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(1.廣東醫(yī)學(xué)院附屬南山醫(yī)院耳鼻咽喉科，廣東 深圳 518052；2.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

氧化/抗氧化失衡在大鼠中樞聽覺(jué)系統(tǒng)老化過(guò)程中的作用

胡璟1，高春生1，劉林2，杜政德1*

(1.廣東醫(yī)學(xué)院附屬南山醫(yī)院耳鼻咽喉科，廣東 深圳 518052；2.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院)

目的研究氧化/抗氧化失衡在D-半乳糖誘導(dǎo)的大鼠老化中樞聽覺(jué)系統(tǒng)聽皮層組織中的作用，探討老年性耳聾氧化性損傷的發(fā)生機(jī)制。方法48只1月齡雄性Spragua-Dawley大鼠隨機(jī)分成4組(各12只)，不同劑量D-半乳糖每日頸背部皮下注射D-半乳糖(500 mg/kg)造模，連續(xù)8周。造模完成后，取4組大鼠中樞聽覺(jué)系統(tǒng)聽皮層組織，檢測(cè)活性氧指標(biāo)過(guò)氧化氫、總抗氧化能力指標(biāo)抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶的總水平、DNA氧化損傷生物標(biāo)記物8-羥基-2-脫氧鳥苷(8-OHdG)的表達(dá)以及最常發(fā)生的年齡相關(guān)性mtDNA損傷線粒體DNA(mtDNA)4 834 bp大片段缺失的累積水平。將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用方差分析進(jìn)行分析。結(jié)果與對(duì)照組大鼠相比較，D-半乳糖誘導(dǎo)的老化大鼠聽皮層組織中過(guò)氧化氫含量明顯增多，而總抗氧化能力明顯下降(P<0.01)。同時(shí)，DNA氧化損傷的產(chǎn)物8-OHdG的表達(dá)和線粒體4 834 bp大片段缺失突變的累積明顯增多(P<0.01)。結(jié)論在中樞聽覺(jué)系統(tǒng)老化過(guò)程中，氧化/抗氧化失衡可能是導(dǎo)致老年性耳聾發(fā)生的重要原因。

氧化/抗氧化失衡； 老化； 中樞聽覺(jué)系統(tǒng)； 氧化性損傷； 線粒體DNA

老化是生物體對(duì)抗各種應(yīng)激、損傷和疾病的能力逐漸下降的過(guò)程[1]。年齡相關(guān)性聽力損失，又稱為老年性耳聾，是老化在聽覺(jué)系統(tǒng)的表現(xiàn)。然而，老年性耳聾聽覺(jué)系統(tǒng)退行性變的確切機(jī)制仍不十分清楚。

由于在活體的人體聽覺(jué)系統(tǒng)組織不可獲得以及伴有聽力損失的個(gè)體所處環(huán)境不同，老年性耳聾的研究在一定程度上受到限制。因此，研究者建立許多老年性耳聾的動(dòng)物模型。其中，通過(guò)給實(shí)驗(yàn)大鼠慢性注射D-半乳糖的方法可以很好的模擬大鼠的自然老化過(guò)程，成為研究老年性耳聾的理想模型[2-4]。

目前，大量研究已經(jīng)證實(shí)氧化性應(yīng)激是導(dǎo)致老化的重要原因[5-7]。但是，體內(nèi)氧化性應(yīng)激和抗氧化能力的相互作用在老化大鼠中樞聽覺(jué)系統(tǒng)退行性變過(guò)程中的作用仍不完全清楚。本研究利用D-半乳糖誘導(dǎo)的老化大鼠模型，通過(guò)檢測(cè)中樞聽覺(jué)系統(tǒng)聽皮層組織中活性氧指標(biāo)過(guò)氧化氫、總抗氧化能力、DNA氧化損傷的產(chǎn)物8-羥基-2-脫氧鳥甘的表達(dá)和人類線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)4 977 bp缺失(在大鼠與之相對(duì)應(yīng)的mtDNA CD為4 834 bp)的累積，探討氧化/抗氧化失衡在D-半乳糖誘導(dǎo)的老化大鼠中樞聽覺(jué)系統(tǒng)氧化損傷過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 D-半乳糖誘導(dǎo)的老化大鼠模型的構(gòu)建選耳廓反射靈敏且無(wú)中耳疾患的SPF級(jí)1月齡雄性SD大鼠48只，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為4組(每組各12只)：① 對(duì)照組：每日頸背部皮下注射生理鹽水，連續(xù)8周；② 低劑量D-半乳糖組：每日頸背部皮下注射D-半乳糖(150 mg/kg)，連續(xù)8周；③ 中劑量D-半乳糖組：每日頸背部皮下注射D-半乳糖(300 mg/kg)，連續(xù)8周；④ 高劑量D-半乳糖組：每日頸背部皮下注射D-半乳糖(500 mg/kg)，連續(xù)8周。所有動(dòng)物均飼養(yǎng)在室溫約20～22 °C左右，12 h晝夜交替的環(huán)境中，自由進(jìn)食飲水。兩組動(dòng)物均無(wú)噪聲暴露史，無(wú)其它藥物使用史。

1.2過(guò)氧化氫和總抗氧化力的檢測(cè)4組大鼠(每組6只)肌肉注射氯胺酮(30 mg/kg)和氯丙嗪(15 mg/kg)麻醉后處死，快速取出雙側(cè)聽皮層。一側(cè)用于過(guò)氧化氫和總抗氧化力(主要由抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶的總的水平?jīng)Q定)的檢測(cè)，另一側(cè)保存于-80 ℃冰箱用于線粒體4 834 bp大片段缺失突變的累積水平的檢測(cè)。使用組織過(guò)氧化氫檢測(cè)試劑盒(南京建成生物，中國(guó))和總抗氧化力檢測(cè)試劑盒(碧云天，中國(guó))檢測(cè)各組大鼠聽皮層內(nèi)過(guò)氧化氫和總抗氧化力的水平。聽皮層組織總蛋白濃度采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。

1.3線粒體4 834 bp大片段缺失突變的檢測(cè)

1.3.1 基因組DNA的提取 將聽皮層組織分別放入GA緩沖液(Tiangen Biotech Co.,LTD,北京,中國(guó))中勻漿，提取基因組DNA。

1.3.2 Taqman PCR檢測(cè)線粒體DNA(mtDNA)常見(jiàn)4 834 bp大片段大片段缺失突變(CD)的累積 運(yùn)用Taqman PCR檢測(cè)耳蝸軟組織和聽皮層組織線粒體4 834 bp大片段缺失突變(mtDNA CD)，由于mtDNA CD D-loop區(qū)很少發(fā)生突變，為mtDNA CD的保守序列，因此用D-loop作為內(nèi)參。根據(jù)熒光擴(kuò)增曲線確定Ct值。mtDNA CD的相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算?！鳌鰿t = D-半乳糖組(CtmtDNA CD- CtmtDNA D-loop)-對(duì)照組(CtmtDNA CD- CtmtDNA D-loop)，2-△△Ct代表各D-半乳糖組mtDNA CD的量與對(duì)照組mtDNA CD的量的比值。使用Taqman PCR擴(kuò)增試劑盒(TaKaRa,大連，中國(guó))進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)總體系：20 μL。反應(yīng)條件：①預(yù)變性：95 ℃ 30 s，共1個(gè)循環(huán)；②PCR反應(yīng)：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。所用引物和探針序列如下：D-loop：上游引物：5′-GGT TCT TAC TTC AGG GCC ATC A-3′；下游引物：5′-GAT TAG ACC CGT TAC CAT CGA GAT-3′；探針：5′-FAM-TTG GTT CAT CGT CCA TAC GTT CCC CTT A-TAMRA-3′。CD：上游引物：5′-AAG GAC GAA CCT GAG CCC TAA TA-3′；下游引物：5′-CGA AGT AGA TGA TCC GTA TGC TGT A-3′；探針：5′-FAM-TCA CTT TAA TCG CCA CAT CCA TAA CTG CTG T-TAMRA-3′。

1.4 DNA氧化損傷標(biāo)記物8-OHdG的檢測(cè)

1.4.1 取材及免疫組織化學(xué)標(biāo)本的制作 4組大鼠(每組6只)肌肉注射氯胺酮(30 mg/kg)和氯丙嗪(15 mg/kg)麻醉后，0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS)心臟快速灌注大鼠，繼而4%多聚甲醛心臟灌注，快速取出大腦，放入4%多聚甲醛中，4 ℃過(guò)夜。第2天，將固定好的大腦經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋和切片過(guò)程，最終制成5 μm厚的切片。大腦沿冠狀位切片，根據(jù)《大鼠腦立體定位圖譜》選取聽皮層層面的切片，放入-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)8-OHdG 聽皮層石蠟切片依次放入二甲苯I、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、蒸餾水各20 min、15 min、10 min、5 min、2 min、1 min、1 min、1 min、1 min、2 min，然后滴加濃度為20 μg/mL蛋白酶K(碧云天，中國(guó))進(jìn)行修復(fù)，37 ℃ 15 min，甩去修復(fù)液，繼續(xù)滴加3%的過(guò)氧化氫以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫孵育15 min，PBS沖洗3次，每次3 min。甩干玻片，用免疫組畫筆在組織周圍畫圈，滴加5% BSA封閉以減少非特異性染色，室溫30 min。甩去封閉液，滴加一抗anti-8-OHdG(1∶4 000,abcam,美國(guó))4 ℃過(guò)夜。第二天，37 ℃復(fù)溫30 min，PBS沖洗3次，每次3 min。滴加CY3標(biāo)記的二抗(博士德，中國(guó))20～37 ℃孵育20 min，PBS沖洗3次，每次3 min。DAPI(碧云天，中國(guó))復(fù)染細(xì)胞核，室溫5 min，PBS沖洗3次，每次3 min。抗熒光猝滅封片液(碧云天，中國(guó))封片，熒光顯微鏡(Nikon，日本)觀察。

2 結(jié) 果

2.1聽皮層組織中過(guò)氧化氫和總抗氧化力的表達(dá)不同劑量D-半乳糖誘導(dǎo)的老化大鼠聽皮層組織中過(guò)氧化氫的表達(dá)比對(duì)照組顯著升高，而總抗氧化力比對(duì)照組顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖1)。

2.2聽皮層組織中DNA氧化損傷產(chǎn)物8-羥基-2-脫氧鳥苷的表達(dá)DNA氧化損傷產(chǎn)物8-羥基-2-脫氧鳥苷主要在老化大鼠中樞聽覺(jué)系統(tǒng)聽皮層神經(jīng)元胞漿中表達(dá)，且不同劑量D-半乳糖組均比對(duì)照組表達(dá)顯著增強(qiáng)(圖2)。

圖1 過(guò)氧化氫和總抗氧化力在聽皮層中的表達(dá) 與對(duì)照組比較，**：P<0.01

圖2 DNA氧化損傷產(chǎn)物8-羥基-2-脫氧鳥苷在聽皮層中的表達(dá)(400×)

2.3聽皮層組織中線粒體4 834 bp大片段缺失突變的累積不同劑量D-半乳糖誘導(dǎo)的老化大鼠聽皮層組織中線粒體4 834 bp大片段缺失突變的累積比對(duì)照組顯著升高(圖3)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3 討 論

聽覺(jué)系統(tǒng)由外周聽覺(jué)系統(tǒng)和中樞聽覺(jué)系統(tǒng)組成。聽皮層是中樞聽覺(jué)系統(tǒng)的最高級(jí)中樞，是聲音信號(hào)被活體認(rèn)知的最終部位。越來(lái)越多的研究已經(jīng)證實(shí)中樞聽覺(jué)系統(tǒng)的退行性變是導(dǎo)致老年性耳聾的重要原因[8-10]。本研究發(fā)現(xiàn)D-半乳糖誘導(dǎo)的老化大鼠中樞聽覺(jué)系統(tǒng)聽皮層組織中不僅活性氧指標(biāo)過(guò)氧化氫含量增加，而且總抗氧化能力下降，提示氧化/抗氧化失衡可能在老年性耳聾的發(fā)病過(guò)程有著重要的作用。

圖3 線粒體4 834 bp大片段缺失突變?cè)诼犉又械睦鄯e與對(duì)照組比較，**：P<0.01

氧化/抗氧化失衡引起的氧化性應(yīng)激可損傷細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、RNA和DNA等[7]。本研究發(fā)現(xiàn)不同劑量D-半乳糖誘導(dǎo)的老化大鼠聽皮層組織中DNA氧化損傷標(biāo)記物8-羥基-2-脫氧鳥苷明顯增加，與此同時(shí)線粒體4 834 bp大片段缺失突變的累積也明顯增加，表明氧化/抗氧化的失衡可引起細(xì)胞內(nèi)DNA，特別是線粒體DNA的損傷。線粒體4834-bp大片段缺失是最常發(fā)生的年齡相關(guān)的線粒體DNA缺失突變，是老化的生物標(biāo)記[11-13]。越來(lái)越多的文獻(xiàn)報(bào)道老年性聾和線粒體4 834 bp大片段缺失突變的累積密切有關(guān)[14-16]。線粒體DNA的突變不僅可影響線粒體的能量代謝，還可誘導(dǎo)依賴線粒體的細(xì)胞凋亡途徑的激活，最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡[7]。

綜上所述，在D-半乳糖誘導(dǎo)的老化大鼠中樞聽覺(jué)系統(tǒng)的老化過(guò)程中，氧化/抗氧化失衡引起的氧化性應(yīng)激可導(dǎo)致線粒體DNA突變的累積增加，在老年性耳聾的發(fā)病過(guò)程中可能扮演了重要的角色，而維持氧化/抗氧化的平衡對(duì)預(yù)防和延緩老年性耳聾的發(fā)生和發(fā)展有著重要的意義。

[1] Wei YH,Wu SB,Ma YS,et al.Respiratory function decline and DNA mutation in mitochondria,oxidative stress and altered gene expression during aging [J].Chang Gung Med J，2009,32(2):113-132.

[2] Ho SC,Liu JH,Wu RY，et al.Establishment of the mimetic aging effect in mice caused by D-galactose [J].Biogerontology，2003,4(1):15-18.

[3] Du Z,Yang Y,Hu Y,et al.A long-term high-fat diet increases oxidative stress,mitochondrial damage and apoptosis in the inner ear of d-galactose-induced aging rats [J].Hear Res，2012,287(1-2):15-24.

[4] Chen B,Zhong Y,Peng W,et al.Age-related changes in the central auditory system:comparison of D-galactose-induced aging rats and naturally aging rats [J].Brain Res，2010,1344:43-53.

[5] Yuliya M,Andreas D,Sebastian S,et al.Mitochondrial oxidative stress,mitochondrial DNA damage and their role in age-related vascular dysfunction[J].Int J Mol Sci，2015，16(7):15918-15953.

[6] Krishnan V,Sandhya K,Tai TC,et al.Oxidative stress in aging-matters of the Heart and Mind [J].Int J Mol Sci，2013,14(9):17897-17925.

[7] Hiona A,Leeuwenburgh C.The role of mitochondrial DNA mutations in aging and sarcopenia:implications for the mitochondrial vicious cycle theory of aging[J].Exp Gerontol，2008,43(1):24-33.

[8] Wang H,Brozoski TJ,Ling L,et al.Impact of sound exposure and aging on brain-derived neurotrophic factor and tyrosine kinase B receptors levels in dorsal cochlear nucleus 80 days following sound exposure[J].Neuroscience，2011,172:453-459.

[9] Gates GA,Feeney MP,Mills D，et al.Cross-sectional age-changes of hearing in the elderly[J].Ear Hear，2008,29(6):865-874.

[10] Frisina RD,Walton JP.Age-related structural and functional changes in the cochlear nucleus[J].Hear Res，2006，216-217:216-223.

[11] Zeng LL,Yang Y,Hu YJ,et al.Age-related decrease in the mitochondrial sirtuin deacetylase sirt3 expression associated with ROS accumulation in the auditory cortex of the mimetic aging rat model[J].PLoS One，2014，9(2):e88019.

[12] Nicklas JA,Brooks EM,Hunter TC,et al.Development of a quantitative PCR (TaqMan) assay for relative mitochondrial DNA copy number and the common mitochondrial DNA deletion in the rat[J].Environ Mol Mutagen，2004,44(4):313-320.

[13] Edris W,Burgett B,Stine OC,et al.Detection and quantitation by competitive PCR of an age-associated increase in a 4.8-kb deletion in rat mitochondrial DNA[J].Mutat Res,1994,316(2):69-78.

[14] Yin S,Yu Z,Sockalingam R,et al.The role of mitochondrial DNA large deletion for the development of presbycusis in Fischer 344 rats[J].Neurobiol Dis，2007，27(3):370-377.

[15] Markaryan A,Nelson EG,Hinojosa R，et al.Quantification of the mitochondrial DNA common deletion in presbycusis[J].Laryngoscope，2009,119(6):1184-1189.

[16] Ren HM,Ren JH,Liu W,et al.Recognition and Control of the Progression of Age-Related Hearing Loss[J].Rejuvenation Res，2013,16(6):475-486

TheRoleofOxidation/AntioxidantImbalanceintheAge-relatedDamageoftheRatCentralAuditorySystem

HU Jing,GAO Chunsheng,LIU Lin,et al

(DepartmentofOtorhinolaryngology,NanshanAffiliatedHospitalofGuangdongMedicalCollege,Shenzhen，Guangdong518052,China)

ObjectiveTo explore the effects of oxidation/antioxidant imbalance on the auditory cortex of central auditory system of D-galactose-induced aging rats and investigate the mechanism of oxidative damage of age-related hearing loss.MethodsForty-eight 1-month male Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups (12 rats in each group)，and were injected subcutaneously with different dose of D-gal once a day for 8 weeks.After the experiment termination,the tissues were harvested from the auditory cortex of central auditory system.Investigate the expression of hydrogen peroxide,total antioxidant capacity,8-hydroxy-2-deoxyguanosine (8-OHdG) and the accumulation of mitochondrial DNA 4 834 bp deletion.All experimental data was analysed with one-way ANOVA.ResultsThe expression of hydrogen peroxide in the auditory cortex of rats of D-galactose groups was significantly increased compared with the control group,while the expression of the total antioxidant capacity was significantly decreased (allP<0.01).Meanwhile,the expression of 8-OHdG and the accumulation of mitochondrial DNA 4 834 bp deletion were significantly increased (P<0.01).ConclusionsIn the aging process of central auditory system,the oxidation/antioxidant imbalance may be an important cause for the age-related hearing loss.

oxidation/antioxidant imbalance; aging; central auditory system; oxidative damage; mitochondrial DNA

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.05.005

2015-01-20；

2015-8-21

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金(B2014370)；深圳市科技計(jì)劃(JCYJ20140411092351692)；深圳市南山區(qū)技術(shù)研發(fā)和創(chuàng)意設(shè)計(jì)項(xiàng)目分項(xiàng)資金(南科研衛(wèi)2012014號(hào)).

*通訊作者，E-mail：duzhengde@163.com.

R764.43

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(此文編輯：朱雯霞)