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(1.南華大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 衡陽 421001；2.桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院核醫(yī)學科；3.衡陽市中心醫(yī)院急診科；4.南華大學附屬第二醫(yī)院泌尿外科)

·基礎(chǔ)醫(yī)學·

鐵皮石斛多糖對MPP+誘導的PC12細胞損傷的抑制作用

董昕1，廖慧穎1，陸素青2，李國術(shù)3，符婉1，潘思1，張濤4*

(1.南華大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 衡陽 421001；2.桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院核醫(yī)學科；3.衡陽市中心醫(yī)院急診科；4.南華大學附屬第二醫(yī)院泌尿外科)

目的觀察鐵皮石斛多糖對1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)所致PC12細胞損傷的抑制作用及可能機制。方法實驗分為對照組、MPP+損傷模型組、鐵皮石斛多糖組(50、100、200和400 μg/mL)。MPP+損傷模型組細胞用含10 μmol/L MPP+的培養(yǎng)基處理細胞24 h；鐵皮石斛多糖組細胞用含50、100、200和400 μg/mL鐵皮石斛多糖的培養(yǎng)基預(yù)處理2 h后，再加入MPP+(10 μmol/L)處理細胞24 h；對照組細胞給予等量生理鹽水處理。MTT比色法檢測細胞存活率，檢測細胞內(nèi)丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。結(jié)果與對照組比較，MPP+處理顯著降低了PC12細胞的存活率，顯著升高了細胞培養(yǎng)液中LDH的水平和細胞中MDA的含量，顯著降低了細胞中SOD的活性(均P<0.05)；與損傷模型組比較，200和400 μg/mL鐵皮石斛多糖組PC12細胞的存活率顯著升高，細胞培養(yǎng)液中LDH的活性和細胞中MDA的含量顯著升高，細胞中SOD的活性顯著降低(均P<0.05)。結(jié)論鐵皮石斛多糖抑制了MPP+誘導的PC12細胞損傷，其機制可能與鐵皮石斛多糖抑制氧化應(yīng)激有關(guān)。

鐵皮石斛； 神經(jīng)保護作用； 氧化應(yīng)激； PC12細胞

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一種好發(fā)于中老年人的神經(jīng)退行性疾病，其主要臨床癥狀包括運動遲緩、姿勢步態(tài)異常、肌強直和靜止性震顫等[1]。PD的主要病理特征為中腦黑質(zhì)致密部的多巴胺神經(jīng)元的變性死亡[2]。采用1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+)制備擬PD細胞模型是目前常用的方法，因為MPP+毒性對多巴胺神經(jīng)元具有較強的選擇性[3]。

鐵皮石斛(dendrobium candidum,DC)是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，具有滋陰補腎、健脾養(yǎng)胃和潤肺生津等功效，可用于糖尿病和慢性萎縮性胃炎等的治療[4]。研究表明鐵皮石斛能通過調(diào)節(jié)胰島α和β細胞激素的分泌而發(fā)揮降血糖作用，可提高糖尿病小鼠的葡萄糖耐量水平，還具有血管內(nèi)皮細胞保護作用和肝臟保護作用[5-6]。但是鐵皮石斛對神經(jīng)損傷是否具有抑制作用以及作用機制尚不清楚。因此本文擬觀察鐵皮石斛對MPP+所致神經(jīng)細胞損傷的抑制作用及可能的機制。

1 材料與方法

1.1材料鐵皮石斛多糖由珍貴瀕危藥材湖南省工程研究中心提供；胎牛血清和DMEM高糖培養(yǎng)基購自Introgen公司；1-甲基-4-苯基吡啶離子、青霉素和鏈霉素購自Sigma公司；噻唑藍(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)為南京建成生物工程公司產(chǎn)品。

1.2細胞培養(yǎng)和分組高分化的PC12細胞購自中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫。細胞采用含10%滅活胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，細胞置于37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，每兩天換液一次，每四天傳代一次。實驗分對照組，損傷模型組，鐵皮石斛多糖組(50、100、200和400 μg/mL)。損傷模型組細胞用含10 μmol/L MPP+的培養(yǎng)基處理細胞24 h；鐵皮石斛多糖組，根據(jù)預(yù)實驗的結(jié)果預(yù)處理2 h作用效果最好，因此細胞先用含50、100、200和400 μg/mL鐵皮石斛多糖的培養(yǎng)基預(yù)處理2 h后，再加入MPP+(10 μmol/L)處理細胞24 h；對照組細胞給予等量生理鹽水處理。

1.3 MTT法細胞活力的檢測用胰酶消化后將PC12細胞制成細胞懸液，計數(shù)細胞密度，以1×104個細胞/孔接種到96孔培養(yǎng)板內(nèi)。將細胞置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在實驗結(jié)束前4 h每孔加入100 μL MTT，使MTT的終濃度為0.5 mg /mL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸去培養(yǎng)液。每孔加入100 μL DMSO，振蕩10 min，待結(jié)晶完全溶解后，在Bio-Rad550酶標儀上測定570 nm波長的吸光度值(OD值)。計算各組PC12細胞的存活率，每組設(shè)3個重復孔。

1.4 LDH活性的測定各組實驗結(jié)束后，分別收集每組細胞培養(yǎng)液的上清液，測量各組細胞上清液中LDH活性，操作按LDH試劑盒說明書的要求進行。用酶標儀測定波長為450 nm的吸光度，每組設(shè)3個重復孔。

1.5 MDA和SOD水平的測定各組實驗結(jié)束后，分別收集每組細胞，制備細胞勻漿，按試劑盒說明操作分別檢測細胞中MDA水平和SOD的活性。BCA法測定細胞培養(yǎng)液上清中蛋白濃度，MDA的水平以每克細胞蛋白所含MDA的μmol數(shù)(μmol/gpr)表示；SOD的活性以每100 mg細胞蛋白所含SOD活性的U數(shù)(U/100 mgpr)表示。

2 結(jié) 果

2.1 MPP+和鐵皮石斛多糖對PC12細胞存活率的影響采用MTT比色法檢測PC12細胞活力，結(jié)果如圖1所示：與對照組比較，MPP+處理PC12細胞的存活率顯著降低(P<0.05)；與損傷模型組比較，200和400 μg/mL鐵皮石斛多糖組PC12細胞的存活率均升高(均P<0.05)。50和100 μg/mL鐵皮石斛多糖組PC12細胞的存活率與損傷模型組比較雖有升高，但差異無顯著性(均P>0.05)。

圖1 MPP+和鐵皮石斛多糖對PC12細胞存活率的影響與對照組比較，*P<0.05；與損傷模型組比較，#P<0.05

2.2鐵皮石斛多糖對MPP+誘導的PC12細胞培養(yǎng)液中LDH活性的影響圖2所示：與對照組比較，MPP+誘導的PC12細胞培養(yǎng)液中LDH活性顯著性升高(P<0.05)。與損傷模型組相比，200和400 μg/mL鐵皮石斛多糖組，細胞培養(yǎng)液中LDH活性顯著性降低(P<0.05)。50和100 μg/mL鐵皮石斛多糖組細胞培養(yǎng)液中LDH活性與損傷模型組比較雖有降低，但差異無顯著性(均P>0.05)。

圖2 鐵皮石斛多糖對MPP+誘導的PC12細胞培養(yǎng)液中LDH活性的影響 與對照組比較，*P<0.05；與損傷模型組比較，#P<0.05

2.3鐵皮石斛多糖對MPP+誘導的PC12細胞中MDA和SOD水平的影響表1所示：與對照組比較，MPP+誘導的PC12細胞中MDA的含量顯著升高，而SOD活性顯著下降(均P<0.05)。與損傷模型組相比，200和400 μg/mL鐵皮石斛多糖組細胞中MDA的含量顯著降低，而SOD活性顯著增加(均P<0.05)。但50和100 μg/mL鐵皮石斛多糖組細胞中MDA水平和SOD活性與損傷模型組比較差異無顯著性(均P>0.05)。

組別MDA(μmol/gpr)SOD(U/100mgpr)對照組45.64±7.82328.75±42.78損傷模型組134.71±12.45a85.72±10.15a鐵皮石斛多糖(50μg/mL)128.25±9.0491.26±11.92鐵皮石斛多糖(100μg/mL)117.86±11.38105.55±15.78鐵皮石斛多糖(200μg/mL)91.34±7.25b186.24±18.33b鐵皮石斛多糖(400μg/mL)52.17±6.89b276.91±23.69b

與對照組比較，a：P<0.05；與損傷模型組比較，b：P<0.05

3 討 論

目前的研究認為黑質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)元的變性是PD的核心病理變化。如何防止多巴胺能神經(jīng)元的變性和損傷從而延緩甚至逆轉(zhuǎn)PD的進程，已成為國內(nèi)外有關(guān)PD治療的研究重點和熱點。由于MPP+毒性對多巴胺能神經(jīng)元具有較強的選擇性，因此是制備PD模型的經(jīng)典藥物。MPP+可通過干擾呼吸鏈引起線粒體功能障礙，還可導致氧化應(yīng)激和激活caspase和蛋白激酶C影響快速軸漿運輸并導致神經(jīng)元突觸功能失常，產(chǎn)生逆向性死亡的病理過程[7-8]。氧化應(yīng)激在黑質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)元的變性中發(fā)揮著重要的作用[9]，因此抑制氧化應(yīng)激是保護多巴胺能神經(jīng)元的重要途徑。

石斛可分為黃草、金釵、馬鞭等數(shù)十種，鐵皮石斛為石斛中的極品，它因表皮呈現(xiàn)鐵綠色而得名。鐵皮石斛是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，為多年生蘭科附生草本植物。主要生于海拔達1 600米的山地半陰濕的巖石上，喜溫暖濕潤氣候和半陰半陽的環(huán)境，不耐寒。一般均能耐-5 ℃的低溫。鐵皮石斛具有獨特的藥用價值，以其莖入藥，屬補益藥中的補陰藥。從藥理學和植物化學成分分析表明鐵皮石斛中主要的生物活性物質(zhì)是多糖類化合物，且含量較高。據(jù)《中藥志》記載鐵皮石斛多糖具有“養(yǎng)陰益胃和生津止渴”的功效，在許多治療糖尿病的中藥方劑中也有大量采用鐵皮石斛[10-11]。現(xiàn)代藥理研究表明鐵皮石斛多糖有提高機體抵抗力和免疫力、抗腫瘤和防治白內(nèi)障等功能[12-13]。研究顯示石斛類多糖具有抑制胰島細胞凋亡和壞死，保護胰島細胞而起到預(yù)防治療糖尿病，并具有抵抗鈣超載，抑制視網(wǎng)膜細胞凋亡的作用[14]。鐵皮石斛多糖還具有血管內(nèi)皮細胞保護作用和肝臟保護作用[6,15]。

本文結(jié)果顯示鐵皮石斛顯著抑制了MPP+誘導的PC12細胞的損傷，表現(xiàn)為顯著增加了PC12細胞的存活率和顯著降低了細胞培養(yǎng)液中LDH的水平。鐵皮石斛也顯著抑制了MPP+誘導的PC12細胞中的氧化應(yīng)激，表現(xiàn)為顯著降低了細胞中MDA的含量和顯著增加了細胞中SOD的活性。這些結(jié)果表明鐵皮石斛對神經(jīng)細胞的損傷具有抑制作用，其神經(jīng)保護的機制可能是通過抑制氧化應(yīng)激。

總之，鐵皮石斛多糖對MPP+誘導的神經(jīng)細胞的損傷具有抑制作用，其機制可能與鐵皮石斛多糖的抗氧化作用有關(guān)。本文結(jié)果為延緩或逆轉(zhuǎn)PD疾病進程開辟了新途徑。

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InhibitoryEffectofPolysaccharidesfromCandidumDendrobiumontheInjuryInducedby1-methyl-4-phenylpyridiniuminPC12Cells

DONG Xin,LIAO Huiying,LU Suqin,et al

(DepartmentofInternalNeurology,theFirstAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of polysaccharides from candidum dendrobium on the injury induced by 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+) in PC12 cells.MethodsThe PC12 cells were divided into control,injury model and polysaccharides from candidum dendrobium (50,100,200 and 400 μg/mL) group.The cells were incubated with 10 μmol/L MPP+for 24 h to induce the injury in injury model group.After the cells were pretreated with polysaccharides from candidum dendrobium (50,100,200 and 400 μg/mL) for 2 hours,cells were incubated with 10 μmol/L MPP+for 24 h in polysaccharides from candidum dendrobium group.The cells were incubated with the same volume of saline in control group.MTT assay was used to detect the survival rate of cells.The level of lactate dehydrogenase (LDH) in the medium,the level of malondialdehyde (MDA) in the cells and the activity of superoxide dismutase (SOD) in the cells were measured.ResultsCompared with the control group,the survival rate of cells was singificantly decreased,the level of LDH in the medium and MDA in the cells were singificantly increased,the activity of SOD in the cells was singificantly decreased in the injury model group.Compared with the injury model group,the survival rate of cells was singificantly increased,the level of LDH in the medium and MDA in the cells were singificantly decreased,the activity of SOD in the cells was singificantly increased in the polysaccharides from candidum dendrobium (200 and 400 μg/mL) group.Conclusion

Polysaccharides from candidum dendrobium inhibits the injury induced by MPP+in PC12 cells,of which the mechanism may be related to the inhibition of oxidative stress induced by polysaccharides from candidum dendrobium.

candidum dendrobium; neuroprotective effect; oxidative stress; PC12 cells

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.04.005

2014-12-02；

2015-04-15

衡陽市科技局課題(2012KJ22).

*通訊作者，E-mail：17490587@qq.com.

R741.05

A

(此文編輯：蔣湘蓮)