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(南華大學(xué)藥物藥理研究所，湖南 衡陽421001)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

Apelin-13促進骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖

李蘭芳，何璐，吳娣，伍樂樂，黃仕芳，陳臨溪

(南華大學(xué)藥物藥理研究所，湖南 衡陽421001)

目的探討apelin-13是否促進骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖。方法分離和培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，用不同濃度apelin-13(0.1 μmol/L、1.0 μmol/L和10.0 μmol/L)處理細(xì)胞24 h后，分別用流式細(xì)胞術(shù)和噻唑藍比色法(MTT)，觀察apelin-13對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果倒置顯微鏡下觀察到apelin-13促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，apelin-13刺激后處于S期和G2-M期的細(xì)胞數(shù)目顯著增加，G0-G1期的細(xì)胞數(shù)目顯著減少。進一步MTT結(jié)果表明，apelin-13處理后大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖顯著增加，并呈濃度依賴性。結(jié)論apelin-13能促進骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖。

apelin-13； APJ； 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 增殖

1993年O’Down等[1]首次發(fā)現(xiàn)7次α螺旋的跨膜區(qū)段組成的G蛋白偶聯(lián)受體APJ(apelin-angiotensin receptor-like，APJ)。1998年，Tatemoto等[2]從牛的胃蛋白提取并純化APJ的內(nèi)源性配體apelin。Apelin/APJ系統(tǒng)組織分布廣泛，生物學(xué)功能多樣。研究發(fā)現(xiàn)，Apelin具有舒張血管、降低血壓、增強心肌收縮力、調(diào)節(jié)下丘腦—垂體激素釋放、抑制抗利尿激素的釋放、調(diào)節(jié)攝食攝水以及抵抗艾滋病毒侵入細(xì)胞等多種生物學(xué)效應(yīng)。Apelin/APJ系統(tǒng)還參與糖尿病腎病、大血管并發(fā)癥、視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)展，是一種重要的生理調(diào)節(jié)肽。

Apelin/APJ系統(tǒng)具有促進細(xì)胞增殖的作用。Apelin在人的成骨細(xì)胞大量表達，可刺激成骨細(xì)胞的增殖。在鼠的胃上皮細(xì)胞含有大量Apelin，并證明在體外Apelin刺激胃上皮細(xì)胞的增殖。Apelin具有血管生成因子的作用，研究發(fā)現(xiàn)在視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中，Apelin-13和Apelin-36呈濃度依賴性促進細(xì)胞遷移、增殖和毛細(xì)血管形成。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)主要來源于骨髓組織，具有多向分化潛能，增殖迅速、可塑性、可移植性及自我更新能力強。在體外可被誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元樣細(xì)胞等，這正是其多向分化潛能特點的體現(xiàn)。文獻[3]報道apelin能夠參與多種細(xì)胞增殖的過程，但apelin是否能影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖尚不清楚，也未見相關(guān)報道。本文旨在探究apelin是否促進骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖。

1 材料與方法

1.1試劑與材料Sprague-Dawley(SD)大鼠購自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物部；Apelin-13多肽(057-19)購自美國Phoenix Biotech公司；培養(yǎng)基、血清、胰酶等均購自美國Gibco公司；MTT購自美國Sigma公司；GNP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；流式細(xì)胞儀(美國Becton Dickinson公司)；酶標(biāo)儀(美國Labsystem Dragon公司)。

1.2大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)將SD大鼠浸泡于75%醫(yī)用酒精中15 min，在無菌條件下切開大鼠組織，取股骨，去除表面軟組織，沖出骨髓，接種于培養(yǎng)瓶。用含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，37 ℃ 5%CO2培育箱中孵育培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)的原代細(xì)胞生長密度達到70%～ 80%以上后，棄去原培養(yǎng)液，用PBS洗2次，加入0.05%胰蛋白酶消化液，放置于 CO2培養(yǎng)箱中孵育 5 min；用巴式吸管吸取培養(yǎng)基反復(fù)吹打培養(yǎng)瓶壁，當(dāng)貼壁的細(xì)胞懸浮后，取懸浮液800 r/min離心8 min；棄去上清液，加入培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞重新懸浮時，分瓶進行傳代培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。

1.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期將細(xì)胞以1×106cells/L接種于六孔板，直到細(xì)胞生長至70%～80%狀態(tài)時，用含有0.1%胎牛血清胞培養(yǎng)24 h(細(xì)胞同步化)，然后分別加入不同濃度apelin-13繼續(xù)孵育24 h后用胰酶消化并收集細(xì)胞，PBS洗兩遍，棄上清，加入1 mL 70%預(yù)冷乙醇中，吹打均勻，4℃固定12 h。PBS洗滌去乙醇，1 000 r/min,5 min，洗兩遍。0.5 mL PBS重懸細(xì)胞，加入PI和 RNaseA至終濃度50 μg/mL，37℃ 溫浴30 min，上流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期。

1.2.3 MTT比色法測定細(xì)胞增殖 將細(xì)胞以1×106cells/L的濃度接種在96孔板中，直到細(xì)胞生長至70%～80%狀態(tài)時，再用含有0.1%胎牛血清胞培養(yǎng)24 h(細(xì)胞同步化)，然后分別加入不同濃度apelin-13繼續(xù)孵育24 h，每孔加入濃度為5 g/L的MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，然后吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO在37℃中孵育15 min以后將其震蕩混勻，再經(jīng)酶聯(lián)免疫檢測儀測定OD值(570 nm處的檢測波長)。

2 結(jié) 果

2.1倒置顯微鏡觀察apelin-13對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響分別采用不同濃度apelin-13(0.1 μmol/L、1.0 μmol/L和10.0 μmol/L)處理大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞24 h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞增殖，結(jié)果提示：apelin-13顯著促大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖(見圖1)。

圖1 不同濃度apelin-13對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響

2.1流式細(xì)胞術(shù)檢測apelin-13對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響表1表明，與對照組相比較，apelin-13刺激后處于S期和G2-M期的細(xì)胞數(shù)目顯著增加，G0-G1期的細(xì)胞數(shù)目顯著減少。apelin-13刺激后增殖指數(shù)(PI)顯著增加。提示： apelin-13顯著促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖。

2.2 MTT法觀察apelin-13對大鼠骨髓間基質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響圖2表明apelin-13(0.1 μmol/L、1.0 μmol/L和10.0 μmol/L)處理大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，呈濃度依賴性促進細(xì)胞的增殖，且在apelin-13濃度為1 μmol/L時，與對照組比較差異有顯著性，在apelin-13濃度為10 μmol/L時促增殖作用最顯著。

表1不同濃度apelin-13對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響(n=6)

組別G0～G1(%)S(%)G2～M(%)PI對照組94.60±0.252.80±0.122.60±0.360.054±0.0100.1μmol/LApelin組91.20±0.446.60±0.28a3.50±0.550.099±0.020a1.0μmol/LApelin組87.90±0.368.80±0.49b5.20±0.690.141±0.030b10.0μmol/LApelin組84.30±0.6211.90±2.37b6.90±0.820.182±0.060b

與對照組比較，a：P<0.05，b：P<0.01

圖2 apelin-13對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響(n=6) 1：對照組；2～4分別為0.1、1.0和10.0 μmol/L apelin組. 與對照組比較，*：P<0.05

3 討 論

血管緊張素受體樣受體APJ是一種孤兒G蛋白偶聯(lián)受體[1]。Apelin是APJ受體目前已知的唯一內(nèi)源性配體[2]。大量實驗表明，apelin促進血管平滑肌細(xì)胞、視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞、胃腺上皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞等增殖過程。這些線索提示apelin可能參與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能，具有快速增殖的能力，可以在體外可被誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞已在退行性及缺損性疾病、心血管疾病、肝移植、肺纖維化等疾病治療方面取得良好效果。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的植入物具有修復(fù)動物骨缺損的能力。將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外培養(yǎng),并貼附于生物材料上修復(fù)大鼠股骨干骨缺損也取得了好的效果。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在心梗后既能促進新血管的形成又有分化為心肌細(xì)胞的能力。

Apelin促進細(xì)胞增殖[4-5]，但apelin與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞關(guān)系尚不清楚，本實驗采用不同方法初步證明apelin-13促進骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖。分別給予apelin-13(0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L)處理細(xì)胞24 h后，用流式細(xì)胞術(shù)和MTT比色法檢測到apelin-13顯著促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，且在apelin-13濃度為1 μmol/L時，與對照組比較有顯著性差異，10 μmol/L時增殖最顯著。以上結(jié)果表明apelin-13呈濃度依賴性促骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有易獲得、易培養(yǎng)、低免疫原性、易于外源基因的轉(zhuǎn)入和表達等特性，且具有自我更新能力，并能迅速增殖，在組織器官移植中具有重要的應(yīng)用價值[6]。Apelin能促進骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，因此，高表達apelin的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或許能作為理想的種子細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于組織工程、細(xì)胞移植、基因治療及器官移植等領(lǐng)域。但apelin是如何影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，其分子機制還有待將來的進一步探討。

[1] O’Dowd BF，Heiber M，Chan A，et al.A human gene that shows identity with the gene encoding the angiotensin receptor is located on chromosome 11[J].Gene，1993，136(1-2)：355-360.

[2] Tatemoto K，Hosoya M，Habata Y，et al.Isolation and characterization of a novel endogenous peptide ligand for the human APJ receptor[J].Biochem Biophy Res Comm，1998，251(2)：471-476.

[3] Li F，Li L，Qin X，et al.Apelin-induced vascular smooth muscle cell proliferation:the regulation of cyclin D1[J].Front Biosc，2008,13(5)：3786-3792.

[4] Li L，Xie F.Jagged-1/Notch3 signaling transduction pathway is involved in apelin-13-induced vascular smooth muscle cells proliferation[J].Acta Bio Biophy Sin，2013，45(10)：875-881.

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Apelin-13PromotesRatBoneMarrowMesenchymalStemCellsProliferation

LI Lanfang,HE Lu,WU Di,et al

(InstituteofPharmacyandPharmacology,UniversityofSouthChina,Hengyang，Hunan421001,China)

ObjectiveApelin is the ligand of G-protein coupled receptor APJ.We aim to explore the effect of apelin-13 on the proliferation of rat bone marrow mesenchymal stem cells.MethodsRat bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and cultured,and treated by different concentrations of apelin-13(0.1 μmol/L，1.0 μmol/L，10.0 μmol/L) for 24 hours.Cell proliferation was observed by flow cytometry and 3-(4,5-Dimethy lth iazol-2 -yl)-2,5-diphen yltetrazolium bromide (MTT) assay.ResultsApelin-13 decreased the proportion of cells in G0/G1 phase while increasing the number of cells in S and G2-M phases.MTT results showed that apelin-13 can significantly stimulate the proliferation of rat BMSCs in a concentration-dependent manner.ConclusionWe determine that apelin-13 stimulates the proliferation of rat BMSCs.

apelin-13; APJ; BMSCs; proliferation

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.04.001

2014-07-31；

2014-11-22

國家自然科學(xué)基金(81270420)，湖南省自然科學(xué)基金(青年基金)(14JJ3102)資助.

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(此文編輯：朱雯霞)