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(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所，特殊病原體防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3.南華大學(xué)心血管疾病研究所)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

生殖支原體脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白通過(guò)c-Src/ROS/Nrf2途徑誘導(dǎo)胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)血紅素氧合酶

何璐1,2，游曉星2，李國(guó)華3，曾焱華2，李冉輝2，朱翠明2，余敏君2，陳忠東1*，吳移謀2

(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所，特殊病原體防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3.南華大學(xué)心血管疾病研究所)

目的探討生殖支原體脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白(LAMPs)誘導(dǎo)胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)血紅素氧合酶-1(HO-1)的分子機(jī)制。方法用0.5～5 μg/mL生殖支原體LAMPs處理體外培養(yǎng)的胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞4～12 h，采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot法分別檢測(cè)HO-1 mRNA和蛋白的表達(dá)以及核因子相關(guān)因子-2(Nrf2)的核轉(zhuǎn)位；比色法觀察HO-1的酶活性；2′,7′-二氯二氫熒光黃二乙酸酯(H2DCFDA)檢測(cè)活性氧產(chǎn)生。分別采用酪氨酸激酶c-Src抑制劑PP1、活性氧抑制劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)和Nrf2 siRNA干預(yù)，觀察HO-1的表達(dá)情況。結(jié)果生殖支原體LAMPs能誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞HO-1 mRNA和蛋白的表達(dá)，上調(diào)其酶活性。同時(shí)，LAMPs也能誘導(dǎo)其產(chǎn)生活性氧，并促使Nrf2核轉(zhuǎn)位。PP1和NAC預(yù)處理后，可明顯降低HO-1的表達(dá)水平以及細(xì)胞核內(nèi)Nrf2含量。采用Nrf2 siRNA轉(zhuǎn)染后，HO-1的表達(dá)顯著減少。結(jié)論生殖支原體LAMPs通過(guò)c-Src/ROS/Nrf2途徑誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)HO-1。

生殖支原體； 脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白； 血紅素氧合酶-1； 滋養(yǎng)層細(xì)胞

生殖支原體(Mycoplasma genitalium)是Tully等人從男性非淋球菌尿道炎患者體內(nèi)分離出來(lái)的一種病原體。它作為一種病原微生物的觀點(diǎn)已被人們接受。生殖支原體黏附至生殖道黏膜后，主要通過(guò)其細(xì)胞膜中的脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白(lipid-associated membrane proteins，LAMPs)發(fā)揮致炎作用，從而引起女性多種泌尿生殖系統(tǒng)疾病如盆腔炎、宮頸炎、不育(孕)癥，并參與胎膜早破、產(chǎn)褥感染和新生兒肺炎等不良妊娠的發(fā)生[1]。胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞是母體和胎兒進(jìn)行物質(zhì)交換的場(chǎng)所，同時(shí)也是母體固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分[2]。研究顯示，支原體感染后，可誘導(dǎo)胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)多種細(xì)胞因子和炎性相關(guān)介質(zhì)[3]。雖然支原體本身難以通過(guò)胎盤(pán)屏障，但是其感染導(dǎo)致細(xì)胞因子過(guò)度分泌，這對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞具有毒性作用，也是引起不良妊娠發(fā)生的重要因素[4]。因此對(duì)于母體而言，如何負(fù)調(diào)控這些細(xì)胞因子的過(guò)度分泌，是維持胎兒發(fā)育的關(guān)鍵。人工合成的支原體巨噬細(xì)胞活化脂肽-2可誘導(dǎo)人單核細(xì)胞表達(dá)血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)，從而抑制炎癥因子的過(guò)度分泌[5]。但對(duì)于生殖支原體感染后，胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞能否表達(dá)HO-1目前仍不清楚。本文旨在觀察生殖支原體LAMPs能否誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)HO-1，并探討其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料生殖支原體G37標(biāo)準(zhǔn)株購(gòu)自ATCC(ATCC?33530DTM)。小鼠抗人HO-1抗體、小鼠抗人核因子相關(guān)因子-2(nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2)抗體以及小鼠抗人TATA結(jié)合蛋白(TATA-binding protein，TBP)抗體購(gòu)自Santa Cruz；抗磷酸化c-Src(Tyr416)和抗總c-Src單克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling；酪氨酸激酶c-Src抑制劑PP1，N-乙酰-半胱氨酸(N-acetyl-cysteine，NAC)以及2′,7′-二氯二氫熒光黃二乙酸酯(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，H2DCFDA)購(gòu)自Sigma。HO-1活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海GENMED公司；細(xì)胞蛋白提取試劑盒、蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自Thermo公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑及新霉素(Normocin)購(gòu)自Invitrogen公司；蛋白酶抑制劑購(gòu)自Roche。用于分離滋養(yǎng)層細(xì)胞的胎盤(pán)絨毛組織來(lái)自2012年10月～2013年10月南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科所收治的患者(孕18～31周)。開(kāi)展研究前均與患者簽署知情同意書(shū)，研究?jī)?nèi)容和方法經(jīng)過(guò)南華大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1 生殖支原體培養(yǎng)與LAMPs提取 生殖支原體標(biāo)準(zhǔn)株用SP4培養(yǎng)基于950 mL/L CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)。當(dāng)菌液由玫瑰紅變?yōu)槌壬珪r(shí)，離心獲取菌體，根據(jù)參考文獻(xiàn)提供的方法提取LAMPs[6]。用5 mL Tris緩沖液(pH 8.0的50 mmol/L Tris、0.15 mol/L NaCl、1 mmol/L EDTA)重懸浮支原體沉淀，并加入終濃度為20 mL/L的Triton X-114，4 ℃靜置1 h，隨后37 ℃孵育30 min以促進(jìn)相分離。棄上層水相，加入等體積Tris緩沖液后重復(fù)上述相分離1次。第2次相分離結(jié)束后，棄水相，用Tris緩沖液恢復(fù)至初始體積，加入2.5倍體積無(wú)水乙醇-20 ℃以沉淀LAMPs。超聲處理后測(cè)定其濃度備用。

1.2.2 滋養(yǎng)層細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 按照參考文獻(xiàn)提供的方法分離鑒定滋養(yǎng)層細(xì)胞[7]。細(xì)胞用含100 mL/L胎牛血清以及50 mg/mL新霉素(Normocin)的M199培養(yǎng)基，于37 ℃、50 mL/L CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前將2×105個(gè)細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中培養(yǎng)48 h，隨后用0.5～5 μg/mL LAMPs作用細(xì)胞4～12 h(視不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?[6]。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)HO-1 mRNA的表達(dá) 細(xì)胞處理完畢后，用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，并取3 μg的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，將獲得的cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。本文所用引物如下。HO-1上游引物為5′- ATGGCCTCCCTGTACCACATC-3′，HO-1下游引物為 5′-TGTTGCGCTCAATCTCCTCCT-3′;β-actin上游引物為5′-CATCCTGCGTCTGGACCTGG-3′，β-actin下游引物為：5′-TAATGTCACGCACGATTTCC-3′，在LightCycler96定量PCR儀(Roche)上按以下程序擴(kuò)增：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，58 ℃ 1 min共40個(gè)循環(huán)。PCR結(jié)束后計(jì)算各處理組中HO-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算公式：2-ΔΔCt，ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組(CtHO-1-Ctβ-actin)-對(duì)照組(CtHO-1-Ctβ-actin)。

1.2.4 HO-1酶活性檢測(cè) 處理后的細(xì)胞加入1.5 mL的試劑A 漂洗細(xì)胞，隨后加入100 μL裂解液B充分混勻，超聲裂解細(xì)胞后于4 ℃，10 000 r/min離心15 min，獲取20 μL上清置于另一新的EP 管中，分別加入340 μL 緩沖液C、20 μL反應(yīng)液D、20 μL 底物，混勻，37 ℃溫育60 min 。最后加入400 μL終止液終止反應(yīng)。1 000 rpm 離心5 min。取100 μL綠色相，測(cè)量其在464 nm 和530 nm波長(zhǎng)的吸光度，并根據(jù)待測(cè)樣品的蛋白濃度計(jì)算出HO-1 的活性，單位以每小時(shí)單位蛋白(mg)中膽紅素濃度(nmol/L)表示。

1.2.5 Western blot法檢測(cè)HO-1表達(dá)及Nrf2核轉(zhuǎn)位 滋養(yǎng)層細(xì)胞經(jīng)LAMPs處理后，用預(yù)冷PBS漂洗2次，隨后加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液充分裂解細(xì)胞，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min。細(xì)胞漿和細(xì)胞核蛋白提取試劑盒嚴(yán)格根據(jù)廠家說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將獲取的蛋白經(jīng)10%～12%的SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜，放入5%脫脂奶粉中封閉1 h；洗滌后，加入小鼠抗人HO-1或Nrf2抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜；多次洗滌后，加入辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗孵育1 h。ECL法發(fā)光、顯影。

1.2.6 活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測(cè) 以H2DCFDA為熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。其原理是不發(fā)熒光的H2DCFDA進(jìn)入細(xì)胞后能被過(guò)氧化物、氫過(guò)氧化物等氧化分解為二氯熒光黃而產(chǎn)生熒光。孵育結(jié)束后，向各管中加入終濃度5 μmol/L的H2DCFDA染液，37 ℃避光孵育30 min。PBS洗細(xì)胞3次，重懸細(xì)胞，SynergyHT熒光分光光度計(jì)(Bio-Tec)檢測(cè)細(xì)胞懸液熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm)。

1.2.7 Nrf2的siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 將滋養(yǎng)層細(xì)胞接種于1.5 mL無(wú)血清的培養(yǎng)基的6孔板中，放入培養(yǎng)箱中備用。按LipofectamineTM 2000說(shuō)明書(shū)配制A、B液并充分混合，靜置20 min后加入6孔板中，按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求，使siRNA終濃度達(dá)100 nmol/L，轉(zhuǎn)染4 h后換上完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

2 結(jié) 果

2.1生殖支原體LAMPs誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)HO-1 mRNA和蛋白在正常情況下，滋養(yǎng)層細(xì)胞中HO-1mRNA表達(dá)水平很低。用0.5 μg/mL LAMPs處理滋養(yǎng)層細(xì)胞12 h后，可明顯誘導(dǎo)HO-1 mRNA表達(dá)，隨著LAMPs濃度的增加，HO-1mRNA表達(dá)水平也逐漸升高(圖1A)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示HO-1蛋白表達(dá)水平與mRNA的變化一致(圖1B)。

圖1 生殖支原體LAMPs對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞HO-1表達(dá)的影響A：生殖支原體LAMPs誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)HO-1 mRNA.與對(duì)照組(0 μg/mL)相比，*P<0.05，**P<0.01；B：生殖支原體LAMPs誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)HO-1蛋白

2.2生殖支原體LAMPs上調(diào)滋養(yǎng)層細(xì)胞HO-1酶活性在正常情況下，滋養(yǎng)層細(xì)胞中HO-1酶活性水平很低。采用0.5 μg/mL LAMPs處理滋養(yǎng)層細(xì)胞12 h后，HO-1酶活性明顯增加，隨著LAMPs濃度的增高，HO-1酶活性也隨著之增強(qiáng)(圖2)，作用趨勢(shì)與HO-1的表達(dá)趨勢(shì)相似。

圖2 生殖支原體LAMPs對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞HO-1酶活性的影響 與對(duì)照組(0 μg/mL)相比，*P<0.05

2.3酪氨酸激酶c-Src參與調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞HO-1的表達(dá)采用5 μg/mL的LAMPs處理滋養(yǎng)層細(xì)胞3 min后，即可誘導(dǎo)酪氨酸激酶c-Src的磷酸化，隨著LAMPs處理時(shí)間的延長(zhǎng)，c-Src的磷酸化水平增加，處理10 min后c-Src的磷酸化水平反而降低(圖3A)。而使用10～30 μmol/L酪氨酸激酶c-Src抑制劑PP1預(yù)處理滋養(yǎng)層細(xì)胞1 h后，HO-1表達(dá)水平明顯降低(圖3B),PP1可以明顯抑制HO-1的表達(dá)。

圖3 酪氨酸激酶c-Src在生殖支原體LAMPs誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞HO-1表達(dá)中的作用 A：生殖支原體LAMPs誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞c-Src的磷酸化；B： PP1拮抗生殖支原體LAMPs誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞HO-1的表達(dá)

2.4生殖支原體LAMPs誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)HO-1與ROS的產(chǎn)生有關(guān)在正常情況下，滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)有少量的ROS存在。生殖支原體LAMPs能明顯促使滋養(yǎng)層細(xì)胞生成ROS，隨著LAMPs的濃度增加，ROS的生成增多，而采用30 μmol/L PP1預(yù)處理滋養(yǎng)層細(xì)胞1 h后，ROS的生成顯著降低(圖4A)。生殖支原體LAMPs能顯著誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)HO-1，而采用不同濃度的ROS抑制劑NAC預(yù)處理滋養(yǎng)層細(xì)胞4 h后，HO-1表達(dá)降低，NAC能拮抗LAMPs對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞HO-1表達(dá)的誘導(dǎo)作用(圖4B)。

2.5生殖支原體LAMPs誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞Nrf2核轉(zhuǎn)位在正常情況下，Nrf2可分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，但主要存在細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)用5 μg/mL LAMPs處理滋養(yǎng)層細(xì)胞1～2 h后，細(xì)胞核中Nrf2含量逐漸增多，且胞質(zhì)中Nrf2含量隨之降低，而核蛋白內(nèi)參TBP的含量保持恒定。而預(yù)先用ROS抑制劑NAC孵育后，LAMPs誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞Nrf2核轉(zhuǎn)位的作用被明顯抑制(圖5)。

2.6 Nrf2參與調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞HO-1的表達(dá)在正常情況下，滋養(yǎng)層細(xì)胞中HO-1表達(dá)水平很低。5 μg/mL LAMPs能明顯誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞HO-1的表達(dá)。而采用特異性siRNA干擾Nrf2表達(dá)后(圖6A)，再用5 μg/mL LAMPs處理滋養(yǎng)層細(xì)胞12 h，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，HO-1的表達(dá)量明顯降低(圖6B)。

圖4 ROS在生殖支原體LAMPs誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)HO-1中的作用 A：生殖支原體LAMPs誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞產(chǎn)生ROS.與對(duì)照組(0μg/mL LAMPs)相比，*P<0.05，#P<0.05；B：NAC拮抗生殖支原體LAMPs誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)HO-1

圖5 生殖支原體LAMPs對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞Nrf2核轉(zhuǎn)位的影響

圖6 沉默Nrf2表達(dá)對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞HO-1表達(dá)的影響 A：Nrf2 siRNA干擾效果；B：siRNA干擾沉默Nrf2表達(dá)后下調(diào)滋養(yǎng)層細(xì)胞HO-1的表達(dá)

3 討 論

LAMPs是生殖支原體重要的致炎物質(zhì)，可誘導(dǎo)胎盤(pán)組織分泌多種炎性相關(guān)介質(zhì)從而參與局部炎癥反應(yīng)[9]。因此對(duì)于母體而言，支原體感染后必然存在某種負(fù)性調(diào)控機(jī)制以抑制過(guò)度的炎癥反應(yīng)，從而維持胎兒的正常發(fā)育[9]。HO-1是催化血紅素降解為膽紅素、一氧化碳和Fe2+的限速酶。HO-1除了其固有的降解血紅素活性外，對(duì)炎癥反應(yīng)也具有一定的調(diào)控作用[10]。本文LAMPs可顯著誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞HO-1 mRNA和蛋白的表達(dá)，并上調(diào)其酶活性，而酪氨酸激酶c-Src抑制劑PP1明顯抑制HO-1的表達(dá)。HO-1的表達(dá)增加被認(rèn)為是宿主細(xì)胞免受免疫病理?yè)p傷或應(yīng)激損傷的一種適應(yīng)性保護(hù)機(jī)制。由于血紅素是重要的促炎物質(zhì)，HO-1促進(jìn)血紅素的降解無(wú)疑是其調(diào)控細(xì)胞因子分泌的重要機(jī)制。此外，HO-1催化血紅素降解產(chǎn)物膽紅素、一氧化碳和Fe2+對(duì)炎癥介質(zhì)的表達(dá)也具有一定程度的抑制作用。

本文同時(shí)也顯示LAMPs可顯著誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生。ROS雖然有利于清除病原體，但其過(guò)度生成對(duì)宿主細(xì)胞DNA和蛋白具有毒性作用。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，ROS可反饋性激活Nrf2核轉(zhuǎn)錄因子，從而誘導(dǎo)HO-1等多種抗氧化相關(guān)蛋白的表達(dá)[11]。生理?xiàng)l件下Nrf2定位于細(xì)胞質(zhì)中，在各種外源性刺激作用后，如感染，可引起細(xì)胞內(nèi)ROS增多，隨后誘導(dǎo)Nrf2轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，與靶基因啟動(dòng)子結(jié)合從而啟動(dòng)其表達(dá)，參與調(diào)控細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激損傷以及炎癥反應(yīng)[12]。LAMPs處理養(yǎng)層細(xì)胞60 min后，可顯著增加細(xì)胞核內(nèi)Nrf2含量，并持續(xù)至2 h以上。這表明LAMPs可激活滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)Nrf2。為了研究Nrf2的激活是否受ROS調(diào)控，本實(shí)驗(yàn)采用ROS清除劑NAC處理滋養(yǎng)層細(xì)胞后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LAMPs誘導(dǎo)Nrf2核轉(zhuǎn)位的作用受到明顯抑制。同時(shí)，NAC也可抑制HO-1的表達(dá)，沉默Nrf2基因后，HO-1表達(dá)幾乎消失。以上結(jié)果表明LAMPs可能通過(guò)ROS/Nrf2途徑誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)HO-1。但ROS激活Nrf2的機(jī)制目前仍不完全清楚，可能機(jī)制是當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ROS濃度增高時(shí)，可促使Nrf2的抑制蛋白Keap1與其解離，從而使其轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，隨后Nrf2結(jié)合至靶基因的抗氧化反應(yīng)元件，啟動(dòng)下游保護(hù)性基因的轉(zhuǎn)錄。

總之，本研究證實(shí)生殖支原體LAMPs通過(guò)c-Src/ROS/Nrf2途徑上調(diào)滋養(yǎng)層細(xì)胞HO-1的表達(dá)。HO-1可能通過(guò)多種途徑調(diào)控炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子的產(chǎn)生，最終反饋性調(diào)控炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度，這可能是機(jī)體一種獲得性的自我保護(hù)機(jī)制。

[1] Mobley VL,Hobbs MM,Lau K,et al.Mycoplasma genitalium infection in women attending a sexually transmitted infection clinic:diagnostic specimen type,coinfections,and predictors[J].Sex Transm Dis,2012,39(9):706-709.

[2] 王專(zhuān)家,張宇飛,劉淑英.綿羊多核絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2014,30(1):82-86.

[3] Mitsunari M,Yoshida S,Shoji T,et al.Macrophage-activating lipopeptide-2 induces cyclooxygenase-2 and prostaglandin E(2) via toll-like receptor 2 in human placental trophoblast cells[J].J Reprod Immunol,2006,72(1-2):46-59.

[4] Griesinger G,Saleh L,Bauer S,et al.Production of pro- and anti-inflammatory cytokines of human placental trophoblasts in response to pathogenic bacteria[J].J Soc Gynecol Investig,2001,8(6):334-340.

[5] 馬小華，游曉星，曾焱華，等.支原體巨噬細(xì)胞活化脂肽2經(jīng)MAPKs和Nrf2途徑誘導(dǎo)人單核細(xì)胞血紅素氧合酶-1產(chǎn)生[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2014,34(4):289-293.

[6] He J,You X,Zeng Y,et al.Mycoplasma genitalium-derived lipid-associated membrane proteins activate NF-kappaB through toll-like receptors 1,2,and 6 and CD14 in a MyD88-dependent pathway[J].Clin Vaccine Immunol,2009,16(12):1750-1757.

[7] Kahlo K,Fill MS,Ignatov T,et al.HO-1 as modulator of the innate immune response in pregnancy[J].Am J Reprod Immunol,2013,70(1):24-30.

[8] Jalali BM,Kitewska A,Wasielak M,et al.Effects of seminal plasma and the presence of a conceptus on regulation of lymphocyte-cytokine network in porcine endometrium[J].Mol Reprod Dev,2014,81(3):270-281.

[9] Sun Q,Chen X,Yu J,et al.Immune modulatory function of abundant immune-related microRNAs in microvesicles from bovine colostrum[J].Protein Cell,2013,4(3):197-210.

[10] Byun SJ,Son Y,Pae HO.Cytoprotective effect of beta-lapachone by inducing heme oxygenase-1 expression and AMP-activated protein kinase activation in human endothelial cells[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2014,18(7):949-958.

[11] Cuadrado A,Martin-Moldes Z,Ye J,et al.Transcription factors NRF2 and NF-kappaB are coordinated effectors of the Rho family,GTP-binding protein RAC1 during inflammation[J].J Biol Chem,2014,289(22):15244-15258.

[12] Lee IC,Kim SH,Baek HS,et al.The involvement of Nrf2 in the protective effects of diallyl disulfide on carbon tetrachloride-induced hepatic oxidative damage and inflammatory response in rats[J].Food Chem Toxicol,2014,63:174-185.

MycoplasmaGenitalium-derivedLipid-associatedMembraneProteinsInducesPlacentalTrophoblastCellsExpressionofHO-1viaROS/Nrf2

HE Lu,YOU Xiaoxing,LI Guohua,et al

(DepartmentsofGynecology&Obstetrics,theFirstAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo investigate the mechanism of the expression of heme oxygenase-1 (HO-1) in response to Mycoplasma genitalium-derived lipid-associated membrane proteins (LAMPs) in placental trophoblast cells.MethodsPlacental trophoblast cells were cultured in vitro and stimulated by 0.5～5 μg/mL of LAMPs for 4～12h,expression of HO-1 mRNA and protein,and nuclear translocation of nuclear factor erythroid-2 related factor 2 (Nrf2) were detected by real-time PCR and Western blot,respectively.The enzyme activity of HO-1 was detected by colorimetric method.The intracellular formation of reactive oxygen species (ROS) was detected by using the fluorescent probe H2DCFDA.Tyrosine kinase c-Src inhibitor PP1,N-acetyl-cysteine (NAC) and Nrf2 siRNA were used to analyse the function of ROS and Nrf2 in mediating of HO-1 expression.ResultsM.genitalium LAMPs enhanced the expression of HO-1 at mRNA and protein levels as well as the enzyme activity of HO-1 in placental trophoblast cells in a concentration-dependent manner.In the meantime,LAMPs also induced placental trophoblast cells accumulation of ROS and nuclear translocation of Nrf2.PP1 and NAC treatment could inhibit LAMPs-induced HO-1 expression and Nrf2 nuclear translocation,and transfection of Nrf2 siRNA significantly abrogate HO-1 expression.ConclusionM.genitalium LAMPs induced placental trophoblast cells expression of HO-1 through c-Src/ROS/Nrf2 pathways.

mycoplasma genitalium; lipid-associated membrane proteins; heme oxygenase-1; placental trophoblast cells

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.04.002

2015-04-24；

2015-06-07

國(guó)家自然科學(xué)基金(31000091，81072418)；特殊病原體防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目(湘科計(jì)字[2014]5號(hào)，湘教通〔2012〕312號(hào)).

*通訊作者，E-mail：21615930@qq.com.

R518.9,R392-33,R711.32

A

(此文編輯：蔣湘蓮)