楊嫆嫆，陸紅，吳蓮鳳，王斯璐，林成成，梁勇，白永恒（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 3505，．醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心；．外科實(shí)驗(yàn)室）

·論 著·

垂盆草提取物對(duì)TGF-β 1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和基質(zhì)累積的影響

楊嫆嫆1，陸紅1，吳蓮鳳1，王斯璐2，林成成2，梁勇2，白永恒2
（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325015，1．醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心；2．外科實(shí)驗(yàn)室）

目的：探討垂盆草提取物（SSBE）對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β1）誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（EMT）和基質(zhì)累積的影響。方法：將體外培養(yǎng)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞系（NRK-52E）細(xì)胞分為只加入溶劑的對(duì)照組，只加入TGF-β1（濃度為5μg/L）的誘導(dǎo)組，以及加入SSBE（濃度為10和100 mg/L）和TGF-β1（濃度為5μg/L）的干預(yù)組。細(xì)胞形態(tài)變化采用倒置相差顯微鏡觀察；細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)I I I型膠原、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）和鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達(dá)；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)α-SMA、骨形成蛋白-7（BMP-7）、緊密連接蛋白（Tjp1）、I型膠原（Col1a1）、I I I型膠原（Col3a1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2 （MMP-2）和抑制因子-2（TIMP-2）mRNA的表達(dá)。結(jié)果：TGF-β1作用后，NRK-52E細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，形成了長(zhǎng)梭狀的肌成纖維細(xì)胞（MFs）；其上皮標(biāo)志物E-cadherin和Tjp1的表達(dá)水平顯著下降，而MFs標(biāo)志物α-SMA表達(dá)顯著增加；基質(zhì)成分Col1a1和Col3a1的表達(dá)也明顯增高。應(yīng)用10和100 mg/L的SSBE干預(yù)后，抑制了TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)改變和α-SMA、Col1a1和Col3a1的高表達(dá)，并促進(jìn)E-cadherin和Tjp1的表達(dá)。另外，SSBE也提高了BMP-7表達(dá)水平和MMP-2/TIMP-2比值。結(jié)論：SSBE可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞纖維化樣改變，而這一作用與其能有效阻止EMT進(jìn)程和基質(zhì)累積有關(guān)。

垂盆草提取物；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；上皮-間葉轉(zhuǎn)分化；基質(zhì)累積

腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。在EMT過(guò)程中，小管細(xì)胞喪失了上皮細(xì)胞的標(biāo)志，如鈣黏蛋白（E-cadherin）等，形成了陽(yáng)性表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白α-SMA）的肌成纖維細(xì)胞（myofibroblasts，MFs）[2]。MFs是一種基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞，可分泌大量基質(zhì)成分I型膠原（Col1a1）和I I I型膠原（Col3a1）在腎組織間隙累積從而導(dǎo)致纖維化的發(fā)生。抑制EMT進(jìn)程，對(duì)防治腎間質(zhì)纖維化具有十分重要的意義。垂盆草是一種景天科多年生草本植物，我們的前期研究顯示，其提取物（Sedum sarmentosum Bunge extract，SSBE）可拮抗馬兜鈴酸所致的腎小管上皮細(xì)胞纖維化樣改變[3]。這種抗纖維化作用，我們推測(cè)可能與SSBE抑制TGF-β 1的高表達(dá)密切相關(guān)。因此，本研究中我們擬采用TGF-β 1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞（NRK-52E）出現(xiàn)EMT轉(zhuǎn)變，來(lái)探討SSBE對(duì)EMT和基質(zhì)累積的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 SSBE，安徽宣城百草植物工貿(mào)公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清，杭州四季青生物公司；胰蛋白酶和TRIzol提取液，美國(guó)Gibco公司；人重組TGF-β 1蛋白，美國(guó)PeproTech公司；Col3a1一抗，北京Bioss公司；α-SMA一抗，美國(guó)Santa Cruz公司；E-cadherin一抗，美國(guó)Abcam公司；熒光素（FITC）標(biāo)記山羊抗兔IgG，北京康位生物公司；RT-PCR試劑，美國(guó)Promega公司。MyCycler梯度PCR儀，美國(guó)Bio-Rod公司；7500定量PCR儀，美國(guó)Applied Biosystems公司；Varioskan Flash全波長(zhǎng)多功能掃描儀，美國(guó)Thermo Scien-tific公司；DM4000 B LED熒光正置顯微鏡，德國(guó)Leica公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞：大鼠腎小管上皮細(xì)胞株（NRK-52E）購(gòu)于中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組和細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：細(xì)胞培養(yǎng)前，按適當(dāng)濃度接種于六孔板中，待融合到70%～80%時(shí)，換成無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液并開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)。①對(duì)照組：未加入SSBE或TGF-β 1；②誘導(dǎo)組：培養(yǎng)液中加入TGF-β 1（濃度為5μg/L）；③治療組：培養(yǎng)液中同時(shí)加入SSBE和TGF-β 1（濃度為5μg/L），SSBE的濃度分別為10和100 mg/L。上述處理后的細(xì)胞置37 ℃和5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.3 real-time RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)：采用Trizol試劑提取已處理細(xì)胞中的RNA，于260/280 nm測(cè)定吸光度值以確定樣本純度和濃度。根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計(jì)骨形成蛋白-7（BMP-7）、α-SMA、緊密連接蛋白（Tjp1）、基質(zhì)金屬蛋白酶2 （MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑2（TIMP-2）、Col1a1和Col3a1 mRNA特異性引物，以β-actin作為內(nèi)參對(duì)照（見(jiàn)表1），由上海捷瑞公司合成。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系：5 μL 2×SYBR Green熒光定量試劑、2 μL引物（上、下游各1μL，終濃度200 nmol/L）、2μL反應(yīng)緩沖液、1μL cDNA。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min、95 ℃ 10 s、60 ℃ 35 s，40個(gè)循環(huán)。采用溶解曲線評(píng)價(jià)PCR結(jié)果可靠性，采用2-△△Ct計(jì)算相對(duì)mRNA表達(dá)量。△△Ct= [Ct目的基因（待測(cè)樣品）-Ct內(nèi)參（待測(cè)樣品）]-[Ct目的基因（校正樣品）-Ct內(nèi)參（校正樣品）]。

表1 擴(kuò)增EMT和基質(zhì)成分mRNA特異性引物

1.2.4 細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)EMT和基質(zhì)成分相關(guān)分子的表達(dá)：將細(xì)胞經(jīng)胰酶消化收集后分別以1× 105個(gè)細(xì)胞接種于含載玻片的六孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)至70%融合后，分別用TGF-β 1和TGF-β 1聯(lián)用SSBE進(jìn)行處理24 h，用4%多聚甲醛固定30 min，0.3% Triton-X（1 mL/孔）破膜，室溫20 min。0.5%正常山羊血清封閉。在各細(xì)胞爬片上滴加E-cadherin、α-SMA和Col3a1一抗工作液，4 ℃孵育過(guò)夜。滴加Dylight488（綠色）或594（紅色）標(biāo)記的二抗工作液，37 ℃孵育60 min。滴加DAPI于蓋玻片上，室溫染色5 min。細(xì)胞胞質(zhì)綠色或紅色和胞核藍(lán)色為陽(yáng)性著色。每組取3張片，每張片子取10個(gè)高倍視野，運(yùn)用Image Pro Plus軟件分析平均光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，兩組樣本比較采用t檢驗(yàn)和精確概率法，多組間樣本比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SSBE抑制TGF-β1誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞的形態(tài)改變

相差顯微鏡下，對(duì)照組NRK-52E細(xì)胞培養(yǎng)24 h后呈現(xiàn)鋪路石狀，細(xì)胞結(jié)合緊密，細(xì)胞間隙不明顯（見(jiàn)圖1）；5μg/L的TGF-β 1的誘導(dǎo)下，NRK-52E細(xì)胞呈梭形或不規(guī)則形狀，細(xì)胞間隙拉大；在TGF-β 1基礎(chǔ)上用10 mg/L的SSBE干預(yù)后，梭形細(xì)胞有所改善，細(xì)胞間隙縮小；當(dāng)SSBE濃度增加到100 mg/L后，細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)到鋪路石狀，細(xì)胞間隙減小，相互間結(jié)合緊密。這些結(jié)果提示SSBE抑制了TGF-β 1誘導(dǎo)的小管上皮細(xì)胞纖維樣改變，并呈現(xiàn)濃度依賴性。

2.2 SSBE抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT和基質(zhì)累積 免疫熒光染色結(jié)果顯示，5 μg/L TGF-β 1的作用下，NRK-52E細(xì)胞中上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)，而MFs標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)水平明顯升高，見(jiàn)圖2。此外，TGF-β 1也促進(jìn)了基質(zhì)成分Col3a1蛋白的表達(dá)。Real-time RT-PCR結(jié)果顯示，TGF-β 1抑制了緊密連接蛋白Tjp1 mRNA的表達(dá)，促進(jìn)了α-SMA、Col1a1和Col3a1 mRNA的表達(dá)（見(jiàn)圖3）。應(yīng)用10和100 mg/L SSBE干預(yù)后，TGF-β 1誘導(dǎo)的這些EMT改變以及基質(zhì)累積均被抑制，并且其抑制作用呈現(xiàn)濃度相關(guān)性。

圖1 SSBE對(duì)TGF-β 1作用下NRK-52E細(xì)胞形態(tài)的影響（×200）

圖2 SSBE對(duì)TGF-β 1作用下NRK-52E細(xì)胞EMT和膠原累積的影響（×200）

圖3 SSBE對(duì)TGF-β 1誘導(dǎo)的EMT和基質(zhì)累積相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.3 SSBE逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的BMP-7高表達(dá) 以前研究顯示，TGF-β 1誘導(dǎo)的EMT反應(yīng)可被BMP-7所逆轉(zhuǎn)，BMP-7表達(dá)下降可能是EMT形成重要的原因之一[4]。因此，我們?cè)u(píng)價(jià)了SSBE對(duì)BMP-7的影響。Real-time RT-PCR結(jié)果顯示，在TGF-β 1作用后，NRK-52E細(xì)胞中BMP-7 mRNA的表達(dá)水平顯著下調(diào)；而SSBE干預(yù)后，BMP-7 mRNA的表達(dá)水平恢復(fù)（見(jiàn)圖4A）。

2.4 SSBE恢復(fù)TGF-β1誘導(dǎo)的MMP-2/TIMP-2失衡

MMP-2及TIMP-2是體內(nèi)基質(zhì)成分合成和降解重要的調(diào)節(jié)因素[5]。MMP-2/TIMP-2比例一旦降低，說(shuō)明基質(zhì)合成速度超過(guò)降解速度，導(dǎo)致基質(zhì)累積和纖維化。本研究中，TGF-β 1雖同時(shí)上調(diào)了MMP-2和TIMP-2 mRNA表達(dá)水平，但上調(diào)TIMP-2 mRNA的程度高于MMP-2，從而導(dǎo)致其比例降低（見(jiàn)圖4B-C）。而應(yīng)用SSBE干預(yù)后，盡管MMP-2和TIMP-2 mRNA表達(dá)水平均下調(diào)，但TIMP-2 mRNA的表達(dá)水平下降更為嚴(yán)重。這些結(jié)果提示SSBE恢復(fù)了TGF-β 1誘導(dǎo)的MMP-2/TIMP-2失衡，從而改善基質(zhì)成分累積程度。

圖4 SSBE干預(yù)TGF-β1對(duì)BMP-7、MMP2和TIMP-2 mRNA表達(dá)的影響

3 討論

根據(jù)功能學(xué)和形態(tài)學(xué)分類，可將腎組織分為上皮和間葉兩種細(xì)胞類型，每一種都有其特有的功能。上皮細(xì)胞是多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，由緊密連接的細(xì)胞組成，并緊密黏附于基底膜表面。間葉細(xì)胞（主要為MFs）則為連接疏松的細(xì)胞，主要存在于細(xì)胞外基質(zhì)，它們自己產(chǎn)生并有非常強(qiáng)的遷移能力?，F(xiàn)今越來(lái)越多的證據(jù)證明上皮細(xì)胞能通過(guò)EMT改變其表型獲得MFs的特征，使其增加移動(dòng)和合成基質(zhì)成分，如Col1a1 和Col3a1等[2]。EMT通常見(jiàn)于胚胎生長(zhǎng)期組織形態(tài)形成和腫瘤的生長(zhǎng)過(guò)程。然而，在惡劣或損傷微環(huán)境中，上皮細(xì)胞可以通過(guò)EMT，使其獲得適應(yīng)環(huán)境的表型，參與損傷后組織修復(fù)和纖維化[5]。在機(jī)體內(nèi)，多種因素均可導(dǎo)致EMT的發(fā)生，如促纖維因子TGF-β 1表達(dá)的升高，BMP-7表達(dá)的下調(diào)等[6-7]。本實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)用TGF-β 1作用腎小管上皮細(xì)胞后，小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)纖維樣改變，NRK-52E細(xì)胞表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin和Tjp1減少，而表達(dá)MFs標(biāo)志物α-SMA增多，基質(zhì)成分Col1a1和Col3a1表達(dá)增加，這些結(jié)果提示TGF-β 1誘導(dǎo)了EMT的發(fā)生。應(yīng)用SSBE干預(yù)后，小管上皮細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)變得到緩解，并且拮抗EMT作用的BMP-7表達(dá)也隨之升高。因此，這些結(jié)果提示SSBE能拮抗TGF-β 1誘導(dǎo)的EMT和腎纖維化作用。

SSBE為垂盆草的回流提取物[8]，而后者屬于景天科多年生草本植物，是中國(guó)藥典記載的常用中藥之一，具有清利濕熱、解毒功效?？紤]到SSBE是一種多組分的混合物，是否是由于其內(nèi)組分的作用而影響其效應(yīng)呢？我們前期通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定其成分，發(fā)現(xiàn)SSBE中含有槲皮素、山萘酚、異鼠李素、木犀草素和異甘草素等，其中槲皮素含量最高。槲皮素又名櫟精，具有降低血壓、增強(qiáng)毛細(xì)血管抵抗力、減少毛細(xì)血管脆性、降血脂等作用。此外，槲皮素也具有抗腫瘤和抗纖維化的作用，并且這種抗纖維化作用主要是通過(guò)調(diào)控MMP-2的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)[9]。本研究中，我們也分析了SSBE對(duì)MMP-2及其抑制因子TIMP-2表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SSBE恢復(fù)了由于TGF-β 1所致的MMP-2/TIMP-2比值下調(diào)，說(shuō)明SSBE抑制了MFs合成基質(zhì)，促進(jìn)其降解?；谏鲜鲎C據(jù)，推測(cè)SSBE的抗纖維化作用可能與其主要組分槲皮素存在一定的相關(guān)性。

綜上所述，我們從體外實(shí)驗(yàn)角度證實(shí)了SSBE能拮抗TGF-β 1誘導(dǎo)的EMT效應(yīng)，抑制基質(zhì)合成，促進(jìn)降解，進(jìn)而發(fā)揮抗腎纖維化作用。在未來(lái)的工作，我們將評(píng)價(jià)SSBE各組分對(duì)于小管上皮細(xì)胞EMT以及腎纖維化的作用，并且深入探索其可能的分子機(jī)制，為今后纖維化類疾病的中草藥治療提供理論依據(jù)。

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（本文編輯：吳健敏）

Effect of Sedum sarmentosum Bunge Extract on TGF-β1-induced renal epithelial-to-mesenchymal transi- tion and matrix accumulation

YANG Rongrong1,LU Hong1,WU Lianfeng1,WANG Silu2,LIN Chengcheng2,LIANG Yong2,BAI Yongheng2.
1.Department of Laboratory Medicine,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325015; 2.Wenzhou Key Laboratory of Surgery,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325015

Objective:To investigate the protective effects of Sedum sarmentosum Bunge Extract (SSBE) on TGF-β1-induced epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and matrix accumulation in renal tubular epithelial cells (NRK-52E).Methods:NRK-52E cells were divided randomly into:control group treated with only solvent,TGF-β1 group treated with TGF-β1 at the concentrations with 5 μg/L and SSBE group treated with TGF-β1 plus SSBE at the concentrations with 10 and 100 mg/L.The morphology of the NRK-52E cells was observed under inverted/phase contrast microscope.Immunofluorescent analysis was performed to detect the expression of epithelial marker α-smooth muscle actin (α-SMA),mesenchymal marker E-cadherin,and matrix component type III collagen.Gene expression of α-SMA,bone morphogenic protein-7 (BMP-7),tight junction protein-1 (Tjp1),Col1a1,Col3a1,MMP-2,and TIMP-2 were also quantified by real-time RT-PCR.Results:In TGF-β-treated NRK-52E cells,fibrosis-like phonotype was obviously increased.TGF-β1 increased the expression of α-SMA,and decreased the expression of E-cadherin and Tjp1.Also,TGF-β1 enhanced the expression of type I and III collagens.Treatment with SSBE at the concentrations with 10 and 100 mg/L inhibited TGF-β1-induced fibrosislike phenotype of NRK-52E cells,accompanied with down-regulated expression of α-SMA,Col1a1 and Col1a1 and up-regulated expression of E-cadherin and Tip1.In addition,SSBE increased the expression of BMP-7 and the ratio between MMP-2 and TIMP-2.Conclusion:SSBE treatment reduce TGF-β1-induced fibrosis-like reaction in renal tubular epithelial cells through inhibiting EMT and matrix accumulation.

Sedum sarmentosum Bunge Extract; TGF-β1; epithelial-to-mesenchymal transition; matrix accumulation

R730.52

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.04.003

2014-09-11

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LQ12H05001）；溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（Y20110028，Y20140023）。

楊嫆嫆（1961-），女，浙江樂(lè)清人，主管技師。

白永恒，主管技師，Email：greatsailor@163.com。