潘鎦鎦，鄭飛云，諸海燕，章圣輝，胡燕

（1.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 婦科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 婦科，浙江溫州 325015）

·論 著·

鴉膽子素D對HPV16感染細胞株的作用及其可能機制

潘鎦鎦1，鄭飛云2，諸海燕2，章圣輝2，胡燕2

（1.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 婦科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 婦科，浙江溫州 325015）

目的：研究鴉膽子素D對高危型人類乳頭瘤病毒（HPV）16感染細胞的增殖抑制作用、促凋亡作用及其可能機制。方法：以人宮頸鱗狀上皮永生化細胞株（Ect1/E6E7）作為HPV16型感染的宮頸癌前病變的體外實驗模型，用1、5、10、15、30 μ mol/L的鴉膽子素D分別體外作用于細胞24、48、72 h，用3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）法測定細胞增殖活性改變；以1、5、10 μ mol/L的鴉膽子素D分別體外作用于細胞24、48、72 h后，Cell cycle staining solution檢測細胞生長周期變化，Hoechst 33258細胞核熒光染色法觀察細胞凋亡情況，Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測細胞凋亡率。宮頸癌細胞株Caski含有完整的HPV16型E6、E7基因序列，以此作為陽性對照，通過實時熒光定量PCR技術(shù)檢測兩種細胞內(nèi)HPV16 E6、E7基因mRNA的表達。結(jié)果：鴉膽子素D對Ect1/E6E7細胞具有明顯的抑制體外增殖作用，MTT結(jié)果顯示抑制作用呈時間和濃度依賴性（P＜0.05）。經(jīng)1、5、10 μ mol/L鴉膽子素D體外作用48 h后，細胞生長周期停滯于G1期。流式細胞儀檢測顯示，各實驗組細胞經(jīng)鴉膽子素D作用48 h后，細胞凋亡率分別為（6.25± 0.76）%、（20.21±1.32）%和（8.61±1.59）%，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Hochest33258細胞核染色法顯示細胞出現(xiàn)凋亡形態(tài)學改變。Real-time PCR技術(shù)檢測結(jié)果顯示Ect1/E6E7中HPV16 E6、E7 mRNA表達水平無明顯下降，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。而Caski中HPV16 E6、E7 mRNA表達水平下降，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論：鴉膽子素D能有效地抑制Ect1/E6E7細胞增殖，其機制可能是通過抑制HPV16 E6、E7 mRNA表達從而促進細胞凋亡。

人宮頸永生化細胞；鴉膽子素D；增殖；人乳頭瘤病毒16

宮頸癌是女性最常見惡性腫瘤之一，目前認為高危型人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）的持續(xù)性感染是導致宮頸癌發(fā)生的必要條件。HPV病毒DNA通?？梢哉系剿拗骷毎鸇NA中編碼并表達E6、E7蛋白，在細胞癌變過程中起重要作用。鴉膽子素D（Bruceine D）是中藥鴉膽子中提取出的具有水溶性的三環(huán)四萜類化合物，是鴉膽子的主要成分。我們前期工作已證實了鴉膽子油乳對宮頸癌前細胞和癌細胞具有抑制增殖、促凋亡作用[1-2]。本研究以鴉膽子素D為研究對象，以期明確鴉膽子素D對高危型HPV16感染細胞的作用及其可能的抗病毒作用的機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株：人宮頸永生化鱗狀細胞株（Ect1/ E6E7）購自上海拜力生物科技有限公司（美國模式培養(yǎng)物集存庫編號為CRL-2614），人宮頸癌細胞株Caski購自中國科學院上海細胞庫（美國模式培養(yǎng)物集存庫編號為CRM-CRL-1550）。

1.1.2 主要試劑：鴉膽子素D粉劑（20 mg/支，純度：高效液相色譜法≥98%，上海源葉生物科技有限公司），RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清（美國GIBCO公司），3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）（美國Sigma公司），Annexin V-AF488/PI凋亡試劑盒、Cell cycle staining solution（CCS01）試劑盒（美國Invitrogen公司），Hoechst33258試劑（碧云天生物技術(shù)研究所），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Fermentas公司），Real-time PCR試劑盒（美國Bio-rad公司）。

1.1.3 主要設(shè)備：Hetus恒溫水浴箱、Beckman離心機、Olympas相差倒置顯微鏡、Forma二氧化碳培養(yǎng)箱、流式細胞儀（FACS Calibur）、ELX800酶聯(lián)免疫檢測儀、Olympus熒光顯微鏡（CX41）、ABI7500實時熒光定量PCR儀。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和藥物配置：Ect1/E6E7、Caski細胞株在含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μ g/mL的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞用于實驗研究。鴉膽子素D粉劑加入二甲基亞砜（DMSO）溶液中溶解后，加入RPMI-1640培養(yǎng)基中，配制成10 mmol/L的鴉膽子素D溶液，-4 ℃避光保存，DMSO在溶液中的含量＜0.05%。

1.2.2 MTT法檢測細胞體外增殖活性：取對數(shù)生長期的細胞，以1×104個細胞/孔接種于96孔板培養(yǎng)，每組設(shè)5個復孔。以終濃度為1、5、10、15、30 μ mol/L的鴉膽子素D作用Ect1/E6E7細胞作為實驗組，對照組不加藥物，作用24、48、72 h后，分別取出培養(yǎng)板，加入MTT 20 μ L，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μ L DMSO，置搖床上低速振蕩30 min，用ELX800酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm測定吸光度值，計算細胞生長抑制率（cell growth inhibition rate，CGIR）=1-A（實驗組-空白組）/A（對照組-空白組）。實驗重復3次。

1.2.3 Cell cycle staining solution檢測細胞周期：實驗組Ect1/E6E7細胞用1、5、10 μ mol/L的鴉膽子素D作用，對照組不加藥，48 h后收集，PBS 洗2次，加入1 mL CCS01 Cell cycle staining buffer，避光孵育半小時后上流式細胞儀檢測，經(jīng)Modifit軟件分析，實驗重復3次。

1.2.4 Annexin V-AF488/PI法檢測細胞凋亡率：按5×104個/mL密度將Ect1/E6E7細胞接種于6孔板中培養(yǎng)，設(shè)對照組和終濃度為1、5、10 μmol/L的實驗組，作用48 h后收集細胞，按試劑盒程序常規(guī)染色，1 h內(nèi)上流式細胞儀檢測。檢測結(jié)果經(jīng)Cell Quest軟件分析，實驗重復3次。

1.2.5 Hoechst33258細胞核染色法檢測細胞凋亡形態(tài)學改變：按1×104個/mL密度將Ect1/E6E7細胞接種于6孔板中，6孔板內(nèi)預先放入由多聚賴氨酸處理過的無菌蓋玻片（18 mm×18 mm）進行細胞爬片。將5 μ mol/L的鴉膽子素D作用Ect1/E6E7細胞設(shè)為實驗組，對照組Ect1/E6E7細胞僅加入培養(yǎng)液，作用48 h后，按試劑盒程序常規(guī)染色，置熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡形態(tài)學變化。

1.2.6 Real-time PCR法檢測細胞E6、E7 mRNA表達：分別收集經(jīng)1、5、10 μmol/L鴉膽子素D作用48 h后的Ect1/E6E7、Caski和對照組細胞，TRIzol法提取總RNA，在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下觀察出現(xiàn)清晰集中的28S、18S、5S三條帶，且28S/18S約為2∶1，證實RNA制品完整，未被降解。紫外分光光度計測定RNA濃度，調(diào)整RNA濃度為2 μ g/L。將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。模板為：RNA 1 μ L，5×Buffer 4 μL，10 mol/L dNTP 2 μL，Rnase Inhibitor 1 μ L，Reverse Transcriptase 1 μ L，Random Primer 1 μ L，Water 10 μ L，反應體系25 ℃ 5 min，42 ℃60 min，70 ℃ 5 min，一個循環(huán)，產(chǎn)物置于-20 ℃保存。HPV16 E6引物序列（159 bp）：上游5’-GAACA GCAATACAACAAACCG-3’，下游5’-TCTGCAACAAGACATA CATCG-3’。HPV16 E7引物序列（245 bp）：上游5’-AT GGAGATACACCTACATTGC-3’，下游5’-TAACAGGTCTTCC AAAGTACG-3’。內(nèi)參GAPDH引物序列（251 bp）：上游5’-CCATGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3’，下游5’-GCCA GTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3’。引物均委托Invitrogen公司合成。Real-time PCR模板：2×mix 12.5 μ L，上下游引物各0.5 μ L，cDNA 5 μ L，加水至25 μL。擴增條件：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共40個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。設(shè)GAPDH內(nèi)參基因組、Caski陽性對照組、目的基因組以及2管空白對照組（由DEPC水代替cDNA）。每個樣本設(shè)3個復孔，實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料用±s表示，所有數(shù)據(jù)進行正態(tài)性及方差齊性檢驗，方差齊性者多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD法，方差不齊者進行Kruskal-Wallis檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 鴉膽子素D對Ect1/E6E7細胞體外增殖活性的影響 MTT法檢測結(jié)果（見表1）顯示，在不同濃度鴉膽子素D體外作用下，實驗組細胞生長抑制率與同時間點對照組比較均明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。且隨作用時間逐漸延長，與同濃度組比較均明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。可見，鴉膽子素D對Ect1/E6E7細胞生長具有抑制作用，并呈濃度和時間依賴性。

表1 不同濃度鴉膽子素D對Ect1/E6E7細胞體外增殖活性的影響（±s）

表1 不同濃度鴉膽子素D對Ect1/E6E7細胞體外增殖活性的影響（±s）

與同一時間對照組比：aP＜0.05；與同一濃度作用24 h比：bP＜0.05

2.2 鴉膽子素D對Ect1/E6E7細胞周期及細胞凋亡的影響 經(jīng)鴉膽子素D作用48 h后，Ect1/E6E7細胞G0/G1期比率上升，S期和G2/M期細胞比率下降，實驗組與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明細胞周期被阻滯于G0/G1期（見表2）；Annexin V-AF488/PI法檢測細胞凋亡，將晚期凋亡細胞、壞死細胞（右上象限）及早期凋亡細胞（右下象限）合計為總體凋亡率（見表2、圖1），細胞凋亡率逐漸升高，實驗組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中5 μ mol/L時凋亡率達峰值。實驗組之間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 Hochest33258細胞核染色法檢測結(jié)果 對照組細胞核呈圓形或橢圓形，熒光微弱、呈彌散性，而經(jīng)5 μ mol/L的鴉膽子素D體外作用48 h后，細胞核致密、濃染，或呈碎塊狀的藍色熒光，如圖2中箭頭提示有染色質(zhì)固縮的凋亡細胞核改變，形成凋亡小體。

表2 鴉膽子素D體外作用48 h對Ect1/E6E7細胞周期及凋亡的影響（±s，%）

表2 鴉膽子素D體外作用48 h對Ect1/E6E7細胞周期及凋亡的影響（±s，%）

與對照組比：aP＜0.05

圖1 不同濃度鴉膽子素D體外作用48 h對Ect1/E6E7細胞凋亡率的影響

圖2 5 μmol/L鴉膽子素D體外作用Ect1/E6E7 48 h后細胞凋亡變化

2.4 鴉膽子素D體外作用對HPV16 E6、E7基因的mRNA表達影響 Real-time PCR法測定每組樣本中每一個基因的△Ct，然后計算出2-△△Ct（見表3）。經(jīng)1、5、10 μmol/L鴉膽子素D體外作用48 h后，隨藥物濃度增加，Ect1/E6E7細胞中HPV16 E6、E7 mRNA的2-△△Ct無明顯增加趨勢，即藥物濃度的增加并不能抑制mRNA表達，實驗組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。而Caski細胞中HPV16 E6、E7 mRNA的2-△△Ct隨藥物濃度增加而增加，實驗組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），即mRNA表達水平與鴉膽子素D的作用具有濃度依賴性，呈遞減趨勢。

表3 Real-time PCR技術(shù)測定不同濃度鴉膽子素D作用后E6、E7 mRNA的2-△△Ct（±s）

表3 Real-time PCR技術(shù)測定不同濃度鴉膽子素D作用后E6、E7 mRNA的2-△△Ct（±s）

與對照組比：aP＜0.05

3 討論

在之前的研究中，我們已經(jīng)證明了鴉膽子油乳對高危型HPV16感染細胞Ect1/E6E7、Caski具有抑制增殖作用[1-2]，并且具有下調(diào)HPV病毒癌基因E6、 E7 mRNA表達水平的作用。而國內(nèi)也有大量研究顯示鴉膽子油乳對肺癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌等具有抗腫瘤細胞增殖和促進凋亡的作用，可能是通過抑制DNA的合成，或直接破壞腫瘤細胞生物膜結(jié)構(gòu)，或增加對抗癌藥物的通透性，誘導細胞凋亡作用等方式[3-9]。對于鴉膽子油乳在抗HPV治療中的相關(guān)研究，有國內(nèi)學者報道鴉膽子油對離體尖銳濕疣組織中HPV DNA有明顯的破壞作用，抑制病毒的正常復制擴增。其機制可能與改變細胞膜通透性有關(guān)，細胞膜通透性增大使得藥物在細胞內(nèi)濃度增加，從而產(chǎn)生殺滅或抑制病毒的效果，或直接抑制病毒DNA的合成[10]。

生殖道高危型HPV的持續(xù)性感染已被證實為宮頸癌的主要危險因素之一。目前認為，HPV16、HPV18、HPV31、HPV33等高危險型HPV，易造成宮頸癌。HPV中的E6、E7基因及其產(chǎn)物E6、E7蛋白具有導致正常細胞癌變的作用[11-12]。國內(nèi)外許多學者研究[13-16]發(fā)現(xiàn)siRNA能通過抑制E6、E7 mRNA表達，使E6、E7蛋白表達減少，p53或pRb堆積，引起腫瘤細胞凋亡，提示E6、E7可作為宮頸癌治療的靶基因。但HPV是嚴格的嗜上皮病毒，人是唯一宿主，現(xiàn)在暫無合適的體外培養(yǎng)模型。通過借助重組DNA技術(shù)，可將HPV的全基因或部分基因克隆到適當載體中，轉(zhuǎn)染細胞，得到各種永生化細胞系，從而得到各種腫瘤研究的體外細胞模型。本研究中的Ect1/E6E7作為高危型HPV16感染載體，是體外研究HPV在宮頸癌前病變發(fā)生過程中作用的理想模型。從抗病毒角度研究出發(fā)，我們發(fā)現(xiàn)鴉膽子素D有以下幾點作用及機制。

3.1 鴉膽子素D對HPV16亞型感染細胞的體外增殖具有抑制作用 Ect1/E6E7細胞是具有永生化能力的宮頸癌前病變細胞株，MTT法檢測結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度鴉膽子素D體外作用，Ect1/E6E7細胞體外生長和永生化狀態(tài)受到抑制，表現(xiàn)為作用濃度越高、時間越長，則細胞的體外生長抑制作用越明顯。根據(jù)MTT法檢測結(jié)果，當鴉膽子素D作用濃度為10 μ mol/ L甚至更高時，Ect1/E6E7細胞的增殖抑制情況趨于平臺期，因此我們在接下來的實驗中，選取了鴉膽子素D的1、5和10 μmol/L濃度作為研究濃度。

3.2 鴉膽子素D可誘導和促進HPV16亞型感染細胞的凋亡 研究發(fā)現(xiàn)，鴉膽子油乳在體外對某些宮頸癌細胞具有抑制作用，其機制可能為藥物誘導了細胞的凋亡程序[3，15-16]。本課題之前的研究也證實了鴉膽子油乳對Ect1/E6E7細胞具有促進凋亡作用[1-2]。鴉膽子素D作為鴉膽子油乳中的提取物，其藥物作用可能與之類似。Ect1/E6E7細胞因轉(zhuǎn)染HPV16 E6、E7基因使得細胞永生化，而實驗中，Ect1/E6E7細胞在鴉膽子素D的體外作用下出現(xiàn)了與宮頸癌Caski細胞相似的生長抑制現(xiàn)象，提示HPV16 E6、E7基因的表達可能收到抑制，也可能與細胞凋亡程序的誘導相關(guān)。

本實驗通過Hoechst33258染色法發(fā)現(xiàn)，經(jīng)鴉膽子素D作用后Ect1/E6E7細胞在熒光顯微鏡下可觀察到細胞核呈碎塊狀濃染，有凋亡小體出現(xiàn)，提示細胞凋亡。Annexin V-FITC/PI雙染色法顯示，經(jīng)1、5及10 μ mol/L鴉膽子素D體外作用48 h的細胞凋亡率逐漸升高，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）?？梢?，鴉膽子素D體外作用Ect1/E6E7細胞可誘導和促進細胞凋亡，抑制細胞體外增殖。

3.3 鴉膽子素D抑制HPV16亞型感染細胞體外增殖能力的作用機制 為進一步探討鴉膽子素D對HPV16亞型感染細胞的體外增殖抑制與促進細胞凋亡作用是否與HPV16主要病毒癌基因E6、E7介導的細胞永生化機制被阻斷相關(guān)，本研究通過Real-time PCR法檢測各不同濃度鴉膽子素D體外作用Ect1/E6E7細胞48 h后HPV16E6與E7基因mRNA的相對表達量。本實驗中以Caski細胞作為陽性對照，設(shè)置空白對照組，結(jié)果顯示Caski細胞中E6、E7 mRNA下調(diào)明顯，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而Ect1/E6E7細胞中E6、E7 mRNA有下調(diào)，但是差異無統(tǒng)計學意義。推測鴉膽子素D對細胞的生長抑制作用可能是作用于病毒癌基因E6、E7，由于Ect1/ E6E7細胞內(nèi)HPV病毒拷貝量比Caski細胞低，因此表現(xiàn)出鴉膽子素D對Caski細胞有更明顯的下調(diào)E6、E7表達的作用；另一方面，Ect1/E6E7細胞具有永生化能力，但并不是惡性腫瘤細胞，而Caski細胞是嚴格意義上的癌細胞，兩者在癌基因的活化、抑癌基因的失活、表觀遺傳突變等分子方面應該有很多不同，因此在對抗腫瘤藥物的敏感性上可能也存在差異，癌細胞可能對抗腫瘤藥物敏感性更高。細胞內(nèi)病毒定量檢測亦證實了Caski細胞E6、E7病毒拷貝量遠高于Ect1/E6E7細胞。說明從癌前細胞到癌細胞是個量變到質(zhì)變的過程，當E6、E7蛋白表達量達到一定程度時，正常細胞基因水平產(chǎn)生變異，導致細胞的惡變。

綜上所述，鴉膽子素D體外作用HPV16陽性細胞可能是通過下調(diào)其病毒癌基因E6、E7的表達，從而誘導和促進HPV16亞型陽性細胞的凋亡，抑制病毒感染細胞的持續(xù)增殖。本研究從抗病毒角度探討了藥物對癌前病變細胞的作用機制，在抗高危HPV感染及治療與高危HPV感染密切相關(guān)的宮頸病變方面提出了新的研究方向。

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The effect of Bruceine D on high-risk human papillomavirus 16 infected cell and its possible mechanism

PAN Liuliu1, ZHENG Feiyun2, ZHU Haiyan2, ZHANG Shenghui2, HU Yan2.1.Department of Gynecology and Obstetrics, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 2.Department of Gynecology and Obstetrics, the Frist Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective:To investigate the Bruceine D’s (BD) effect on human papillomavirus (HPV) type 16 infected cell in vitro.Methods:The Ect1/E6E7 was cultivated with BD (1, 5, 10, 15 and 30 μmol/L) for 24, 48 and 72 h, the anti-proliferation effect was measured with MTT colorimetric assay; The Ect1/E6E7 was cultivated with BD (1, 5 and 10 μmol/L) for 24, 48 and 72 h, the cell growth cycle change was measured with cell cycle staining solution, the morphologic changes of cell apoptosis stained with Hoechst 33258 in the Ect1/E6E7 cell line were observed under fuorescence microscope treated with BD at concentration of 5 μmol/L for 48 h.Flow cytometry of Annexin V-FITC/PI assay was used to evaluate the apoptosis rate of Ect1/E6E7 cell line treated with BD at different concentrations (1, 5 and 10 μmol/L) in vitro.Cervical cancer cells Caski which contain complete HPV 16 E6, E7 gene, as a positive control, by real-time quantitative PCR to detect the mRNA expression of HPV E6, E7 of those two cells treated with BD.Results: Immortalized human ectocervical Ect1/E6E7 cell line treated with BD showed obviously morphological changes, and with the prolongation of drug action and the increase of drug concentration, the morphological changes became more apparent.BD can inhibit the proliferation of Ect1/E6E7 cell in dose-dependent and time-dependent manner (P＜0.05).Ect1/E6E7 cell growth cycle was stagnated in the G1 phase.Hochest fuorescence staining presented the Ect1/E6E7 cells nucleus appeared apoptotic morphological change, and apoptotic bodies can be observed.Flow cytometry showed the apoptosis rate were(6.25±0.76)%, (20.21±1.32)%, (8.61±1.59)%, respectively, after 48 hours cultured with 1, 5, 10 μmol/L of BD (P＜0.05).Real-time PCR results showed that after cultivating with 1, 5, 10 μmol/L BD for 48 h, the expression of HPV16 E6, E7 mRNA of Ect1/E6E7 cell were decreased, but compared with the control group, the difference was not statistically signifcant (P＞0.05).The expression of HPV16 E6, E7 mRNA of Caski cell were decreased, the difference was statistically signifcant (P＜0.05) compared with the control group.Conclusion:BD can inhibit the proliferation of Ect1/E6E7 cells signifcantly, the possible mechanism may be associated with the expression decline of HPV16 E6, E7 mRNA, which promote cell apoptosis.

human immortalized cervical cell; Bruceine D; proliferation; apoptosis; human papillomavirus 16

R711.74

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.02.003

2014-05-20

浙江省中醫(yī)藥管理局科研項目（2011ZB089）。

潘鎦鎦（1986-），女，浙江溫州人，住院醫(yī)師，碩士。

胡燕，主任醫(yī)師，Email：hywjz123@sina.com。