周念，戴怡雪，丁玲玲，胡書月，李繼祥

（西南大學(xué)榮昌校區(qū)，重慶榮昌 402460）

鴨坦布蘇病毒SC2013株的分離鑒定

周念，戴怡雪，丁玲玲，胡書月，李繼祥*

（西南大學(xué)榮昌校區(qū)，重慶榮昌 402460）

利用RT-PCR從疑似鴨坦布蘇病毒感染的致死產(chǎn)蛋鴨的肝、脾和卵泡膜等組織中擴增出鴨坦布蘇病毒E基因，并利用10日齡鴨胚分離出病毒SC2013株。該毒株對氯仿和胰蛋白酶敏感，不凝集雞紅細(xì)胞；E基因核苷酸序列與坦布蘇病毒GX2013G（GenBank:KM275941.1）的相似性在99%以上；對10日齡鴨胚的半數(shù)致死量為10-4.59/0.2mL，人工接種能引起2日齡雛鴨發(fā)病死亡并呈現(xiàn)典型的臨床癥狀與病理變化。以上結(jié)果表明，分離病毒SC2013株為致病性的鴨坦布蘇病毒，在今后養(yǎng)鴨業(yè)中除注重鴨坦布蘇病毒對產(chǎn)蛋鴨的危害外，也應(yīng)加強防止幼齡鴨感染。

坦布蘇病毒；RT-PCR檢測；病毒分離

坦布蘇病毒（Tembusu virus,TMUV）屬于黃病毒科(Flavivirus)的成員，是經(jīng)蜱、蚊等媒介傳播的蟲媒病毒，最先于1955年從馬來西亞吉隆坡地區(qū)的伊蚊體內(nèi)分離得到，后來在其它地區(qū)的庫蚊中也分離到該病毒（Platt et al，1975）。自2010年以來，我國東南主要養(yǎng)鴨地區(qū)，包括浙江、福建、廣東、江蘇和山東等，出現(xiàn)一種以產(chǎn)蛋鴨產(chǎn)蛋急劇下降，食欲驟減，卵巢出血、變性和壞死為主要特征的傳染病。通過流行病學(xué)調(diào)查、病原分離、動物回歸試驗、病理學(xué)研究和病毒全基因組測序，確診該病由一種新的黃病毒引起，并參照病毒分離地將其命名為BYD病毒，疾病命名為鴨產(chǎn)蛋下降綜合征[1]。在我國水禽業(yè)，該病主要發(fā)生于種鴨的產(chǎn)蛋期，但抗體檢測結(jié)果顯示各個日齡鴨均可感染，在臨床上出現(xiàn)4周齡櫻桃谷鴨和40日齡金定麻鴨感染發(fā)病的報道。2011年中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會第一屆水禽疫病防控研討會正式將該病名統(tǒng)一為“鴨坦布蘇病毒病”，該病病原為一種新型黃病毒即鴨坦布蘇病毒（Duck Tembusu virus，DTMUV）。2013年11月，四川北部地區(qū)某蛋鴨養(yǎng)殖場的160日齡產(chǎn)蛋麻鴨，疑似感染了鴨坦布蘇病毒，本文就該病毒的分離鑒定及特性測定的結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 病料采集與處理

2013年11月四川某養(yǎng)鴨場160日齡產(chǎn)蛋麻鴨發(fā)??；臨床表現(xiàn)為采食量和產(chǎn)蛋量急劇下降，在發(fā)病3d內(nèi)采食量下降90%、產(chǎn)蛋率從92%降至10%左右、發(fā)病率幾乎100%、死亡率10%左右；病死鴨的主要病變?yōu)楦文[大、質(zhì)脆，卵泡充血、出血、變性和壞死，脾腫大。無菌采集病死鴨的腦、肝、脾及卵泡膜，混合勻漿后按1∶5（W/V）加入0.01M pH7.2 PBS，反復(fù)凍融3次，14 000rpm離心5min，上清液用于病毒檢測與分離。

1.2 鴨坦布蘇病毒的RT-PCR檢測

病毒RNA的提取按試劑盒（病毒DNA/RNA提取試劑盒，購自大連TaKaRa公司）說明書進行。按文獻[2]報道的序列由上海生工合成引物Fla-1（GCCACGGAATTAGCGGTTGT）和Fla-2（TAATCCTCCATCTCAGCGGTGTAG）以擴增鴨坦布蘇病毒E基因約400bp片段。反轉(zhuǎn)錄（RT）以6個堿基隨機引物按反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Reverse Trancriptase M-MLV，購自大連TaKaRa公司）的說明書進行。PCR體系為（25.0μL）：10×PCR buffer 2.5 μL、25 mM MgCL22.0 μL、2.5mM dNTP 2.0μL、1.25U rTaq酶0.25μL、10 pM上、下游引物各1.0μL、cDNA模板2.0μL，補充滅菌去離子水至25.0μL；反應(yīng)條件為：94℃5min，94℃30s、57℃30s、72℃30s、40個循環(huán)后，72℃延伸10min。取PCR產(chǎn)物5.0μL用瓊脂糖凝膠(1.0%瓊脂糖、含熒光染料Glodview)電泳、凝膠成像系統(tǒng)觀察。

1.3 病毒的分離

病料處理上清液經(jīng)微孔濾膜（0.22um）除菌并加入雙抗，37℃作用30 min后尿囊腔接種10日齡鴨胚（0.2mL/枚）；接種鴨胚37℃孵育，每天照胚2次，連續(xù)觀察7d。收集24h后死亡鴨胚的尿囊液用于鴨胚的連續(xù)傳代至接種鴨胚規(guī)律性死亡，若沒有鴨胚死亡，則在接種后120h隨機收集3個鴨胚尿囊液用于連續(xù)傳代。規(guī)律死亡鴨胚尿囊液按1.2檢測鴨坦布蘇病毒，并按文獻[3～7]的方法檢測鴨甲肝病毒、禽流感病毒、副粘病毒、鴨瘟病毒、鴨星狀病毒。

1.4 病毒理化特性測定

用1.0%公雞紅細(xì)胞懸液按文獻[8]方法測定分離病毒感染鴨胚尿囊液的血凝性；同時，按文獻[8]的方法測定了病毒對有機溶劑氯仿、胰蛋白酶的敏感性。

1.5 坦布蘇病毒E基因克隆及序列分析

參照GenBank已發(fā)表的鴨坦布蘇病毒基因序列（登錄號JF270480），設(shè)計一對特異性引物Fe-1 (GTTGAGGGAGTGAATG)和Fe-2（TTCTTTCCTAGCCAAGT）用于擴增坦布蘇病毒的E基因。分離病毒的鴨胚尿囊液按試劑盒說明書提取病毒RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR的體系(25.0μL)如1.2。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳、切膠回收DNA并利用T載體克隆，上海生工測序。利用MAGE6.0生物學(xué)軟件的Neighbor-Joining構(gòu)建方法與BYD-1株(JF312912.1)、FS株(JN811558.1)等11株黃病毒E基因核苷酸序列進行比對分析。

1.6 對雛鴨的致病性及病理學(xué)觀察

2日齡四川麻鴨(重慶永健生物技術(shù)有限公司實驗動物基地提供)用于分離病毒的致病性測定。分離病毒第7代鴨胚尿囊液經(jīng)10倍遞進稀釋后腿部肌肉接種，0.2mL/只，每個稀釋度接種11只；每組動物隔離飼養(yǎng)，飼喂全價雛鴨飼料；連續(xù)觀察14d并記錄發(fā)病及死亡情況。瀕臨死亡動物解剖，觀察大體病變及采集肝、心、脾等用于組織病理學(xué)觀察和病毒檢測。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)病鴨大體病變及鴨坦布蘇病毒檢測

將5只送檢病鴨放血致死后解剖，心肌蒼白、質(zhì)地堅硬，脾臟腫大，卵泡變性壞死、卵性腹膜炎，肝臟腫大、質(zhì)脆，腦膜充血。利用鮮血營養(yǎng)瓊脂平板沒有從心血、腦、肝、脾和卵泡中分離出致病性細(xì)菌。以鴨坦布蘇病毒E基因設(shè)計的特異性引物（Fla-1和Fla-2）進行RT-PCR檢測，所有送檢鴨病料均檢出400 bp的單一DNA條帶（圖1）。

圖1 病料中鴨坦布蘇病毒RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳M：DL500 DNA Marker，1：空白對照，2～6：分別為5個檢測樣品

2.2 病毒的分離、鑒定

病料處理液接種10日齡鴨胚，接種后40h開始死亡，在120h內(nèi)死亡率76.9%（10/13）；將96h死亡胚的尿囊液10倍稀釋后接種，在60～96h鴨胚100% （10/10）死亡；此后死亡胚尿囊液連續(xù)傳代，都能60～108h內(nèi)100%（10/10）致死10日齡鴨胚。第7次接種鴨胚尿囊液（F7）對10日齡鴨胚的半數(shù)致死量為10-4.59/0.2mL，不凝集雞紅細(xì)胞，經(jīng)5%氯仿和1%胰蛋白酶處理后均不致死10日齡鴨胚，用RT-PCR或PCR檢測鴨甲肝病毒、禽流感病毒、副粘病毒、鴨瘟病毒、鴨星狀病毒均陰性，RT-PCR檢測鴨坦布蘇病毒為陽性。

2.3 坦布蘇病毒E基因的克隆與分析

圖2 E基因核苷酸序列進化樹分析

以第7次接種鴨胚尿囊液（F7）提取的病毒基因組為模板進行反轉(zhuǎn)錄、鴨坦布蘇病毒E基因特異性引物（Fe-1、Fe-2）進行PCR，其產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳、切膠回收DNA、克隆及測序，獲得1 506bp的核苷酸序列。在NCBI中，利用Blast軟件分析，該核苷酸序列與黃病毒屬的坦布蘇病毒GX2013G（GenBank: KM275941.1）E基因的同源性最高，相似性在99%以上；在氨基酸水平上與CQW1株（GenBank: AIU44176.1）的相似性最高，達99%以上。以核苷酸序列繪制進化樹（見圖2）。

2.4 SC2013株病毒對雛鴨的致病性

分離病毒鴨胚尿囊液（F7）、10倍稀釋及100稀釋后經(jīng)頸部皮下接種2日齡四川麻鴨，死亡率分別為100%、80%和60%；在接種后70h左右發(fā)病，死亡發(fā)生于120h左右。發(fā)病鴨排黃綠色稀糞、行動遲緩，后期出現(xiàn)癱瘓、頭頸抽搐等神經(jīng)癥狀。病死鴨腎臟出血及輸卵管尿酸鹽沉積、心臟泛白像水煮樣、脾臟腫大及壞死、腦膜呈樹枝樣出血；肝細(xì)胞顆粒變性及空泡變性，心肌纖維腫脹斷裂、嗜中性白細(xì)胞增多，脾臟淋巴細(xì)胞壞死，腸黏膜上皮細(xì)胞壞死、脫落。死亡鴨腦、肝、心和脾經(jīng)RT-PCR或PCR檢測為鴨坦布蘇病毒陽性，鴨瘟、鴨甲肝病毒、禽流感病毒副粘病毒和鴨星狀病毒陰性。

3 討論

本試驗從臨床疑似鴨坦布蘇病毒感染的產(chǎn)蛋鴨組織中分離出無血凝性、對氯仿和胰蛋白酶敏感的病毒，鴨坦布蘇病毒E基因特性引物進行RT-PCR檢測陽性，而鴨甲肝病毒、流感病毒、副粘病毒和鴨星狀病毒等檢測陰性，由此表明本試驗分離出的病毒SC2013株為鴨坦布蘇病毒。

自2010年以來，該病毒的感染給我國的蛋鴨養(yǎng)殖造成了巨大的經(jīng)濟損失。我們將分離的SC2013株病毒人工感染2日齡雛鴨，能引起發(fā)病死亡，并表現(xiàn)出典型的臨床癥狀和病例變化。因此，鴨坦布蘇病毒感染除能引起蛋鴨產(chǎn)蛋下降及死亡以外，在今后的工作中要關(guān)注幼齡鴨的感染。

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