黃崇杰，劉長寶，鄭晨果，蔡錨

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 肛腸外科，浙江 溫州 325027）

·論 著·

沉默熱休克蛋白27基因增強(qiáng)大腸癌細(xì)胞對(duì)5-FU化療敏感性

黃崇杰，劉長寶，鄭晨果，蔡錨

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 肛腸外科，浙江 溫州 325027）

目的：探討不同大腸癌細(xì)胞熱休克蛋白（HSP27）蛋白表達(dá)水平及其與5-氟尿嘧啶（5-FU）化療敏感性的關(guān)系，同時(shí)通過RNA干擾抑制HSP27基因的表達(dá)，初步探討沉默該基因?qū)?-FU抗腫瘤作用的影響。方法：Western blot法檢測(cè)各大腸癌細(xì)胞中HSP27蛋白的表達(dá)水平，CCK-8法測(cè)定不同濃度5-FU對(duì)各細(xì)胞株的抑制率，分析各組細(xì)胞HSP27蛋白表達(dá)水平與IC50的關(guān)系。設(shè)計(jì)合成3對(duì)針對(duì)不同靶點(diǎn)的HSP27小干擾RNA，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，Real-time PCR及Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HSP27 mRNA及蛋白表達(dá)水平。CCK-8法檢測(cè)HSP27-siRNA對(duì)細(xì)胞的生長抑制作用及沉默HSP27基因細(xì)胞對(duì)5-FU化療敏感性的變化。結(jié)果：各組細(xì)胞中HSP27的表達(dá)水平與5-FU的敏感性呈負(fù)相關(guān)性。Real-time PCR及Western blot法結(jié)果顯示有兩對(duì)靶向HSP27-siRNA能有效抑制HSP27 mRNA及蛋白水平的表達(dá)；CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示HSP27-siRNA轉(zhuǎn)染可增強(qiáng)SW480細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性，半數(shù)抑制濃度（IC50）明顯下調(diào)。HSP27在大腸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平與5-FU化療藥IC50值呈正相關(guān)。結(jié)論：靶向HSP27的siRNA能有效抑制大腸癌SW480細(xì)胞HSP27蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)5-FU化療藥物的敏感性。

結(jié)直腸腫瘤；熱休克蛋白27；5-氟尿嘧啶；RNA干擾

大腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。治療上以外科手術(shù)為主，但對(duì)中晚期的患者，以5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）為基礎(chǔ)的化療方案成為必需的輔助治療，然而腫瘤細(xì)胞內(nèi)在的或獲得性耐藥是化療失敗

并導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因[2]。熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）27是HSP家族中的重要一員，最近的蛋白組學(xué)研究表明，其在結(jié)直腸癌中呈現(xiàn)過表達(dá)，且與化療耐藥和預(yù)后不良存在必然聯(lián)系[3]，亦有國外文獻(xiàn)報(bào)道，5-FU能夠誘導(dǎo)HSP27表達(dá)從而促進(jìn)細(xì)胞生存，抑制5-FU療效[4]，但其耐藥機(jī)制尚未闡明。本研究首先探討了不同大腸癌細(xì)胞HSP27蛋白表達(dá)水平與5-FU化療敏感性關(guān)系，篩選出高表達(dá)HSP27的細(xì)胞后，通過RNA干擾抑制HSP27基因的表達(dá)，并初步探討沉默該基因?qū)?-FU抗腫瘤作用的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480、LOVO、HT-29、LS-174T購自中科院上海分院，我院實(shí)驗(yàn)室常規(guī)保存；氟尿嘧啶干粉劑（5-FU）購自德國默克公司；RP-MI 1640培養(yǎng)基、優(yōu)化培養(yǎng)基OPTI-MEMI、0.05%的胰酶、購自美國Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；β-actin鼠抗人抗體、兔抗人HSP-27抗體購自英國Abcam公司；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG購自美國Santa Cruz公司；CCK-8（cell counting kit-8）試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自加拿大MBI fermentas公司；Real-time試劑盒購自日本Toyobo公司；HSP27 siRNA由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：各細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，飽和濕度、37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至約70%～90%的融合狀態(tài)時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 藥物配制：將10 mg的5-FU粉劑溶于1 mL 的37 ℃ PBS溶液中，配制成104 μ g/mL的母液，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；用不含血清的培養(yǎng)基稀釋母液，配制成終濃度為10、20、40、80、160、320 μ g/mL的5-FU化療藥用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 Western blot法檢測(cè)不同種類結(jié)腸癌細(xì)胞HSP27蛋白的表達(dá)水平：取對(duì)數(shù)生長期狀態(tài)良好，經(jīng)胰酶消化收集細(xì)胞，離心棄上清，PBS漂冼2次，用含1% PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白，BCA分析試劑測(cè)定樣品總蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度，煮沸變性10 min。每組各取100 μ g總蛋白樣品，以12% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBS封閉2 h。兔抗人HSP27抗體（1∶500），4 ℃孵育過夜，TBST洗膜15 min×2次后加HRP標(biāo)記的山羊抗兔、山羊抗小鼠IgG（1∶500），常溫孵育2 h，TBST洗膜15 min×2次。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，X線片曝光顯影。β-actin作為內(nèi)參照標(biāo)化蛋白質(zhì)表達(dá)。用Quantity One凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)不同種類細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性：取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化吹打成單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為5×104/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μ L，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)分為空白調(diào)零對(duì)照組（不含細(xì)胞）、正常細(xì)胞對(duì)照組和5-FU藥物終濃度為（10、20、40、80、160、320 μ g/mL）的5-FU組。細(xì)胞經(jīng)24 h貼壁，更換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h進(jìn)行細(xì)胞同步化，再更換成上述含藥培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入CCK-8試劑10 μL，培養(yǎng)作用1 h后用酶標(biāo)儀于450 nm波長測(cè)吸光度值（A值）。取8孔平均值，計(jì)算抑制率（IR）。IR（%）=[1-（實(shí)驗(yàn)組A值-空白對(duì)照組A值）/（正常對(duì)照組A值-空白對(duì)照組A值）]×100%。

1.2.5 RNA干擾實(shí)驗(yàn)：

1.2.5.1 siRNA的合成及制備。HSP27 siRNA由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成，陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照siRNA及5’-FAM熒光標(biāo)記對(duì)照siRNA為上海吉瑪制藥有限公司提供的通用陰性對(duì)照siRNA（見表1）。按照吉瑪公司提供的siRNA使用說明書及實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)進(jìn)行，先將各對(duì)HSP27 siRNA及陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照siRNA分別溶解于Rnase-free ddH2O中，配成濃度為20 μmoL/L的母液，分裝于小EP管中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 3對(duì)不同靶點(diǎn)的HSP27-siRNA及negative control siRNA序列

1.2.5.2 實(shí)驗(yàn)分組。5’-FAM標(biāo)記的陰性siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分2組：①實(shí)驗(yàn)組：即轉(zhuǎn)染5’-FAM標(biāo)記陰性siRNA的SW480細(xì)胞；②正常對(duì)照組：未轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞。

靶向HSP27的siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分組：①3組不同轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組：即轉(zhuǎn)染3對(duì)不同HSP27 siRNA的SW480細(xì)胞；②陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照組：轉(zhuǎn)染negative controlsiRNA的SW480細(xì)胞；③正常對(duì)照組：未轉(zhuǎn)染的大腸癌SW480細(xì)胞。

1.2.5.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染。取對(duì)數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的SW480細(xì)胞，以2×105個(gè)細(xì)胞/孔，接種于無菌6孔培養(yǎng)板和激光共聚焦專用培養(yǎng)板，細(xì)胞融合達(dá)60%左右時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前2 h更換為OPTI-MEMI優(yōu)化培養(yǎng)基，用OPTI-MEMI培養(yǎng)基稀釋siRNA，將稀釋液和轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000混合，形成siRNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物，將其加入細(xì)胞中，siRNA終濃度為100 nmol/L，置培養(yǎng)箱中孵育6 h后，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，滴加抗熒光淬滅劑后進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡觀察，以評(píng)估轉(zhuǎn)染效率?；驌Q10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收獲細(xì)胞提取總RNA和總蛋白。

1.2.6 Real-time PCR檢測(cè)基因轉(zhuǎn)染后大腸癌SW480細(xì)胞HSP27 mRNA表達(dá)水平：上述細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)48 h后，吸棄培養(yǎng)液，先用PBS洗滌2次，吸棄PBS后把6孔板置于冰上操作，采用Trizol RNA分離試劑提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度。按照Promega試劑盒產(chǎn)品說明書操作合成cDNA后進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，按照Toyobo公司的Real-time PCR試劑盒說明書（SYBR Green法）操作。HSP27上游引物：5’-AGGATGGCGTGGTGGAGA-3’，下游引物：5’-G GGAGGAGGAAACTTGGGTG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物129 bp；內(nèi)參照GAPDH上游引物：5’-GGAGCAATGATCTTGATCTT-3’，下游引物：5’-CCTTCCTGGGCATGGAGTCCT-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物204 bp，均由上海生工合成。mRNA相對(duì)定量的計(jì)算方法：首先用Real-time PCR得到的目的基因Ct值分別與其相對(duì)應(yīng)的內(nèi)參的Ct值相減進(jìn)行校正，得到目的基因的校正Ct值（△Ct），再以空白對(duì)照組中的平均校正Ct值作為本底參數(shù)，則目的基因的量：

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.2.7 Western blot法檢測(cè)基因轉(zhuǎn)染后大腸癌SW480細(xì)胞HSP27蛋白的表達(dá)水平：將細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞分組同上，每組3孔，轉(zhuǎn)染組按上述方法轉(zhuǎn)染，48 h后收獲細(xì)胞，提取總蛋白進(jìn)行Western blot法檢測(cè)，具體方法步驟（同1.2.3）。

1.2.8 HSP27-siRNA對(duì)SW480細(xì)胞存活率的影響：將對(duì)數(shù)生長期SW480細(xì)胞接種于96孔板，分為正常對(duì)照組、陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照組、HSP27 siRNA組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，設(shè)空白調(diào)零對(duì)照。轉(zhuǎn)染組按前述方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染（同上1.2.5.3），上述轉(zhuǎn)染組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染培養(yǎng)（0、12、24、36、48、60 h）后行CCK-8試驗(yàn)（具體步驟同1.2.4）。細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組A值-空白對(duì)照組A值）/（正常對(duì)照組A值-空白對(duì)照組A值）。1.2.9 siRNA干擾靶向抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞HSP27表達(dá)對(duì)5-FU敏感性影響：將SW480細(xì)胞接種于96孔板，分為正常對(duì)照組、陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照組、HSP27 siRNA組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，轉(zhuǎn)染組按前述方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后各組棄培養(yǎng)液，用PBS漂洗3次，去除未貼壁的死細(xì)胞，再加入不同濃度（10、20、40、80、160、320 μg/mL）5-FU的含藥無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行CCK-8檢測(cè)（具體步驟同1.2.4）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料以±s表示，多組資料比較采用ANOVA單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊者采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊者采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)，各細(xì)胞HSP27蛋白水平與半數(shù)抑制濃度（IC50）的關(guān)系采用直線相關(guān)性回歸分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Western blot法檢測(cè)4種結(jié)腸癌細(xì)胞株中HSP27蛋白的表達(dá)水平 4種結(jié)腸癌細(xì)胞均能檢測(cè)到HSP27蛋白的表達(dá)，但在不同細(xì)胞系中的水平存在一定差異。在SW480中表達(dá)最高，為1.38±0.06，LOVO最低，為0.77±0.04，且SW480細(xì)胞與其他各組細(xì)胞之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 HSP27蛋白在4種不同類型人結(jié)腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平

2.2 不同種類大腸癌細(xì)胞株對(duì)5-FU的敏感性及與HSP27表達(dá)相關(guān)性分析 各組細(xì)胞經(jīng)6個(gè)不同濃度的5-FU處理24 h后，CCK-8試劑盒法通過酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，分別計(jì)算細(xì)胞生長抑制率，不同組細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性用IC50值表示，結(jié)果顯示（見圖2）：各組細(xì)胞的IC50值存在較大差異，其中SW480細(xì)胞IC50均值（為102.43 μg/mL）最高，LOVO細(xì)胞（為50.25 μg/mL）最低，說明前者高表達(dá)HSP27細(xì)胞對(duì)5-FU化療藥物最不敏感，通過直線相關(guān)性分析顯示各組細(xì)胞HSP27的表達(dá)水平與IC50值呈正相關(guān)性（R=0.959，P＜0.05）。

2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率 人大腸癌SW480細(xì)胞按上述方法轉(zhuǎn)染帶綠色熒光標(biāo)記的陰性siRNA，6 h后于激光共聚焦顯微鏡下觀察，通過計(jì)算發(fā)綠色熒光細(xì)胞數(shù)與同一視野下普通光鏡細(xì)胞總數(shù)的比率測(cè)定轉(zhuǎn)染效率在80%以上（見圖3）。

2.4 Real-time PCR檢測(cè)SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后HSP27 mRNA的表達(dá)變化

2.4.1 擴(kuò)增曲線和溶解曲線：圖4所示目的基因和內(nèi)參基因熒光PCR擴(kuò)增曲線良好，絕大部分CT值在20～30之間，PCR擴(kuò)增反應(yīng)良好，溶解曲線均為單峰，PCR擴(kuò)增特異性較好。

2.4.2 HSP27 siRNA對(duì)SW480細(xì)胞HSP27 mRNA表達(dá)的影響：人大腸癌SW480細(xì)胞按上述方法轉(zhuǎn)染3對(duì)不同序列HSP27 siRNA、negative control siRNA或未轉(zhuǎn)染正常培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)。各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中HSP27相對(duì)表達(dá)量結(jié)果見圖5。其中陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照組和正常對(duì)照組之間HSP27 mRNA相對(duì)表達(dá)量差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），siNRA-b組HSP27 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為0.57±0.02，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而siRNA-c組的相對(duì)表達(dá)量為0.31±0.01，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。表明siRNA-c組的干擾效果更好，在mRNA水平siRNA-c對(duì)靶基因HSP27抑制效率為69%。

圖2 不同人結(jié)腸癌細(xì)胞株對(duì)應(yīng)5-FU化療藥的IC50值及與HSP27表達(dá)的相關(guān)性

圖3 激光共聚焦顯微鏡下熒光通道可見綠色熒光（×200）

圖4 各處理組細(xì)胞HSP27及內(nèi)參基因Rea1-time PCR擴(kuò)增曲線和溶解曲線圖

2.5 HSP27 siRNA對(duì)大腸癌SW480細(xì)胞HSP27蛋白水平表達(dá)的影響 見圖6。siRNA-b組大腸癌SW480細(xì)胞中HSP27蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.82±0.09，與正常對(duì)照組（1.45±0.12）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；siRNA-c組的表達(dá)量為0.56±0.08，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照組和正常對(duì)照組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果表明HSP27-siRNA干擾能抑制細(xì)胞HSP27蛋白的表達(dá)，在蛋白水平siRNA-c組的抑制效率為57.9%。

圖5 各實(shí)驗(yàn)組SW480細(xì)胞中HSP27 mRNA的相對(duì)表達(dá)量

圖6 各實(shí)驗(yàn)組SW480細(xì)胞中HSP27蛋白水平的相對(duì)表達(dá)量

2.6 HSP27-siRNA對(duì)SW480細(xì)胞生存的影響 將上述3組細(xì)胞（正常對(duì)照組、陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照組、HSP27 siRNA組），分別培養(yǎng)（12、24、36、48和60 h）后，進(jìn)行CCK-8試劑盒檢測(cè)。結(jié)果顯示，隨著時(shí)間延長，陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照組、HSP27 siRNA組細(xì)胞存活均不同程度下降，前者分別為98.75±4.32、95.42±7.13、94.39±5.63、94.75±6.94、93.75±7.44，后者分別為96.43±6.51、94.37±5.82、94.01±6.21、92.53±7.48、89.11±5.47。兩者與正常對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果表明終濃度為100 nmol/L的HSP27 siRNA可抑制SW480細(xì)胞生長，但不顯著。

2.7 siRNA干擾靶向抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞HSP27表達(dá)對(duì)5-FU敏感性的影響 HSP27 siRNA-c干擾組細(xì)胞在用5-FU處理后，細(xì)胞生長情況與陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照組和正常對(duì)照組相比明顯受到抑制，IC50值與兩對(duì)照組相比明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。結(jié)果提示靶向HSP27基因siRNA干擾可提高SW480細(xì)胞對(duì)化療藥物5-FU的敏感性。

表2 HSP27-siRNA靶向SW480細(xì)胞干擾對(duì)5-FU藥物敏感性的影響（n=3，±s）

表2 HSP27-siRNA靶向SW480細(xì)胞干擾對(duì)5-FU藥物敏感性的影響（n=3，±s）

與正常對(duì)照組和陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照組比：aP＜0.05

3 討論

近年來隨著人們生活節(jié)奏的加快及飲食結(jié)構(gòu)的改變，大腸癌在我國的發(fā)病率和病死率已經(jīng)呈逐年上升的趨勢(shì)，發(fā)病率已躍居第3位，而病死率則位居惡性腫瘤死亡譜的第4位，并且有明顯的年輕化趨勢(shì)[5]。目前治療上主要以外科手術(shù)切除為主結(jié)合輔助放化療，以5-FU為基礎(chǔ)的術(shù)后輔助化療使淋巴結(jié)陽性的結(jié)腸癌患者的病死率有所降低，但是由結(jié)腸癌耐藥引起的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然是進(jìn)一步提高療效的主要障礙[6]，因此進(jìn)一步研究大腸癌細(xì)胞對(duì)5-FU的耐藥機(jī)制、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)5-FU化療的敏感性迫在眉睫。

HSP又稱應(yīng)激蛋白，是指細(xì)胞在應(yīng)激情況下所產(chǎn)生的一組序列高度保守的蛋白質(zhì)，廣泛存在于原核和真核生物中，應(yīng)激狀態(tài)下可被誘導(dǎo)表達(dá)。HSP27是小分子質(zhì)量HSP亞家族的重要成員，目前國內(nèi)外研究表明，其在肝臟、胃、結(jié)直腸等消化道腫瘤組織中異常高表達(dá)[7-9]，我們?cè)谇捌谘芯恐?，已?jīng)證實(shí)HSP27在結(jié)腸癌細(xì)胞及裸鼠皮下移植瘤組織中呈高表達(dá)[10-11]。最近的蛋白組學(xué)研究表明，HSP27在結(jié)直腸癌中的過表達(dá)與化療耐藥和預(yù)后不良存在必然聯(lián)系[12]。Wang等[13]對(duì)62例結(jié)直腸癌外科手術(shù)后行5-FU為基礎(chǔ)化療患者進(jìn)行了6年的隨訪研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中HSP27高表達(dá)的患者，其化療療效較差。本研究通過Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)不同種類人大腸癌細(xì)胞中HSP27蛋白的表達(dá)水平存在一定差異，同時(shí)檢測(cè)了各細(xì)胞株對(duì)5-FU的敏感性，證實(shí)了大腸癌細(xì)胞中HSP27蛋白的表達(dá)水平與5-FU化療藥物耐藥存在必然聯(lián)系，通過直線相關(guān)性分析顯示各組細(xì)胞HSP27的表達(dá)水平與IC50值呈正相關(guān)性（R=0.959，P=0.041）。其中SW480細(xì)胞HSP27相對(duì)表達(dá)量最高，而對(duì)應(yīng)的IC50值也越高，說明SW480細(xì)胞對(duì)5-FU出現(xiàn)明顯耐藥，應(yīng)而在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中我們選擇SW480細(xì)胞作為研究對(duì)象，通過RNA干擾抑制HSP27基因的表達(dá)，并初步探討沉默該基因?qū)?-FU抗腫瘤作用的影響。

RNA干擾是指在真核細(xì)胞中引入雙鏈RNA分子從而導(dǎo)致具有序列同源性的基因產(chǎn)生特異性基因沉默的現(xiàn)象，該技術(shù)已成為分子生物學(xué)研究中最為活躍的熱點(diǎn)之一。目前國內(nèi)外進(jìn)行的RNA干擾試驗(yàn)研究大部分是通過化學(xué)合成靶向某個(gè)基因序列的siRNA，通過特定的載體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，最終達(dá)到沉默目的基因的過程。本研究中我們通過設(shè)計(jì)合成了3對(duì)針對(duì)不同靶點(diǎn)的HSP27小干擾RNA作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)合成FAM熒光標(biāo)記的陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照用于轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化和轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)。激光共聚焦顯微鏡觀察其轉(zhuǎn)染效率在80%以上，表明通過LipofectamineTM2000載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的可行性，應(yīng)用Real-time PCR及Western blot技術(shù)對(duì)各組細(xì)胞HSP27 mRNA及蛋白水平表達(dá)變化進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明設(shè)計(jì)的3對(duì)序列中有兩對(duì)siRNA干擾序列能有效抑制HSP27的表達(dá)，其中以siRNA-c干擾效果最好，在mRNA和蛋白水平的抑制率分別為69.5%、57.9%，因而我們最終選擇了siRNA-c干擾序列進(jìn)行RNAi實(shí)驗(yàn)研究。我們將轉(zhuǎn)染終濃度為100 nmol/L的HSP27 siRNA的SW480細(xì)胞培養(yǎng)12、24、36、48、60 h后，通過CCK-8試劑盒檢測(cè)，計(jì)算細(xì)胞存活率分別為96.43±6.51、94.37±5.82、94.01±6.21、92.53±7.48、89.11±5.47，與正常對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明終濃度為100 nmol/L的HSP27 siRNA可抑制SW480細(xì)胞生長，但不顯著。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)HSP27 siRNA-c轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞對(duì)5-FU的IC50明顯下調(diào)，說明抑制HSP27表達(dá)后，可明顯增加大腸癌細(xì)胞對(duì)化療藥物5-FU的敏感性，降低5-FU的治療濃度。

綜上所述，我們認(rèn)為HSP27蛋白在大腸癌細(xì)胞中的高表達(dá)與人大腸癌的發(fā)生、發(fā)展及耐藥密切相關(guān)，大腸癌細(xì)胞中HSP27的表達(dá)與5-FU耐藥呈正相關(guān)，靶向HSP27的siRNA能有效抑制大腸癌SW480細(xì)胞HSP27蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞生長，同時(shí)增強(qiáng)5-FU化療藥物的敏感性，該實(shí)驗(yàn)研究為臨床上解決大腸癌細(xì)胞對(duì)5-FU化療耐藥基因靶向治療問題提供理論依據(jù)。

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（本文編輯：吳健敏）

Silencing gene of heat shock protein 27 increases the sensitivity to 5-FU in colorectal cancer cells

HUANG Chongjie, LIU Changbao, ZHENG Chenguo, CAI Mao.Department of Colorectal Surgery, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective:To investigate the relationship between the HSP27 expression level and the sensitization to 5-FU in different kinds of colon cancer cells, and then explore the effect of HSP27 gene down-regulated by siRNA interference, and the sensitive of 5-FU.Methods:The HSP27 expression level in different kinds of colon cancer cells were detected by Western blot, and the inhibition rates of different concentration of 5-FU were determined by CCK-8 method, then the relationship between the relative level and IC50of 5-FU was analyzed by Linear correlation.Three siRNA sequences targeted on special sequence of HSP27 gene were designed, All siRNAs were transfected by lipofectamine 2000.The transfection effciency was observed by laser confocal microscope.The expression of HSP27 was tested with qRT-PCR and Western blot analysis.Different concentrations of 5-FU were added to the cells, which were transfected with siRNA-HSP27 48 h before.Then, the inhibition rate was determined by CCK-8 after 24 h.Results: The correlation between the level of HSP27 expression and IC50were positive.Real-time PCR and Western blot revealed that two targeted HSP27-siRNA could effectively inhibit the mRNA and protein expression of HSP27.CCK-8 showed that the transfection of HSP27-siRNA can improve the sensitivity of SW480 to 5-FU and the IC50was downregulated signifcantly.Conclusion:The correlation between the level of HSP27 expression of colon cancer cells and IC50of 5-FU are positive.HSP27-siRNA leads to the effcient inhibition of HSP27 expression in SW480 cells, and increase the sensitization to 5-FU.

colorectal carcinoma; HSP27; 5-fuorouracil; RNA interference

R735.34

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.02.006

2014-08-07

溫州市科技局科研基金資助項(xiàng)目（Y20090436）。

黃崇杰（1987-），男，浙江溫州人，住院醫(yī)師，碩士。

劉長寶，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，Email：405120@ 163.com。