鐘浩博，孫春漢，馬 晉，鄭少偉，陳楚群，賴偉強，楊劍鋒，孫江森

惠州市第一人民醫(yī)院骨科，廣東 惠州 516001

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis,RA）是一種累及周圍關節(jié)組織為主的自身免疫性疾病，以非化膿性增生性滑膜炎為特點，形成侵襲性血管翳，逐漸導致關節(jié)軟骨的破壞及關節(jié)功能的障礙［1］。在RA的發(fā)病機制中，成纖維樣滑膜細胞（fibroblast-like synovial cells,FLS）可以分泌促炎因子TNF-a、IL-1β等，參與關節(jié)炎癥和關節(jié)破壞［2-3］。乳腺癌轉(zhuǎn)移抑制基因(breast cancer metastasis suppressor 1,BRMS1）是一類重要的抑制轉(zhuǎn)移的基因［4］，新近發(fā)現(xiàn)BRMS1也有抑制有促炎作用的核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB核轉(zhuǎn)位的作用［5］。那么，BRMS1在RA中是否可以抑制NF-kB介導的炎癥，尚不可知。因此，本研究旨在探討B(tài)RMS1在RA中的作用及其機制。

1 材料和方法

1.1 材料

高糖型DMEM、胎牛血清（美國Gibco公司），胰蛋白酶（美國Gibco公司）。IL-1β Elisa試劑盒（美國BD公司）。BRMS1、p-IkKa/b、IkKa/b 、IkBa、NF-κB和IL-1β抗兔二抗（美國CST公司）。核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒（凱基生物技術公司）。脂多糖（LPS）（日本日本化藥株會社）。

1.2 取材和FLS原代分離。

4例符合1987年美國風濕病學會（ARA）修訂的RA分類標準［3］的女性病人滑膜標本，取自惠州市第一人醫(yī)院骨外科行關節(jié)置換或關節(jié)鏡手術患者，4℃保存。病人年齡37～58歲，平均47±13歲，病程6～19年，平均10±8.4年。另外分別取1名外傷手術無關節(jié)疾病患者膝關節(jié)滑膜組織。參照黃憲章等［6］人的方法分離原代FLS。無菌條件下剪碎，剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，吸棄過多培養(yǎng)基。用無菌吸管吸氣組織塊，均勻噴灑于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶底，倒置培養(yǎng)瓶，加入4 ml 10%培養(yǎng)基。在5%CO2的37℃孵箱中培養(yǎng)12 h后緩慢翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)1周后可見組織塊周圍有大量細胞，可用PBS沖洗去除組織塊繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞長滿至70%左右消化傳代。本實驗中采用3～5代滑膜成纖維細胞，型別均一，純度可達98%。

1.3 慢病毒轉(zhuǎn)染

由吉凱公司合成慢病毒。第三代處于對數(shù)生長期的滑膜成纖維細胞進行胰酶消化，制成細胞懸液。將細胞懸液（細胞數(shù)約為1×106）接種于12孔板中，37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)待細胞融合度達到約50%。按MOI值（病毒滴度/細胞數(shù)）50，加入適宜量的病毒。12 h后觀察細胞狀態(tài)：如果沒有明顯的細胞毒性作用，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基；如果有明顯的細胞毒性作用，立即更換培養(yǎng)基。感染72 h后觀察細胞熒光率，同時收集部分細胞Western blot檢測BRMS表達變化。

1.4 Western blot檢測蛋白水平。

60 mm皿收集細胞，按凱基核蛋白提取試劑盒（貨號KGP150）說明提取核蛋白及胞漿蛋白。Bradford法測定蛋白濃度。5%濃縮膠80 V衡壓30 min，10%分離膠恒壓110 V，40 min，濕轉(zhuǎn)120 mA恒流50 min，37℃搖床5%BSA封閉2 h，轉(zhuǎn)印后加入一抗4℃過夜。TBST洗膜5 min×3次，山羊抗兔或山羊抗鼠近紅外二抗 1∶15000，常溫避光搖床孵育1.5 h，避光TBST洗膜15 min×4次。Odyssey V3.0掃描儀掃描膜。重復3次。

1.5 Elisa檢測細胞培養(yǎng)液中IL-1β。

以含1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液為封閉液，每孔350 μl，室溫封閉 1 h。封閉結(jié)束后，棄去封閉液，洗板，加入待測樣品（制作標準曲線以標準Purified Rat IgG代替樣品）100 μl，室溫25±2 ℃孵育 2 h。一抗孵育結(jié)束后，洗板，每孔加入Anti-rat IgG-HRP Antibody 100 μl，室溫孵育2 h。酶標二抗孵育結(jié)束后，洗板，每孔加入TMB底物溶液100 μl，室溫避光顯色30 min后，每孔加入2 mol/L H2SO450 μl終止反應。用酶標儀在450 nm處檢測OD值。繪制標準曲線，通過標準曲線計算樣品濃度。

1.6 免疫熒光檢測NF-κB核轉(zhuǎn)位。

處理好細胞后，去除培養(yǎng)基，PBS洗1次，多聚甲醛固定 20 min，PBS洗3次，每次3 min；2.5%Triton-100室溫封閉 10 min，PBS洗3次，每次3 min；200 μl FBS室溫封閉 1 h，滴加1∶200稀釋50 μl NF-kB一抗，4 ℃過夜，PBS洗3次，每次3 min；然后加1∶200 FITC標記的羊抗兔IgG二抗200 μl，室溫避光孵育1 h，PBS洗3次，每次3 min；最后用DAPI染核，室溫避光孵育5 min，PBS洗3次，每次3 min；在熒光顯微鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件，采用One-way ANOVA方差分析法，首先利用Levene方法進行方差齊性檢驗，確定方差齊性且整體比較組間差異有統(tǒng)計學意義后進一步作多重比較，多重比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 RA組FLS細胞BRMS1蛋白、核蛋白中NF-κB表達和培養(yǎng)基上清中IL-1β水平

收集第3代FLS細胞提取總蛋白、核蛋白及胞漿蛋白，Western blot檢測BRMS1蛋白、核蛋白中NF-kB表達。結(jié)果顯示，RA組FLS細胞BRMS1和IkBα蛋白較normal組明顯降低，但是IkKα/β磷酸化水平及核蛋白中NF-κB表達較normal組明顯升高（圖1A）。Elisa結(jié)果顯示，RA組培養(yǎng)基中IL-1β水平也較normal組明顯升高（圖1B）。

圖1 RA組FLS細胞BRMS1蛋白、核蛋白中NF-kB表達和培養(yǎng)基上清中IL-1β水平的差異

2.2 過表達BRMS1下調(diào)NF-κB核轉(zhuǎn)位和IL-1β表達

慢病毒法在RA組FLS中過表達BRMS1，Western blot檢測結(jié)果顯示慢病毒轉(zhuǎn)染BRMS1后，F(xiàn)LS細胞BRMS1表達明顯升高（圖2A）。進一步檢測胞漿蛋白中IkKα/β磷酸化水平和IkBα蛋白表達，核蛋白中NF-kB的表達水平。結(jié)果顯示過表達BRMS1后，IkBα蛋白表達增加，IkKα/β磷酸化水平及核蛋白中NF-κB的表達水平明顯減少（圖2A）。免疫組化結(jié)果可見，過表達BRMS1后，細胞核中NF-κB明顯減少（圖2B）。Elisa檢測發(fā)現(xiàn)，過表達BRMS1組細胞培養(yǎng)基上清中IL-1β水平明顯下調(diào)（圖2C）。

圖2 過表達BRMS1對NF-κB核轉(zhuǎn)位和IL-1β表達的影響

2.3 過表達BRMS1抑制LPS誘導的NF-κB核轉(zhuǎn)位和IL-1β表達

Normal組的FLS細胞過表達BRMS1后，予LPS 10 ng/ml處理1 h后提取蛋白。Western blot檢測結(jié)果顯示，BRMS1+LPS組IkKα/β磷酸化及核蛋白中NF-κB水平較NC+LPS組明顯減少（圖3A）。培養(yǎng)基上清Elisa檢測結(jié)果顯示，BRMS1+LPS組IL-1β也較NC+LPS組明顯減少（圖3B）。

3 討論

成纖維樣滑膜細胞（FLS）是關節(jié)滑膜內(nèi)層主要的細胞之一。在正常正常情況下，F(xiàn)LS在保持關節(jié)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要功能。但是在類風濕性關節(jié)炎（RA）患者的關鍵滑膜組織中，F(xiàn)LS除了呈腫瘤樣增生，造成細胞數(shù)量的大量增加，造成軟骨破壞的一個重要原因；另一方面，F(xiàn)LS可以對許多促炎癥因子有響應，而且其自身也能夠合成并分泌許多因子介導炎癥反應［7］，激活血管內(nèi)皮細胞，增強內(nèi)皮細胞粘附分子的表達，使血液中的白細胞被匯集到關節(jié)腔內(nèi)；刺激軟骨細胞和破骨細胞、骨膜細胞，使糖蛋白的合成減少、降解增加，同時產(chǎn)生釋放骨鈣的膠原酶和其他中性蛋白酶，從而導致軟骨和骨破壞［8-9］。

核轉(zhuǎn)錄因子Kappa-B（NF-κB）在FLS分泌炎癥因子中有重要作用。在RA的FLS中，NF-kB活化可以促進IL-1β、IL-8、IL-6、MMPs的產(chǎn)生，促進FLS增生，抑制FLS凋亡，從而促進滑膜血管翳形成，使細胞釋放更多的細胞因子和MMPs，進一步增強IkKβ的功能，誘導NF-κB核轉(zhuǎn)錄，形成惡性循環(huán)［10-12］。我們的實驗結(jié)果也顯示，在RA病人的FLS中，NF-κB通路的活化較normal組明顯升高。Okamoto等［13］也發(fā)現(xiàn)，通過抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位可以明顯改善RA病人的并且進展。可見，NF-κB在FLS參與破壞RA病人關節(jié)結(jié)構(gòu)過程中有重要作用。

圖3 過表達BRMS1對LPS誘導的NF-kB核轉(zhuǎn)位和IL-1β表達的影響

BRMS1在抑制腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中有重要作用［14］；同時，研究也發(fā)現(xiàn)BRMS1可以抑制IkKα/β磷酸化，減少IkBα蛋白降解，從而抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位和該通路的活化［5］。我們對比了正常的和RA患者的FLS細胞中BRMS1蛋白表達，發(fā)現(xiàn)RA患者FLS細胞中BRMS1蛋白表達明顯下降。而在RA患者的FLS細胞中，過表達BRMS1蛋白后，NF-κB的核轉(zhuǎn)位被明顯抑制，同時IL-1β的分泌明顯減少。為了進一步明確BRMS1蛋白對NF-κB的作用，在normal組的FLS細胞中過表達BRMS1蛋白，再用NF-κB通路的激活劑LPS刺激細胞，發(fā)現(xiàn)BRMS1可以減弱LPS誘導的NF-κB通路的激活和IL-1β的分泌。

綜上所述，BRMS1可以通過抑制NF-kB核轉(zhuǎn)位，抑制FLS分泌炎癥因子IL-1β，這可能成為治療RA的一個靶點。

［1］ Ai J,Duan J,Lv X,et al.Overexpression of FoxO1 causes proliferation of cultured pancreatic beta cells exposed to low nutrition［J］.Biochemistry,2010,49(1):218-25.

［2］ Yamanishi Y,Firestein GS.Pathogenesis of rheumatoid arthritis:The role of synoviocytes［J］.Rheum Dis Clin North Am,2001,27(2):355-71.

［3］ Muller-Ladner U,Pap T.Pathogenesis of RA:more than just immune cells［J］.Z Rheumatol,2005,64(6):396-401.

［4］ Phadke PA,Vaidya KS,Nash KT,et al.BRMS1 suppresses breast cancer experimental metastasis to multiple organs by inhibiting several steps of the metastatic process［J］.Am J Pathol,2008,172(3):809-17.

［5］ Cicek M,Fukuyama R,Welch DR,et al.Breast cancer metastasis suppressor 1 inhibits gene expression by targeting nuclear factorkappa B activity［J］.Cancer Res,2005,65(9):3586-95.

［6］ 黃憲章,王 前,鄭 磊,等.人類風濕性關節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞培養(yǎng)及生物學特性研究［J］.南方醫(yī)科大學學報,2009,29(3):462-5.

［7］ 賀琤雯,沈 茜.滑膜成纖維細胞在類風濕性關節(jié)炎發(fā)病中的作用［J］.國際免疫學雜志,2010,33(2):117-20.

［8］Wang XP,Lin QD,Lu PH,et al.Association of HLA-DQB1 coding region with unexplained recurrent spontaneous abortion［J］.Chin Med J(Engl),2004,117(4):492-7.

［9］ SU,PA,GP,et al.HLA allele associations in idiopathic recurrent spontaneous abortion patients from India［J］.J Hum Reprod Sci,2008,1(1):19-24.

［10］Xu H,He Y,Yang X,et al.Anti-malarial agent artesunate inhibits TNF-alpha-induced production of proinflammatory cytokines via inhibition of NF-kappaB and PI3 kinase/Akt signal pathway in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes［J］.Rheumatology(Oxford),2007,46(6):920-6.

［11］Lauder SN,Carty SM,Carpenter CE,et al.Interleukin-1 beta induced activation of nuclear factor-kappa b can be inhibited by novel pharmacological agents in osteoarthritis［J］.Rheumatology(Oxford),2007,46(5):752-8.

［12］申成凱,呂成昱,王英振,等.白介素-1β基因多態(tài)性與晚期膝骨關節(jié)炎易感性的關聯(lián)性研究［J］.中華關節(jié)外科雜志:電子版,2013,7(3):378-85.

［13］Okamoto H,Yoshio T,Kaneko H,et al.Inhibition of NF-kappa B Signaling by Fasudil as a Potential Therapeutic Strategy for Rheumatoid Arthritis［J］.Arthritis Rheum,2010,62(1):82-92.

［14］Seraj MJ,Samant RS,Verderame MF,et al.Functional evidence for a novel human breast carcinoma metastasis suppressor,BRMS1,encoded at chromosome 11q13［J］.Cancer Res,2000,60(11):2764-9.