麗琪，吳衛(wèi)東，等. 分析試驗室），2008，27（6）：75

［11］ Zhang W G，Chu X G，Li C J，et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry （張偉國，儲曉剛，李重九，等. 分析化學），2006，34（4）：484

［12］ Nguyen T D，Han E M，Seo M S，et al. Anal Chim Acta，2008，619（1）：67

［13］ GB／T 19649-2006

［14］ Hernández F，Cervera M I，Portolés T，et al. Anal Methods，2013，5：5875

［15］ Hou X，Han M，Dai X H，et al. Food Chem，2012，138（2／3）：1198

［16］ Cheng Z，Zhang R，Liu W H，et al. Chinese Journal of Chromatography （程志，張蓉，劉韋華，等. 色譜），2014，32（1）：57

［17］ Ma Z L，Zhao W，Li L Y，et al. Chinese Journal of Chromatography （馬智玲，趙文，李凌云，等. 色譜），2013，31（3）：228

［18］ Qi R F，Jiang H C，Liu S X，et al. Anal Methods，2014，6：1427

［19］ Jitlada V，Rodjana B. Anal Methods，2012，4：2101

［20］ Sami B，Olivier P，Marie-Florence G L. Anal Bioanal Chem，2003，376：355

［21］ Sami B，Olivier P，Marie-Florence G L. Anal Bioanal Chem，2003，376：157

［22］ GB／T 20770-2008

［23］ Sung J L，Hyeong J P，Wooseong K，et al. Biomed Chromatogr，2009，23（4）：434

［24］ Zahra D，Mohammad K R，Syed W H. Anal Methods，2013，5：1192

［25］ Kang J，F(xiàn)an C L，Chang Q Y，et al. Anal Methods，2014，6：6285

［26］ Li J C，Liu H，Yu M Q，et al. Anal Methods，2014，6：9124

［27］ Gao J Y，Wang J，Zuo M，et al. RSC Adv，2015，5：5895

［28］ Zheng S N，Li L Y，Lin H，et al. Chinese Journal of Chromatography （鄭姝寧，李凌云，林桓，等. 色譜），2013，31（1）：71

［29］ AOAC Official Method 2007.01

［30］ BS EN 15662-2008

［31］ The Japan Food Chemical Research Foundation. Maximum Residue Limits（MRLs）of Agricultural Chemicals in Foods.（2015-03-26）［2015-04-15］. http：／／www.m5.ws001.squarestart.ne.jp／foundation／fooddtl.php？f_inq＝100

［32］ Korea Food ＆Drug Administration. MRLs for Pesticides in Foods-2012. 2. （2012-02-24）. http：／／down.foodmate.net／standard／sort／13／28919.html

［33］ Commission Regulation （EC）No 149／2008