宋麗娟，倪云杰，林振浩，侯良磊，吳漪皓，胡歡歡，黃曉燕，楊德業(yè)，（.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科，浙江 溫州 3505；.杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院 心內(nèi)科，浙江杭州 3005）

·論 著·

三個(gè)新的小鼠Pax-8剪接體的克隆及時(shí)空表達(dá)

宋麗娟1，倪云杰1，林振浩1，侯良磊1，吳漪皓1，胡歡歡1，黃曉燕2，楊德業(yè)1，2
（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科，浙江 溫州 325015；2.杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院 心內(nèi)科，浙江杭州 310015）

目的：轉(zhuǎn)錄因子Pax-8在胚胎發(fā)育及腫瘤發(fā)生中具有重要作用，本研究旨在克隆及鑒定小鼠Pax-8基因亞型，并檢測(cè)其時(shí)空表達(dá)。方法：從野生型C57BL/6胎鼠的心臟中提取總RNA（Trizol法），反轉(zhuǎn)錄成cDNA，應(yīng)用Q5超保真酶進(jìn)行目的基因擴(kuò)增，并克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定及測(cè)序鑒定。結(jié)果：在小鼠發(fā)育不同時(shí)期，除已知全長(zhǎng)Pax-8a外，發(fā)現(xiàn)3個(gè)新的小鼠Pax-8選擇性剪接體，分別命名為Pax-8b（第4外顯子缺失）、Pax-8c（第4和第11外顯子缺失）、Pax-8d（第4和第9外顯子缺失）。結(jié)論：小鼠心臟中Pax-8存在四種選擇性剪接體，且在不同發(fā)育時(shí)期差異表達(dá)。

Pax-8基因；剪接體；時(shí)空表達(dá)；克?。恍∈?/p>

轉(zhuǎn)錄因子Pax-8屬于成對(duì)盒基因家族，該家族共有9個(gè)成員，分別命名為Pax-1至Pax-9，其編碼產(chǎn)物對(duì)胚胎時(shí)期組織器官的發(fā)育和分化有重要作用。Pax-8基因在腎臟和甲狀腺表達(dá)較高，在其他器官如心臟、肺、小腸等也有少量表達(dá)[1]。Pax-8基因是成熟的甲狀腺細(xì)胞生存和功能維持的必備條件，和甲狀腺功能減退、甲狀腺腫瘤、泌尿系統(tǒng)腫瘤、卵巢腫瘤等密切相關(guān)[2-6]。研究發(fā)現(xiàn)Pax-8基因敲除小鼠心臟呈球形，出現(xiàn)室間隔缺損，體外水平Pax-8可抑制心肌細(xì)胞凋亡，提示Pax-8基因可能通過(guò)心肌細(xì)胞凋亡通路而參與心臟發(fā)育過(guò)程[7-10]。

Kozmik等[11]發(fā)現(xiàn)人類Pax-8基因有多個(gè)剪接體，在人腎臟腫瘤細(xì)胞系中，Pax-8因第7和第8外顯子丟失或存在而形成四種亞型，在人的胎盤中發(fā)現(xiàn)另2種亞型。Poleev等[12]發(fā)現(xiàn)不同的Pax-8剪接體形式可能參與了轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控。然而，小鼠心臟發(fā)育過(guò)程中是否存在Pax-8不同亞型，及其功能的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，我們從不同發(fā)育階段的C57BL/6小鼠心臟中克隆Pax-8基因，旨在研究Pax-8各亞型在心臟中的時(shí)空表達(dá)及其功能。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑 3個(gè)月齡C57BL/6雌雄小鼠購(gòu)于杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；pcDNA3.1（-）、引物、Trizol試劑、Lipofectamine 2000、瓊脂糖購(gòu)于Invitrogen；氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇、DEPC水購(gòu)于上海生工公司、4S Red Plus增強(qiáng)型安全核酸染色劑購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司；Ta-KaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、rTaq酶、DNA ladder購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；NEB Q5超保真DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司；pGEM?-T Easy Vector Systems I購(gòu)自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；感受態(tài)細(xì)胞DH5a購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 心臟RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 取雌雄小鼠各10只配籠，在母鼠懷孕13.5、15.5和17.5 d時(shí)，頸脫臼法處死，取出胚胎，分離胚胎心臟；分離出生12 h乳鼠的心臟。Trizol法提取心臟總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得心臟cDNA。

1.3 Pax-8基因擴(kuò)增及連接 擴(kuò)增使用引物序列如下：F：5’-GATGCCTCACAACTCGATCAG-3’，R：5’-GTCCCCA TGACAACTACAGATGG-3’。反應(yīng)條件：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，循環(huán)34次；72 ℃ 5 min；4 ℃保持。PCR產(chǎn)物純化加尾后與T-Easy載體連接、轉(zhuǎn)化、小提。

1.4 重組Pax-8-pcDNA3.1（-）真核表達(dá)載體的構(gòu)建 Not I酶切pcDNA3.1（-）載體與Pax-8-T Easy重組載體，酶切后的pcDNA3.1（-）載體經(jīng)去磷酸化后再與Pax-8片段連接、轉(zhuǎn)化，獲得重組Pax-8-pcDNA3.1（-）真核表達(dá)載體。重組載體使用限制性內(nèi)切酶BspE I與BamH I酶切鑒定插入方向。正向插入質(zhì)粒送測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 不同胚胎發(fā)育時(shí)期心臟中Pax-8的克隆 各發(fā)育時(shí)期心臟RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增后，得到多條不同長(zhǎng)度剪接體片段（見(jiàn)圖1）。在E13.5心臟中克隆出2條條帶，長(zhǎng)度分別約為1 400 bp和1 000 bp；在E15.5心臟中克隆出3條條帶，長(zhǎng)度約為1 400 bp、1 100 bp和1 000 bp；在E17.5心臟中克隆出2條條帶，長(zhǎng)度分別約1 400 bp和1 100 bp；出生12 h的乳鼠心臟中出現(xiàn)5條條帶，長(zhǎng)度分別約1 500 bp、1 400 bp、1 200 bp、1 100 bp及1 000 bp。

圖1 不同胚胎發(fā)育時(shí)期心臟中Pax-8的表達(dá)

測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)（NM_011040.4），如圖2所示，發(fā)現(xiàn)克隆所得約1 500 bp片段和1 400 bp片段相同，為小鼠全長(zhǎng)Pax-8，命名為Pax-8a（1 374 bp）；長(zhǎng)度約為1 200 bp的片段缺失Pax-8基因第4外顯子，命名為Pax-8b（1 176 bp）；長(zhǎng)度約為1 100 bp的片段缺失第4外顯子和第11外顯子，命名為Pax-8c （1 079 bp）；長(zhǎng)度約為1 000 bp的片段缺失第4外顯子和第9外顯子，命名為Pax-8d（969 bp）。

2.2 各Pax-8亞型克隆和重組質(zhì)粒載體構(gòu)建 DNA片段與T-easy連接后，使用Not I酶切，然后與經(jīng)Not I酶切去磷酸化的pcDNA3.1（-）進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、小提，獲得重組載體，經(jīng)BspEI和BamHI雙酶切結(jié)果顯示插入的目的基因片段方向及大小正確（見(jiàn)圖3），即Pax-8a-pcDNA3.1（-）全長(zhǎng)6 851 bp，酶切獲得1 060 bp和5 791 bp的兩條片段；Pax-8b-pcDNA3.1（-）全長(zhǎng)6 653 bp，酶切獲得1 060 bp和5 593 bp兩條片段；Pax-8c-pcDNA3.1（-）全長(zhǎng)6 566 bp，酶切獲得973 bp和5 593 bp兩條片段；Pax-8d-pcDNA3.1（-）全長(zhǎng)6 446 bp，酶切獲得853 bp和5 593 bp兩條條帶。

3 討論

Pax基因家族是一個(gè)古老的高度保守的家族，其編碼產(chǎn)物為一組轉(zhuǎn)錄因子，在器官形成、分化過(guò)程中起重要作用。Pax-8是Pax基因家族一員，和組織器官的發(fā)育分化、功能維持、腫瘤發(fā)生發(fā)展等密切相關(guān)，在多個(gè)物種、多個(gè)器官中存在不同剪接體[13-14]。人的Pax-8基因含11個(gè)外顯子，已有文獻(xiàn)[11]報(bào)道的人腎臟腫瘤細(xì)胞來(lái)源的Pax-8有4個(gè)亞型，它們存在第7和/或第8外顯子缺失，但都保留了Pax-8的成對(duì)結(jié)構(gòu)域。小鼠Pax-8基因含12個(gè)外顯子，本研究發(fā)現(xiàn)小鼠心臟中存在3個(gè)缺少第4外顯子的Pax-8亞型，即Pax-8b、Pax-8c、Pax-8d，其中第3和第4外顯子編碼小鼠Pax-8成對(duì)結(jié)構(gòu)域，提示這3種亞型可能影響Pax-8與其他基因、蛋白等的結(jié)合。

圖2 Pax-8基因（NM_011040.4）外顯子示意圖及不同外顯子缺失亞型測(cè)序結(jié)果（部分）。外顯子4、9、11部分分別用紅、綠、藍(lán)下劃線標(biāo)示

圖3 各重組Pax-8-pcDNA3.1（-）質(zhì)粒經(jīng)BspEI和BamHI雙酶切電泳結(jié)果

在本實(shí)驗(yàn)所觀察的時(shí)間點(diǎn)中，Pax-8a持續(xù)表達(dá)，而各亞型表達(dá)水平隨發(fā)育進(jìn)程而變化，提示Pax-8的不同剪接形式不僅參與了Pax-8 mRNA亞型的生成，還可能通過(guò)時(shí)空表達(dá)的變化參與小鼠心臟發(fā)育。這些剪接體對(duì)心臟發(fā)育的未知功能或作用，值得后期深入研究。

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（本文編輯：吳健敏）

Cloning of three newly-identified alternatively splicing isoforms of mouse Pax-8 and their spatial and tempo-ral expression patterns

S ONG Lijuan1,NI Yunjie1,LIN Zhenhao1,HOU Lianglei1,WU Yihao1,HU Huanhuan1,HUANG Xiaoyan2,YANG Deye1,2.
1.Department of Cardiology,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325035; 2.Department of Cardiology,the Affiliated Hospital of Hangzhou Normal University,Hangzhou,310015

Objective:Pax-8 gene plays a pivotal role in embryonic development and tumorgenesis.This tudy aims to identify and clone different alternatively splicing isoforms of mouse Pax-8,and to detect their spaial and temporal expression patterns.Methods:Hearts from wild-type prenatal and postnatal mice of C57BL/6 background were carefully excised and total RNA was extracted using Trizol reagent.The cDNA fragment of Pax-8 was reverse transcribed and amplified by Q5 Taq polymerase and cloned into pcDNA3.1(-) vector.The recombinant vectors were validated by enzyme digestion and sequencing.Results:In comparison to their cognate ull-length Pax-8a,three alternatively splicing isoforms of mouse Pax-8,designated Pax-8b (exon4 deleted),Pax-8c (exon 4 and 11 deleted) and Pad-8d (exon 4 and 9 deleted),were identified in different periods of embryogenesis and successfully cloned.Conclusion:Mouse heart has four alternatively splicing isoforms of mouse Pax-8 that express in different spatial and temporal expression patterns.Such findings open a bright avenue for the urther functional study.

Pax-8 gene; alternatively splicing isoforms; spatial and temporal expression; cloning; mice

Q785

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.04.002

2014-12-23

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81270230）

宋麗娟（1989-），女，江西贛州人，碩士生。

楊德業(yè)，教授，博士生導(dǎo)師，Email：deyeyang@126.com。